農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理與應(yīng)用研究進(jìn)展

張紅霞，鄧啟云，吳 俊

（1.中南大學(xué)隆平學(xué)院 湖南 長(zhǎng)沙 410125;2.湖南雜交水稻研究中心 湖南 長(zhǎng)沙 410125）

轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是利用DNA重組技術(shù)，將克隆到的外源優(yōu)良DNA導(dǎo)入到植物體細(xì)胞基因組中，改變作物的遺傳性狀，使其朝著人們理想的方向發(fā)展。從1983年第一例轉(zhuǎn)基因植物——煙草問(wèn)世以來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅猛，至2005年轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)在21個(gè)國(guó)家進(jìn)行種植。2009年，全球種植轉(zhuǎn)基因作物達(dá)1.34億hm2。轉(zhuǎn)基因技術(shù)方法主要有基因槍法、電激法、PEG法、花粉管介導(dǎo)法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法具有轉(zhuǎn)化的外源基因結(jié)構(gòu)完整、整合位點(diǎn)較穩(wěn)定、轉(zhuǎn)基因低拷貝、基因沉默幾率低、遺傳穩(wěn)定以及能夠轉(zhuǎn)化大片段的DNA（可達(dá)50 kb）等突出優(yōu)點(diǎn)[1－2]，成為目前應(yīng)用最多的轉(zhuǎn)基因技術(shù)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外廣泛開(kāi)展了水稻轉(zhuǎn)基因研究工作，已經(jīng)有多個(gè)有益農(nóng)藝性狀基因?qū)氲剿静牧现校⑶耀@得了大量的轉(zhuǎn)化植株。本文就水稻農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的原理、研究進(jìn)展及轉(zhuǎn)化基本因素進(jìn)行綜述。

1 水稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)基因原理

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是一種天然的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。農(nóng)桿菌分為根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。根瘤農(nóng)桿菌中含有腫瘤誘導(dǎo)（Ti）質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒上含有可轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA)區(qū)、毒性區(qū)（Vir區(qū)）以及冠癭堿代謝基因編碼區(qū)。T-DNA兩端是兩個(gè)25 bp的重復(fù)序列，分別稱(chēng)為左邊界和右邊界，兩個(gè)邊界序列之間是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素合成基因以及冠癭堿合成基因。Vir區(qū)中也含有多個(gè)基因段，如VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH等，每個(gè)基因段都含有多個(gè)基因。當(dāng)植物受到傷害時(shí)，分泌含有酚類(lèi)化合物的汁液，這些酚類(lèi)化合物一方面通過(guò)染色體毒性基因（chvA、chvB）等介導(dǎo)的趨化性促使農(nóng)桿菌向植物受傷部位移動(dòng)并附著于植物細(xì)胞表面；另一方面則被Ti質(zhì)粒上由VirA和VirG組成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)識(shí)別，從而誘導(dǎo)其他Vir的表達(dá)。VirD1和VirD2共同作用，由T-DNA右邊界開(kāi)始向左邊界切割產(chǎn)生一條T-DNA單鏈，并與Vir其它表達(dá)蛋白結(jié)合成復(fù)合體轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌外，然后進(jìn)入細(xì)胞到達(dá)細(xì)胞核內(nèi)并整合到細(xì)胞染色體上。

T-DNA的轉(zhuǎn)移只與兩個(gè)邊界序列有關(guān)，尤其右邊界對(duì)T-DNA的準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移是不可缺少的，而邊界序列之間含有什么基因并不影響T-DNA的轉(zhuǎn)移。因此，可以用外源基因代替T-DNA區(qū)內(nèi)的基因，進(jìn)而利用農(nóng)桿菌將這個(gè)改造后的T-DNA轉(zhuǎn)移到植物基因組中，這樣就可以獲得所希望得到的轉(zhuǎn)基因植株。隨著對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的了解不斷深入，人們對(duì)Ti質(zhì)粒進(jìn)行了多種方式的改造，使載體系統(tǒng)不斷更新，轉(zhuǎn)化效率逐漸成熟，應(yīng)用范圍越來(lái)越廣泛。

2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展概況

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究最早始于1986年，Babat[3]等通過(guò)PEG法將農(nóng)桿菌原生質(zhì)球與水稻原生質(zhì)體融合，獲得了部分能夠合成胭脂堿的水稻愈傷組織。1992年Chan[4]以成熟胚、離體根為起始材料進(jìn)行研究，但未能獲得轉(zhuǎn)基因再生植株。l993～1994年，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究取得了重大突破，Chan等[5]首次通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，隨后，Hiei等[6]實(shí)現(xiàn)了對(duì)粳稻的高頻轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率達(dá)到28.6%，表明粳稻的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系已基本建立起來(lái)，該研究同時(shí)也證明水稻盾片是良好的外植體來(lái)源，且農(nóng)桿菌攜帶的雙元載體能夠明顯提高粳稻比如越光稻的轉(zhuǎn)化頻率。此后的十幾年，農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化研究得到了迅速發(fā)展。Rashid等[7]將農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法應(yīng)用于優(yōu)質(zhì)秈稻Basmati370水稻取得成功，且發(fā)現(xiàn)乙酰酊香酮在共培養(yǎng)階段是必不可少的。Dong等[8]報(bào)道農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化在爪哇稻Gulfmont和Jefferson上取得成功；Hoque等[9]于2005年建立了適合于孟加拉秈稻種質(zhì)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系，并證明水稻幼胚作為外植體較成熟胚有更高的轉(zhuǎn)化率，共培養(yǎng)時(shí)間為3 d最優(yōu)；Hiei和Komari[10]2006年建立了一套適合秈稻I群體的高效轉(zhuǎn)化體系，證實(shí)轉(zhuǎn)化效率與凝膠劑的種類(lèi)和共培養(yǎng)基成分密切相關(guān)。林擁軍等[11]建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的粳稻品種牡丹江8號(hào)的高效轉(zhuǎn)基因體系。王逸群等[12]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將高賴(lài)氨酸蛋白基因?qū)氲焦榷拑捎盟局?，GUS組織化學(xué)染色、PCR擴(kuò)增、Southern雜交等分析都表明，該基因已經(jīng)整合到水稻基因組中；他們對(duì)9株轉(zhuǎn)基因水稻葉片賴(lài)氨酸含量進(jìn)行測(cè)量，發(fā)現(xiàn)大部分植株的賴(lài)氨酸含量都有明顯的提高，最高幅度達(dá)到了22.71%。胡昌泉和蘇軍等[13]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將胚乳特異性表達(dá)谷蛋白1（Glutelin1，Gtl）基因控制下的可溶性淀粉合成酶基因sss導(dǎo)入秈稻恢復(fù)系明恢86，共獲得53個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)化再生植株。PCR檢測(cè)表明，sss基因已整合進(jìn)水稻的基因組中。直鏈淀粉含量測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株后代直鏈淀粉含量較對(duì)照有較大幅度的下降；胡利華，吳慧敏等[14]利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將檸檬酸合成酶（citrate synthase）基因CS導(dǎo)入雜交秈稻優(yōu)良恢復(fù)系明恢86，共獲得48株T0再生植株，通過(guò)分子檢測(cè)，證明有陽(yáng)性植株產(chǎn)生。Ignacimuthu等[15]將來(lái)源于菜豆種子的α淀粉酶阻抑基因通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到Basmati水稻（PB1）中，174個(gè)潮霉素抗性植株產(chǎn)生并呈GUS陽(yáng)性反應(yīng)。PCR和Southern雜交證實(shí)4.9 kb長(zhǎng)的α淀粉酶阻抑基因已經(jīng)存在，并通過(guò)Western印記雜交證實(shí)相關(guān)蛋白的表達(dá)?？偟膩?lái)說(shuō)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化在近十年里取得了顯著進(jìn)展，不僅為水稻品種的遺傳改良奠定了基礎(chǔ)，而且為水稻的分子生物學(xué)提供強(qiáng)有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻遺傳轉(zhuǎn)化的基本因素

3.1 水稻親本和受體

Chan等[5]研究發(fā)現(xiàn)粳稻轉(zhuǎn)化頻率較秈稻轉(zhuǎn)化頻率高，這可能與秈稻愈傷組織形成、繼代和再生植株困難等因素有關(guān)。在水稻的遺傳轉(zhuǎn)化中，通常轉(zhuǎn)化受體來(lái)源于幼胚、幼穗和成熟胚的生長(zhǎng)旺盛的胚性愈傷組織[16]，但是不同來(lái)源的愈傷組織的轉(zhuǎn)化頻率是不一樣的。Vijayachandra[17]研究水稻不同組織（細(xì)胞）對(duì)農(nóng)桿菌vir基因的誘導(dǎo)，結(jié)果表明，盾片和盾片來(lái)源的愈傷組織是最容易被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的組織。黃健秋等[18]采用未成熟胚來(lái)源的愈傷組織進(jìn)行根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時(shí)，其轉(zhuǎn)化頻率均高于成熟胚來(lái)源的愈傷組織的轉(zhuǎn)化頻率，平均高出1～2倍。因此，幼胚與成熟胚作為外植體各有優(yōu)勢(shì)，顯然選擇幼胚作為愈傷組織來(lái)源更適合為轉(zhuǎn)化的受體，轉(zhuǎn)化效率較高，但是幼胚受到季節(jié)的限制且易被污染，成熟胚來(lái)源的愈傷組織雖然轉(zhuǎn)化頻率低，但是污染程度相對(duì)較低，且成熟胚可長(zhǎng)期保存。鄭杰[19]就是以水稻基因組測(cè)序品種日本晴成熟胚為研究材料,對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)進(jìn)行了優(yōu)化，最終GUS表達(dá)率達(dá)到30%。此外，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一項(xiàng)針對(duì)性很強(qiáng)的單一性狀遺傳改良技術(shù)，受體親本應(yīng)選擇綜合農(nóng)藝性狀更好的品種。近年來(lái)，超級(jí)稻的轉(zhuǎn)基因研究已受到關(guān)注，并可能成為水稻轉(zhuǎn)基因的重要研究方向之一。

3.2 農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒要求

3.2.1 農(nóng)桿菌菌株 選取合適的農(nóng)桿菌菌株和優(yōu)良的質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)化來(lái)說(shuō)非常重要。用于水稻轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌株較為普遍的有 A281、A656、LBA4404、EHA101、EHA105、AGL1。李雙成[20]等以 3 個(gè)秈稻品種和2個(gè)粳稻品種為對(duì)象，對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻過(guò)程中影響轉(zhuǎn)化效率的因素進(jìn)行了研究，其研究發(fā)現(xiàn)菌株AGL1和EHA105按一定比例混合共轉(zhuǎn)化對(duì)抗性愈傷率有顯著影響?，F(xiàn)在應(yīng)用最多的是EHA105菌株。

3.2.2 質(zhì) 粒 對(duì)質(zhì)粒的要求有選擇標(biāo)記，啟動(dòng)子，外源基因等。常用的選擇標(biāo)記有三類(lèi):潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（hpt基因）、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（npt基因）和除草劑抗性基因（bar基因）。而啟動(dòng)子的種類(lèi)與靶細(xì)胞中基因的表達(dá)水平密切相關(guān)，水稻基因轉(zhuǎn)化中所使用的啟動(dòng)子主要有CaMV35S啟動(dòng)子、Nos啟動(dòng)子、Actl啟動(dòng)子、Ubiquitin啟動(dòng)子等。以常用的表達(dá)載體pCAMBIA1301為例，該質(zhì)?？傞L(zhǎng)為13.1 kb，其T-DNA左右邊界內(nèi)的區(qū)段含有hpt基因，gus基因和多克隆位點(diǎn)，其中的啟動(dòng)子為35S啟動(dòng)子。

3.3 轉(zhuǎn)化不同階段培養(yǎng)基與技術(shù)操作

3.3.1 誘導(dǎo)階段 對(duì)水稻的愈傷誘導(dǎo)其基本培養(yǎng)基有 NB，CC，N6，MS。殷麗青等[21]研究發(fā)現(xiàn) NB 培養(yǎng)基是粳稻品種廣泛運(yùn)用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，且NB培養(yǎng)基在秈稻愈傷誘導(dǎo)中也比其他培養(yǎng)基好一些。

3.3.2 共培養(yǎng)階段 這一階段的培養(yǎng)基非常關(guān)鍵，其中乙酰酊香酮?jiǎng)t是必不可少的成分。另外，愈傷組織細(xì)胞處在DNA復(fù)制階段以及浸泡愈傷組織時(shí)農(nóng)桿菌有合適的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率都有著重要的影響。一般共培養(yǎng)時(shí)間是2～3 d。部分研究發(fā)現(xiàn)，若在共培養(yǎng)基上墊一層濾紙，然后將愈傷接種到濾紙上，可以減少農(nóng)桿菌的污染。

3.3.3 篩選與分化 篩選和分化階段的培養(yǎng)基，主要注重抗生素的濃度以及激素的配比。過(guò)高的抗生素濃度會(huì)殺死陽(yáng)性愈傷，反之則不能起到很好的篩選作用。共培養(yǎng)后愈傷接種到篩選培養(yǎng)基的操作也顯得非常關(guān)鍵。如進(jìn)行漂洗，干燥處理等。周玲艷[22]發(fā)現(xiàn)愈傷組織經(jīng)干燥處理不僅可以有效殺死農(nóng)桿菌，而且可以改善愈傷組織狀態(tài)，提高轉(zhuǎn)化率。李雙成[20]認(rèn)為瓊脂粉加倍和超凈工作臺(tái)上風(fēng)干4 h的方法是最適合的干燥培養(yǎng)方式。切取篩選后的愈傷組織要經(jīng)過(guò)預(yù)分化處理，其目的就是使愈傷組織胚性增強(qiáng)，分裂與再生能力提高，這樣有利于外源基因整合[20]。然后將愈傷組織轉(zhuǎn)入到分化培養(yǎng)基，進(jìn)行光照和暗室的循環(huán)處理，使其大量分化。

3.3.4 壯苗生根 分化3周后，轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)，這一階段要保證其有處在正常的生理環(huán)境中，如光照，濕度以及黑暗處理。再生植株成長(zhǎng)到一定階段，就可以檢測(cè)其基因?qū)肭闆r。

4 展望

水稻是世界上最大的糧食作物，全球超過(guò)三分之一的人口都以稻米為主食。長(zhǎng)期以來(lái)，水稻雜交育種研究取得了令人矚目的成績(jī)，水稻產(chǎn)量大幅度提升。育種家們采用人工常規(guī)雜交技術(shù)選育了成千上萬(wàn)的品種并應(yīng)用于生產(chǎn)，為保障糧食安全與經(jīng)濟(jì)社會(huì)穩(wěn)定做出了巨大的貢獻(xiàn)。傳統(tǒng)技術(shù)一般可在生物種內(nèi)個(gè)體上實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，但操作的精確性較差，選育時(shí)間較長(zhǎng)。而轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)移基因可不受親緣關(guān)系的限制，且基因操作選擇的準(zhǔn)確性較高，此外基因的精確導(dǎo)入還能大大縮短育種年限。因此，轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)的緊密結(jié)合可以大大提高育種效率。隨著越來(lái)越多的有益基因被克隆和鑒定，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法必將在今后的分子育種中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

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