哺乳動(dòng)物核移植研究進(jìn)展

寧方勇，王 星，杜智恒，楊春山，白秀娟

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118003）

哺乳動(dòng)物核移植研究進(jìn)展

寧方勇1，王 星2，杜智恒1，楊春山1，白秀娟1

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.遼東學(xué)院農(nóng)學(xué)院，遼寧 丹東 118003）

哺乳動(dòng)物核移植（Nuclear Transplantation，NT）是目前生物技術(shù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一，其科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值重大。本文根據(jù)近年來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究進(jìn)展，對(duì)核移植技術(shù)步驟、核移植研究概況及目前核移植研究中存在的問(wèn)題作一綜述，希望能夠?qū)氖潞艘浦惭芯康耐杏兴鶐椭?/p>

哺乳動(dòng)物；核移植；研究進(jìn)展

哺乳動(dòng)物核移植就是人們通常所說(shuō)的動(dòng)物克隆，是指通過(guò)顯微操作的方法，從早期胚胎分離一個(gè)卵裂球或分離一個(gè)培養(yǎng)的體細(xì)胞，通過(guò)顯微操作儀將其注入到去核卵母細(xì)胞的胞質(zhì)或透明帶下，重新組建一個(gè)新的胚胎。這個(gè)胚胎稱為重組胚或克隆胚?？寺∨弑患せ詈螅w細(xì)胞DNA可以像正常受精卵一樣，經(jīng)細(xì)胞分裂，分化并在母體內(nèi)發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體[1]。新個(gè)體具有與供體完全相同的基因型，即新個(gè)體具有與供體完全相同的遺傳物質(zhì)。因此，核移植技術(shù)在動(dòng)物育種、制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因治療和器官移植等方面具有重大作用[2]。哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)可以根據(jù)供核細(xì)胞的不同分為胚細(xì)胞核移植和體細(xì)胞核移植兩類。

1 哺乳動(dòng)物核移植的主要步驟

哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)包括一系列復(fù)雜程序：供體細(xì)胞的選擇與體外培養(yǎng)、卵母細(xì)胞的體外成熟及激活、去核、細(xì)胞核移植、融合-激活、重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)和胚胎移植。

1.1 供體細(xì)胞的選擇與體外培養(yǎng)

用于核移植的細(xì)胞有多種，最早采用早期胚胎的卵裂球，在1997年Wilmut等報(bào)道“多莉”羊之前主要是以此類細(xì)胞作為供核。這些細(xì)胞具有全能性或多能性，相對(duì)來(lái)說(shuō)核移植的成功率高[3]。目前用于核供體的主要有卵丘細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞、精子細(xì)胞、腦細(xì)胞、胎兒或成體成纖維細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）等[4]。供體與受體細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)育同步化是影響核移植成敗的一個(gè)重要因素，早期的研究認(rèn)為供體細(xì)胞處于G0期[5]是體細(xì)胞核移植成功所必需的，并指出可通過(guò)選擇細(xì)胞類型或人工誘導(dǎo)兩種方法來(lái)獲得G0期細(xì)胞。然而近來(lái)發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)休眠誘導(dǎo)的G1或G2甚至M期供體細(xì)胞的核移植也均獲得了成功[6]。與此同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)在小鼠的核移植中供體細(xì)胞的類型和基因型對(duì)移植效率也有較大影響[7]。

從目前的研究來(lái)看，似乎應(yīng)用處于各個(gè)細(xì)胞時(shí)相的細(xì)胞都能得到克隆動(dòng)物，但還沒(méi)有一種伴隨核移植動(dòng)物出生的細(xì)胞周期專一性標(biāo)記物來(lái)證明核移植所得后代來(lái)源于某一個(gè)特定細(xì)胞時(shí)相[8]。因此深入研究供體細(xì)胞類型、細(xì)胞周期、同步化處理方式以及細(xì)胞的倍增時(shí)間等在核移植胚胎發(fā)育過(guò)程中所起的作用顯得異常重要。

1.2 卵母細(xì)胞的體外成熟及激活

1.2.1 卵母細(xì)胞的體外成熟

體細(xì)胞核移植中體細(xì)胞必須在去核的卵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行重編程，以恢復(fù)其全能性，而卵母細(xì)胞的成熟程度則會(huì)直接影響體細(xì)胞的重編程過(guò)程。所以卵母細(xì)胞的體外成熟，作為體細(xì)胞核移植過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)而為人們所關(guān)注。

目前關(guān)于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞的體外成熟還存在很多的問(wèn)題，有人提出將卵母細(xì)胞的成熟分為3個(gè)方面：核的成熟、胞質(zhì)的成熟、分子的成熟。目前對(duì)卵母細(xì)胞的成熟的判斷只是通過(guò)形態(tài)學(xué)上的觀察，或者通過(guò)對(duì)囊胚率、受孕率及產(chǎn)仔率來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證性地判斷，而要從根本上解決卵母細(xì)胞的體外成熟問(wèn)題，還要加強(qiáng)對(duì)于卵母細(xì)胞成熟機(jī)制方面的研究[9]。

1.2.2 卵母細(xì)胞的激活

自然狀況下或體外受精時(shí)，精子的進(jìn)入會(huì)啟動(dòng)停滯于MⅡ期的卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育，這一過(guò)程稱為卵母細(xì)胞的激活。以成熟卵母細(xì)胞為受體的核移植中，由于缺乏諸如受精等自然的過(guò)程，故必須對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行人工激活以促使其進(jìn)一步發(fā)育。一些物理或化學(xué)因素也可以使卵母細(xì)胞活化。目前應(yīng)用較多的激活方法有電激活、乙醇、離子霉素、氯化鍶、三磷酯酰、精子提取物激活等。

1.3 去核

在細(xì)胞核移植研究中，去核這一步非常關(guān)鍵。采用的去核方法主要有半卵去核法、功能性去核法、離心去核法、化學(xué)去核法、擠壓去核法、點(diǎn)壓去核法和蔗糖輔助去核法等，但目前使用較多的仍然是盲吸收去核法和活性熒光染色去核法。

1.4 細(xì)胞核移植

供體核的移植主要有融合和注射兩種方法，融合包括化學(xué)融合、仙臺(tái)病毒融合與電融合，目前采用較多的是電融合。注射包括微細(xì)玻璃針和piezoelectric顯微注射兩種，均有成功的例子。

1.5 融合-激活

目前采用的融合-激活方案有3種：（1）融合前激活，即在卵母細(xì)胞與供核體細(xì)胞融合前激活卵母細(xì)胞；（2）融合時(shí)激活，即在將供受體融合的同時(shí)激活卵；（3）融合后激活，即在供受體融合后數(shù)小時(shí)再激活，可延長(zhǎng)核在受體胞質(zhì)內(nèi)的時(shí)間，使重編程更徹底[10]。

1.6 重構(gòu)胚的體外培養(yǎng)和胚胎移植

重構(gòu)胚需一定時(shí)間的培養(yǎng)，方可移植到受體。家兔和豬重構(gòu)胚在體外培養(yǎng)24 h以內(nèi)，就可通過(guò)非手術(shù)移植，而羊和牛重構(gòu)胚所需培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一般發(fā)育到囊胚或桑椹胚時(shí)移植。培養(yǎng)的方法是可將電融合的重構(gòu)胚放入10%FCS的RD微滴內(nèi)培養(yǎng)，也可將顯微操作的胚胎移入同種或異種的輸卵管中進(jìn)行培養(yǎng)幾天后沖洗輸卵管，回收重構(gòu)胚[11]。核移植重構(gòu)胚成功發(fā)育取決于一系列的因素，如卵子的質(zhì)量、重構(gòu)的程序、培養(yǎng)的條件、受體和供體細(xì)胞的細(xì)胞周期階段等。前面幾個(gè)因素都是實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的問(wèn)題，受體和供體細(xì)胞的細(xì)胞周期階段則是涉及到核質(zhì)相互關(guān)系問(wèn)題，這是取決于重構(gòu)胚成功發(fā)育最關(guān)鍵的因素之一。

在體外進(jìn)行重構(gòu)胚的培養(yǎng)時(shí)選擇適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液非常重要。重構(gòu)胚的移植與胚胎移植的方法基本一樣，即根據(jù)受體動(dòng)物的不同可分為手術(shù)移植和非手術(shù)移植。

2 哺乳動(dòng)物核移植的研究現(xiàn)狀

1997年，世界上第1只成年綿羊乳腺上皮細(xì)胞核移植后代Dolly的誕生，標(biāo)志著核移植技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)嶄新的發(fā)展階段。這一成就具有劃時(shí)代的意義，而且進(jìn)一步證實(shí)了基因活性學(xué)說(shuō)的正確性，證明高度分化的體細(xì)胞仍然具有基因組的等同性，其細(xì)胞核仍然具有支持哺乳動(dòng)物全程發(fā)育的全能性。

2.1 哺乳動(dòng)物核移植細(xì)胞類型

核移植所用細(xì)胞包括動(dòng)物干細(xì)胞、胎兒體細(xì)胞和成年體細(xì)胞等，由于建立大動(dòng)物和人的干細(xì)胞系比較困難，因此目前的核移植研究多用后兩種細(xì)胞。此后，以不同動(dòng)物不同組織來(lái)源的體細(xì)胞進(jìn)行核移植均得到了后代，這些細(xì)胞包括顆粒/卵丘細(xì)胞、鼠尾尖細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、輸卵管和子宮上皮細(xì)胞、轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染的牛生殖嵴細(xì)胞、牛肌肉細(xì)胞、牛初乳乳腺上皮細(xì)胞、肺組織細(xì)胞、兔成纖維細(xì)胞等。

2.2 哺乳動(dòng)物的核移植研究

自從1997年Willmut等利用成年綿羊乳腺細(xì)胞作為供核細(xì)胞，獲得體細(xì)胞克隆羊Dolly后，哺乳動(dòng)物的核移植研究在全世界范圍內(nèi)廣泛開展，并陸續(xù)獲得了多種動(dòng)物的克隆后代。1998年，Wakayama等得到克隆的再克隆小鼠。1999年，Baguisi等獲得克隆山羊。2000年，Polejaeva等和Onishi等獲得克隆豬。2002年，Chesne等獲得克隆兔。2002年，Shin等獲得克隆貓。2003年，Galli等獲得克隆馬。2003年，Zhou等獲得克隆大鼠。

2.3 哺乳動(dòng)物的異種核移植研究

1992年Wolf等人進(jìn)行了將牛胚胎細(xì)胞核移入水牛、山羊、綿羊和倉(cāng)鼠去核卵母細(xì)胞中的實(shí)驗(yàn)。1993年，梅祺等進(jìn)行小鼠與兔的胚胎細(xì)胞核移植。1998年，Wells成功利用普通牛卵母細(xì)胞和1頭珍稀印度野牛體細(xì)胞獲得成活的異種克隆后代。2001年，美國(guó)ACT公司獲得了1頭野牛與家牛的異種克隆后代，這頭野牛是世界上第1頭采用異種克隆技術(shù)克隆的哺乳動(dòng)物，雖然該野牛在出生后2天死亡，但是證明了哺乳動(dòng)物體細(xì)胞可以在異種動(dòng)物卵母細(xì)胞內(nèi)完成核發(fā)育程序重編、去分化完成整個(gè)發(fā)育過(guò)程。同年Loi P等用歐洲盤羊的顆粒細(xì)胞為供體，移植到去核的綿羊的卵母細(xì)胞為胞質(zhì)受體構(gòu)建異種克隆胚，移植給代孕的母羊生產(chǎn)出1只具有明顯歐洲盤羊外貌特征的后代。2002年中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所將處于2～4細(xì)胞期的大熊貓-兔異種克隆胚胎和貓-兔克隆胚胎一起移植到處理過(guò)的家貓輸卵管內(nèi)，得到的克隆胎兒中有兩個(gè)來(lái)源于大熊貓異種重構(gòu)胚。2003年馮秀亮等證明豬成熟MⅡ期卵母細(xì)胞可以對(duì)人體細(xì)胞核進(jìn)行重新編程，并可支持其發(fā)育到囊胚階段。2004年SansinenaMJ等將爪哇野牛-牛異種克隆胚胎體外培養(yǎng)囊胚期移植給代孕的母牛體內(nèi)，其中1只妊娠維持到30～60 d，1只在60～90 d妊娠終止。2005年彭濤等發(fā)現(xiàn)盤羊-綿羊異種克隆胚胎和北山羊-山羊異種克隆胚胎移植入代孕母羊子宮內(nèi)能夠著床發(fā)育。2006年報(bào)道我國(guó)在人-山羊種間核移植試驗(yàn)中沒(méi)有獲得囊胚，但是山羊的卵母細(xì)胞可以支持人體細(xì)胞完成重編程，重構(gòu)胚在體外可以完成早期發(fā)育[12]。

應(yīng)用核移植技術(shù)獲得的動(dòng)物大多是亞種間的核移植，但是已經(jīng)可以證明異種動(dòng)物間的核移植技術(shù)的可行性。

3 哺乳動(dòng)物核移植存在的問(wèn)題

哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)雖然在生物醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)以及其他領(lǐng)域的應(yīng)用取得了一定進(jìn)展，但目前核移植技術(shù)還不夠完善。存活率和異常發(fā)育是當(dāng)今核移植技術(shù)的最大缺陷，同體外受精相比，效率低是目前核移植技術(shù)應(yīng)用發(fā)展中普遍存在的現(xiàn)象。需要在理論和實(shí)踐上得到進(jìn)一步提高。主要表現(xiàn)在囊胚發(fā)育率不穩(wěn)定、移植后受胎率低、出現(xiàn)畸胎、死胎、流產(chǎn)以及出生后早亡率高。對(duì)造成效率低的原因意見(jiàn)不一，有人認(rèn)為是培養(yǎng)條件未達(dá)到最佳化，也有人認(rèn)為是細(xì)胞的問(wèn)題。如細(xì)胞遺傳物質(zhì)受到損傷，細(xì)胞沒(méi)有完成發(fā)育程序重排或者由于遺傳印跡造成關(guān)鍵基因沒(méi)有充分表達(dá)等。即使是出生的個(gè)體也經(jīng)常出現(xiàn)一些異常，如胎盤過(guò)大、胎兒過(guò)大及呼吸系統(tǒng)疾病等。導(dǎo)致這些現(xiàn)象的原因很多，如卵母細(xì)胞質(zhì)量、供核細(xì)胞的種類、核質(zhì)互作關(guān)系、供核重新編程、操作水平、培養(yǎng)條件和外界環(huán)境等。

盡管目前來(lái)看，哺乳動(dòng)物核移植仍然面臨很多問(wèn)題，哺乳動(dòng)物核移植技術(shù)自身仍在不斷完善中。但相信隨著分子遺傳學(xué)、細(xì)胞學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等相關(guān)基礎(chǔ)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展，哺乳動(dòng)物核移植將在未來(lái)的生物學(xué)及人體器官移植等方面扮演重要角色。

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S814.8

B

1005-2739（2010）01-0009-03

2009-09-21

寧方勇（1977-），男，講師，碩士。

白秀娟，女，教授。