王躍華,林抗雪,劉益麗,馬良良,江明殊

(成都大學(xué)生物產(chǎn)業(yè)學(xué)院,四川成都 610106)

0 引 言

我國(guó)是藥用植物資源極為豐富的國(guó)家之一,據(jù)調(diào)查,目前我國(guó)共有中藥資源12 807種,其中藥用植物11 146種,占87.03%[1].隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,人們對(duì)藥用植物資源的需求量與日俱增,藥用植物資源不僅局限于醫(yī)療用藥,而且還廣泛地應(yīng)用于美容、保健、飲食等其他方面.長(zhǎng)期以來(lái),大多數(shù)的藥用植物資源都靠野生采挖為主.由于許多藥用植物資源的過(guò)度開(kāi)采和使用,其產(chǎn)量已逐年萎縮,特別是一些名貴藥用植物,如紅景天、川貝母和冬蟲(chóng)夏草等,更是面臨著滅絕的危險(xiǎn).因此,對(duì)藥用植物種質(zhì)資源實(shí)施有效地保護(hù)已是一項(xiàng)十分緊迫的任務(wù).

1 藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存技術(shù)

1.1 藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存基本原理

通常將-80℃以下的溫度稱為超低溫.超低溫冷凍保存一般以液氮為冷源,使溫度維持在-196℃左右.從理論上分析,生物材料在此溫度下,其活細(xì)胞內(nèi)的新陳代謝和生長(zhǎng)活動(dòng)幾乎完全停止,處于“生機(jī)停頓”狀態(tài),從而能夠有效保持生物材料的遺傳穩(wěn)定性,同時(shí)又可保持生物材料的形態(tài)發(fā)生潛能,這是一種不需要靠繼代而可長(zhǎng)期保存植物種質(zhì)的有效方法.

1.1.1 細(xì)胞凍害理論.

植物組織結(jié)冰分為胞外結(jié)冰和胞內(nèi)結(jié)冰兩種.胞外結(jié)冰是指在溫度降低時(shí),細(xì)胞間隙和細(xì)胞壁附近的水分結(jié)成冰,隨著細(xì)胞間隙的蒸汽壓降低,其周圍細(xì)胞內(nèi)的水分便向胞間隙方向移動(dòng),擴(kuò)大了冰晶的體積.胞內(nèi)結(jié)冰是指溫度迅速下降,除了胞外結(jié)冰外,細(xì)胞內(nèi)的水分也凍結(jié).

細(xì)胞凍害是指在細(xì)胞內(nèi)外形成的冰晶對(duì)細(xì)胞造成的傷害.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,細(xì)胞產(chǎn)生胞外結(jié)冰后會(huì)引起原生質(zhì)過(guò)度脫水,造成冰晶體對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷以及蛋白質(zhì)變性等傷害.在冷凍降溫過(guò)程中,許多植物細(xì)胞對(duì)低溫下細(xì)胞外結(jié)冰具有一定的耐受力.但是如果植物細(xì)胞內(nèi)的水結(jié)冰,冰晶在形成和融化時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生直接的機(jī)械破壞作用,使得細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性遭到嚴(yán)重的破壞而無(wú)法進(jìn)行正常的生理功能,從而帶來(lái)致命損傷.

1.1.2 溶液玻璃化理論.

1.2 藥用植物種質(zhì)資源超低溫保存基本程序

1.2.1 材料的選擇.

研究表明,植物的基因型、抗凍性以及組織和細(xì)胞的年齡、選擇材料的大小等因素都對(duì)超低溫保存效果產(chǎn)生較大的影響,其中植物細(xì)胞的生長(zhǎng)年齡是決定凍存后細(xì)胞存活率的最重要因素之一[3].這是因?yàn)樘幱诓煌L(zhǎng)階段的植物材料具有不同的生理狀態(tài),處于快速生長(zhǎng)期的材料凍后存活率較高.目前,常用的超低溫保存材料主要有莖尖分生組織、愈傷組織、植物器官3大類.

(1)莖尖分生組織細(xì)胞具有分化程度低的特點(diǎn),在植物保存后的再生過(guò)程中,比其他細(xì)胞培養(yǎng)物的遺傳穩(wěn)定性好,所以莖尖分生組織是超低溫保存的一種理想材料[5].目前,已成功實(shí)現(xiàn)莖尖超低溫保存的藥用植物有高山紅景天、地黃、百合等[6-8].劉劍鋒等[6]采用包埋—玻璃化法對(duì)高山紅景天莖尖進(jìn)行保存,保存后材料最高成活率接近100%,再生植株生長(zhǎng)和分化正常.薛建平等[7]采用玻璃化法保存地黃莖尖,其存活率在76.42%以上.陳輝等[8]通過(guò)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)初步建立了切花百合種質(zhì)玻璃化法超低溫保存的技術(shù)方案,百合無(wú)菌苗莖尖保存后進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng),存活率可達(dá)到50%以上.

(2)愈傷組織是植物組織培養(yǎng)中最為常見(jiàn)的組織培養(yǎng)物,具有生長(zhǎng)速度快,可分化成為各種組織和器官的潛力等特點(diǎn).但由于愈傷組織在長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)伴隨發(fā)生染色體的自發(fā)畸變,因此對(duì)藥用植物愈傷組織的保存顯得尤為重要.目前,已成功實(shí)現(xiàn)愈傷組織超低溫保存的藥用植物有浙貝母、高山紅景天、銀杏和紅豆杉等[9-13].蘇新等[9]研究發(fā)現(xiàn),超低溫保存浙貝母愈傷組織中,經(jīng)慢速冷凍后的愈傷組織存活率可達(dá)78.2%,且成功實(shí)現(xiàn)增殖及植株再生.劉劍鋒等[10]研究表明,采用玻璃化法保存高山紅景天愈傷組織后存活率可達(dá)到78.24%,解凍后可誘導(dǎo)成苗.徐剛標(biāo)等[11]對(duì)銀杏子葉愈傷組織進(jìn)行了超低溫保存研究,采用分步冷凍法進(jìn)行超低溫保存后其細(xì)胞相對(duì)存活率可達(dá)60%以上,恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞能恢復(fù)生長(zhǎng).

(3)花粉是重要的植物種質(zhì)形式之一,具有豐富的遺傳多樣性,是種質(zhì)保存以及雜交育種的重要材料[14].花粉的保存方式一般采用超低溫保存,其是將花粉進(jìn)行預(yù)處理和適當(dāng)脫水后直接投入液氮中.目前,已見(jiàn)報(bào)道的實(shí)現(xiàn)花粉超低溫保存的藥用植物有人參、浙貝母、杜仲、山茱萸和高山紅景天等[14-16].蘇新[15]用分步冷凍法保存浙貝母花粉發(fā)現(xiàn),經(jīng)低溫保存后的花粉授粉后能有效結(jié)實(shí).劉劍鋒等[16]研究發(fā)現(xiàn)高山紅景天花粉的超低溫保存過(guò)程中,逐步預(yù)凍法與逐步解凍法均能大幅度提升超低溫保存后花粉的萌發(fā)力.

1.2.2 材料的預(yù)處理.

為了使保存材料達(dá)到超低溫保存所要求的低含水量等生理特性,必須對(duì)材料進(jìn)行預(yù)處理,其目的是為了提高處于分裂期細(xì)胞的數(shù)目,減少細(xì)胞內(nèi)自由水含量,增強(qiáng)細(xì)胞抗寒力.目前,材料預(yù)處理采用的具體方法有低溫鍛煉、繼代培養(yǎng)和預(yù)培養(yǎng)3種.

Connections of summer anomalous precipitation in Guangdong and Guangxi regions with SST anomalies east of

(1)低溫鍛煉法通常是將需要保存的材料放在0℃左右溫度下處理數(shù)天至數(shù)星期,也可分不同溫度組進(jìn)行變溫處理,以提高細(xì)胞膜磷脂的不飽和程度而增加抗低溫的能力,還可使細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性脫水和產(chǎn)生抗凍蛋白[17].

(2)繼代培養(yǎng)法是將處于快速生長(zhǎng)期的材料進(jìn)行多次轉(zhuǎn)接繼代,此預(yù)處理方法可大大增加有絲分裂細(xì)胞的數(shù)目.研究表明,處于有絲分裂前后的細(xì)胞抗凍能力較強(qiáng),其繼代培養(yǎng)后的材料也具有較高的抗凍能力,其凍后存活率也隨之提高[18].

(3)預(yù)培養(yǎng)法是在培養(yǎng)基中加入冷凍保護(hù)劑如山梨醇、二甲基亞砜等,或誘導(dǎo)產(chǎn)生抗寒力的物質(zhì)如脫落酸、海藻糖等,當(dāng)培養(yǎng)基中的冷凍保護(hù)劑進(jìn)入細(xì)胞組織后可使細(xì)胞內(nèi)外形成滲透壓,細(xì)胞可緩和的脫去部分水,而脫落酸、海藻糖等物質(zhì)可誘導(dǎo)細(xì)胞分泌抗寒物質(zhì).目前,該方法常與低溫鍛煉結(jié)合,已在多種植物中獲得成功.

1.2.3 冷凍保護(hù)劑選擇與冷凍處理方法.

(1)在藥用植物種質(zhì)資源的超低溫保存過(guò)程中,不管采用何種冷凍方法,冷凍保護(hù)劑都是不可缺少的.理想的冷凍保護(hù)劑應(yīng)能在超低溫保存過(guò)程中保護(hù)組織免受冰凍傷害,且適當(dāng)濃度下對(duì)細(xì)胞無(wú)毒或低毒,解凍后容易從組織中清除.目前廣泛使用的冷凍保護(hù)劑分為滲透性和非滲透性兩種.滲透性冷凍保護(hù)劑包括二甲基亞砜、甘油、乙二醇等,此類保護(hù)劑多數(shù)為低分子中性物質(zhì),在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用,使溶液的粘性增加,弱化了水的結(jié)晶過(guò)程,從而起到了保護(hù)效果;非滲透性保護(hù)劑包括蔗糖、山梨醇、聚乙二醇等,這類物質(zhì)能溶于水,但不能進(jìn)入細(xì)胞,它能使細(xì)胞間溶液呈過(guò)冷狀態(tài),阻止胞外結(jié)冰從而起到保護(hù)作用.孫成龍等[19]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)合保護(hù)劑優(yōu)于單一保護(hù)劑,其優(yōu)越性在于它能充分發(fā)揮各種成分的保護(hù)作用,從而產(chǎn)生累加效應(yīng).所以在冷凍保護(hù)的實(shí)際過(guò)程中,人們常使用由兩種或兩種以上的保護(hù)劑組成的復(fù)合保護(hù)劑.

目前,復(fù)合保護(hù)劑為可分為滲透性與滲透性結(jié)合型、滲透性與非滲透性結(jié)合型和非滲透性與非滲透性結(jié)合型3大類型.

(2)冷凍處理是超低溫保存過(guò)程中非常關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié),在冷凍處理過(guò)程中,隨著溫度的降低細(xì)胞內(nèi)有形成冰晶的危險(xiǎn),因此其降溫速度應(yīng)該是以不引起胞內(nèi)凍結(jié)或形成冰晶為準(zhǔn).目前所采用的冷凍方法可分為基于快速降溫的冷凍法、基于保護(hù)性脫水的冷凍法和基于玻璃化理論的冷凍法等.

快速降溫的冷凍方法是以快速降溫時(shí)溶液缺乏形成晶核的時(shí)間從而避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰為理論基礎(chǔ).快速降溫法的具體步驟是將植物材料從0℃或預(yù)處理溫度直接投入液氮中,使溫度瞬時(shí)降到-196℃,在此過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)的水分子未來(lái)得及形成結(jié)晶中心從而避免了細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的危險(xiǎn).此方法簡(jiǎn)單,不需復(fù)雜、昂貴的設(shè)備,但由于快速冷凍法沒(méi)有采用保護(hù)性脫水環(huán)節(jié),因此該方法適用于含水量低或可高度脫水的植物材料,如種子、花粉等[9].

基于保護(hù)性脫水的冷凍方法,包括慢速冷凍法、分步冷凍法和逐級(jí)降溫法.慢速冷凍法的步驟為,材料以0.5℃/min～2℃/min的降溫速度,使溫度從0℃降到-100℃左右,再立即投入液氮中保存;分步冷凍法的步驟為,材料以0.5℃/min～4℃/min的降溫速度,降到-40℃左右,停留一段時(shí)間再立即投入液氮;逐級(jí)冷凍法的步驟為,將植物材料經(jīng)過(guò)冰凍保護(hù)劑0℃預(yù)處理后,再逐級(jí)通過(guò)-10℃、-15℃、-23℃、-35℃、-40℃等,每級(jí)溫度停留10 min左右,然后投入液氮中[20].植物材料在逐步降溫的過(guò)程中,可使細(xì)胞內(nèi)水分充分脫出,從而有效地避免了植物材料在冷凍保存過(guò)程中產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰,以達(dá)到良好的保存效果,此3種冷凍方法都適用于液泡化程度較高的植物材料.

玻璃化冷凍方法是根據(jù)玻璃化理論建立的一種簡(jiǎn)單而高效的冷凍方法.該方法在快速降溫的同時(shí)采用高濃度復(fù)合保護(hù)劑,通過(guò)玻璃化溶液弱化水結(jié)晶以及使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)從而使組織或細(xì)胞在-196℃形成無(wú)定形玻璃化狀態(tài),而沒(méi)有冰晶的形成,減少了對(duì)細(xì)胞的損傷,提高了植物材料的存活率.玻璃化冷凍法主要步驟有裝載、保護(hù)劑(即玻璃化溶液)處理和冷凍幾個(gè)環(huán)節(jié),其中裝載時(shí)間和玻璃化溶液處理時(shí)間對(duì)凍后材料存活率的影響很大,因此玻璃化法保存材料的關(guān)鍵在于裝載時(shí)間和玻璃化溶液處理時(shí)間的掌握[21].

1.2.4 解凍洗滌及凍后材料細(xì)胞相對(duì)存活率測(cè)定.

為了防止凍后植物材料次生結(jié)冰,一般采用快速解凍的方法,即將液氮保存后的材料在25℃～40℃的水浴中解凍.同時(shí),凍存后植物材料的洗滌也很重要,洗滌的主要目的是除去高濃度的冷凍保護(hù)劑和防止細(xì)胞因過(guò)度吸水而脹破.

凍后植物材料細(xì)胞相對(duì)存活率的測(cè)定目前廣泛采用TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)染色法[22]. TTC是標(biāo)準(zhǔn)氧化還原色素,氧化狀態(tài)無(wú)色被還原后變成紅色.TTC染色法是通過(guò)測(cè)定呼吸鏈脫氫酶活性來(lái)表征細(xì)胞代謝活力的一種有效方法,其原理是TTC在細(xì)胞呼吸過(guò)程中替代氧接受 H+(H+/e), TTC被還原為TTF而呈現(xiàn)紅色,TTF經(jīng)有機(jī)溶劑萃取后,在一定波長(zhǎng)下測(cè)吸光值,其吸收值大小能反映細(xì)胞膜電子傳遞鏈的遞氫能力大小.有機(jī)物氧化分解生成的氫通過(guò)呼吸鏈與受氫體氧結(jié)合而產(chǎn)生能量是細(xì)胞能量代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié),傳遞給氧的氫越多,說(shuō)明脫氫酶活性越高.由于脫氫酶只有活細(xì)胞體才能產(chǎn)生,因此,常用脫氫酶活性表達(dá)細(xì)胞體的活性. TTC染色法通過(guò)間接測(cè)定脫氫酶的活性,脫氫酶的活性可反映細(xì)胞呼吸強(qiáng)度的大小,而細(xì)胞呼吸強(qiáng)度可在一定程度上表征細(xì)胞活力.

TTC染色是一個(gè)酶促反應(yīng),所涉及的因素較多如緩沖液的濃度和pH值、TTC的濃度、處理的時(shí)間和溫度等,而且在TTF的提取過(guò)程中往往會(huì)有所損失,造成結(jié)果不夠準(zhǔn)確.此外,脫氫酶的活性并不能完全表征細(xì)胞的活力,因此,凍后材料細(xì)胞相對(duì)存活率的測(cè)定方法仍有待提高.

1.2.5 凍后材料遺傳穩(wěn)定性的檢測(cè).

植物種質(zhì)資源保存的最根本目的是保持其遺傳基因的穩(wěn)定性,控制遺傳性狀不發(fā)生變化.因此,超低溫凍存后材料的遺傳特性的檢測(cè)是十分必要的.目前,凍存后植物材料的遺傳特性的檢測(cè)主要從形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征觀察、同工酶分析以及RAPD和AFLP分析等方面對(duì)超低溫保存的植物材料的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè).Liu Y等[23]對(duì)超低溫保存后蘋果莖尖的遺傳穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)其與正常蘋果莖尖在形態(tài)學(xué)、可溶性蛋白和POD酶、DNA水平上均無(wú)差異.

2 結(jié) 語(yǔ)

超低溫保存技術(shù)是一項(xiàng)可長(zhǎng)期保存藥用植物種質(zhì)資源的有效方法,具有長(zhǎng)期性和穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn),并避免了田間藥用植物種質(zhì)資源保存需要花費(fèi)巨大的人力、物力、財(cái)力的缺點(diǎn).據(jù)統(tǒng)計(jì),采用此技術(shù)保存的藥用植物材料,可在其后的幾十年里根據(jù)人們的需要將其取出并用于生產(chǎn)研究,從而有效地保護(hù)了瀕危野生藥用植物的種質(zhì)資源.

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