趙 霖，付 永，何海軍，李 花

（長(zhǎng)沙市公安局刑偵支隊(duì)，湖南 長(zhǎng)沙 430003）

一例遭清洗、雨淋的剪刀上做的DNA檢驗(yàn)

趙 霖，付 永，何海軍，李 花

（長(zhǎng)沙市公安局刑偵支隊(duì)，湖南 長(zhǎng)沙 430003）

公安機(jī)關(guān)在辦理重大案件，特別是在辦理具有難度的案件中，微量物證的DNA檢驗(yàn)對(duì)整個(gè)案件的偵破能起到關(guān)鍵作用。微量物證具有肉眼無(wú)法識(shí)別、難發(fā)現(xiàn)、難提取、易污染、易破壞的特點(diǎn)，造成微量物證提取和檢驗(yàn)的困難。“6.3”案件中對(duì)剪刀上微量物證的DNA檢驗(yàn)是案件偵破中的一個(gè)很重要環(huán)節(jié)，對(duì)指導(dǎo)相關(guān)案件檢驗(yàn)具有重要啟示作用。

法醫(yī)物證學(xué)；微量物證；DNA提取方法；QIAamp DNA Micro Kit

1.案件簡(jiǎn)介

2010年6月3日23時(shí)，長(zhǎng)沙某小區(qū)發(fā)生一起夫婦在家中被殺死的重大殺人案，案發(fā)后展開(kāi)現(xiàn)場(chǎng)勘查，在案發(fā)中心現(xiàn)場(chǎng)提取血跡41份送DNA實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)鑒定，案發(fā)后一直在下雨，兩天后在勘查室外小區(qū)草叢中發(fā)現(xiàn)把柄為紅色塑料式樣的剪刀一把，無(wú)明顯血跡，對(duì)其進(jìn)行聯(lián)苯胺血痕預(yù)實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性。

2.材料與方法

2.1樣本

外圍現(xiàn)場(chǎng)剪刀一把，用濾紙擦拭后做聯(lián)苯胺血痕預(yù)實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，決定進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)。

2.2 DNA提取方法

在剪刀上用紗布分四段（兩側(cè)刀尖、兩側(cè)剪刀柄）提取，每處選取2塊面積為2cm×2cm的紗布，用超純水把其中一塊紗布浸濕用力擦拭再用另一塊紗布擦拭，擦拭后干濕兩塊都一起放入1.5ml的Eppendorf管中。加入Buffer ATL200ul、PK 20ul，震蕩15秒，56℃3h，其間不時(shí)震蕩，以達(dá)到充分消化的目的。取上述消化液200ul轉(zhuǎn)移至另一Eppendorf管中，加入200ul的無(wú)水乙醇，震蕩，放置5分鐘使其達(dá)到室溫狀態(tài)（15℃-25℃）。加入200ul的AL Buffer及1ul溶解在A(yíng)E液體中的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA，震蕩。離心，將上步的全部消化液小心地轉(zhuǎn)移到QIAamp MinElute Columns中，離心8000rpm，1分鐘。加入500ml的AW1液，注意不要將離心柱的內(nèi)壁弄濕，離心8000rpm，1分鐘。取出QIAamp MinElute Columns，放置在一個(gè)干凈的2ml的收集管子中。在QIAamp MinElute Columns中加入500ml的AW2液，不要將離心柱的壁弄濕，離心13000rpm，3分鐘。將QIAamp MinElute Columns取出，放置在一個(gè)干凈的1.5ml的Eppendorf管中，在QIAamp MinElute Columns表膜的中央加入20-50ul的buffer AE，放置1分鐘，使其處于室溫（15℃——25℃），離心14000rpm，1分鐘。以上離心均在高速冷凍離心機(jī)中進(jìn)行，溫度設(shè)定于20℃。

2.3 PCR擴(kuò)增及擴(kuò)增產(chǎn)物檢驗(yàn)

用9700擴(kuò)增儀和PowerPlex16試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為 10ul，模板 DNA 取 3ul，Gold STR 10×Buffer 1.0 ul，Primer Pair Mix 1.0 ul，Ampli Tag Gold 0.3 ul，不足部分以水補(bǔ)足，擴(kuò)增產(chǎn)物在A(yíng)BI3130XL分析儀中進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離，用GeneMapperID軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和等位基因分型。

3.結(jié)果及破案過(guò)程

右側(cè)刀柄處獲得男性死者與死者以外的另一男性混合基因型，左側(cè)刀尖處獲得兩死者混合基因型，獲得這個(gè)結(jié)果后進(jìn)一步可以推斷該剪刀為作案工具，并且這個(gè)剪刀可以作為兩死者的致死工具，在后期的檢驗(yàn)鑒定中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)6號(hào)血跡、現(xiàn)場(chǎng)洗手水池上提取的可疑血跡、洗手臺(tái)上可疑血跡三處檢測(cè)出除死者外的一男性基因型，經(jīng)過(guò)比對(duì)后，分析認(rèn)為男性死者基因型和六號(hào)血痕的基因型混合后可以得到剪刀刀柄處所得的死者跟死者以外另一男性混合的基因型，故可以推斷“一人可以完成作案，嫌疑人有受傷的可能”兩個(gè)觀(guān)點(diǎn)；由于DNA檢驗(yàn)結(jié)果的出現(xiàn)，再結(jié)合法醫(yī)現(xiàn)場(chǎng)勘查、尸體損傷檢驗(yàn)、痕跡勘查分析后技術(shù)一致認(rèn)為“一人作案、剪刀為兩死者共同的致死工具”；把這個(gè)結(jié)論反饋于偵查部門(mén)后，偵查部門(mén)在對(duì)案發(fā)時(shí)間段內(nèi)小區(qū)現(xiàn)場(chǎng)視頻錄像中排查出一個(gè)符合作案的男性青年，對(duì)其排查后鎖定該男性青年有重大嫌疑，案發(fā)7天后抓獲該嫌疑人龍某，對(duì)龍某血痕進(jìn)行DNA檢測(cè)后同現(xiàn)場(chǎng)6號(hào)血跡、現(xiàn)場(chǎng)洗手水池上提取的可疑血跡、洗手臺(tái)上可疑血跡比對(duì)發(fā)現(xiàn)15個(gè)STR基因座所有分型一致，能夠達(dá)到同一認(rèn)定的水平，在審訊的時(shí)候嫌疑人交代用剪刀作案后在洗手的水池里清洗過(guò)。DNA的檢驗(yàn)結(jié)果為該案件的偵查破案提供了證據(jù)及方向發(fā)揮了重要作用。

4.討論

DNA檢驗(yàn)隨著技術(shù)及方法的快速發(fā)展，理論上是支持單細(xì)胞擴(kuò)增及檢測(cè)，公安機(jī)關(guān)在辦理重大案件，特別是在辦理具有難度的案件中，微量物證的檢驗(yàn)可以影響到整個(gè)案件的偵破，微量物證具有肉眼無(wú)法識(shí)別、難發(fā)現(xiàn)、難提取、易污染、易破壞的特點(diǎn)，該案件剪刀就差點(diǎn)被忽略。所以即使理論上支持單細(xì)胞擴(kuò)增，但是在公安機(jī)關(guān)辦案中是難以把握的，因?yàn)楝F(xiàn)場(chǎng)各種條件復(fù)雜，影響檢材提取的不利因素多。該案件的難點(diǎn)在于剪刀雖然是作案的兇器，但是在作案后經(jīng)歷過(guò)嫌疑人的清洗，遺棄在草叢中經(jīng)歷過(guò)兩天的雨淋，上面已經(jīng)無(wú)明顯血跡，檢驗(yàn)條件差，并且該案件在勘查后，DNA檢驗(yàn)結(jié)果未完成前法醫(yī)在兩個(gè)尸體上發(fā)現(xiàn)了不同類(lèi)型的創(chuàng)口，在現(xiàn)場(chǎng)發(fā)現(xiàn)兩種不同的足跡，殺死兩人一個(gè)人難以同時(shí)完成，故在一人作案還是兩人作案、一個(gè)兇器多種兇器這些問(wèn)題上有爭(zhēng)執(zhí)；所以DNA檢驗(yàn)對(duì)于案件偵破的發(fā)展來(lái)說(shuō)就十分重要。下面就對(duì)該剪刀提取檢驗(yàn)的難點(diǎn)及經(jīng)驗(yàn)做個(gè)總結(jié)：

第一、DNA檢驗(yàn)鑒定關(guān)鍵在提取。目前純化方法多樣及技術(shù)比較成熟，只有提取到DNA了才能保證能檢驗(yàn)出來(lái)。該剪刀在提取檢材時(shí)筆者認(rèn)為首先要思考及規(guī)劃提取方案，作為可疑兇器，結(jié)合剪刀的四個(gè)相對(duì)獨(dú)立部分及四個(gè)部分都能被人體完成不同的活動(dòng)或者前端兩個(gè)刀尖可以實(shí)施在人體上完成不同活動(dòng)的特點(diǎn)，故選擇在四個(gè)獨(dú)立的部分用二次提取法（干濕法）提取；在選擇提取方案時(shí)要注意，在面對(duì)微量物證提取時(shí)要有意識(shí)能盡量多的提取到DNA，DNA檢驗(yàn)對(duì)樣品DNA濃度有閾值要求，所以在選擇分段提取時(shí)不能認(rèn)為分段分得越多就越好；分段提取的另一個(gè)職能是分段后盡量能提取到一個(gè)人的脫落細(xì)胞，所以要結(jié)合使用人完成該動(dòng)作所需要的活動(dòng)范圍為最好；擦拭力度第一步濕提取要求力量稍大，能把遺留在物品上的粘附物擦拭到紗布上；第二步的干提取只是要求把第一步所遺留在物品上的水分吸干，最大可能地提取到脫落細(xì)胞。

第二、選擇適合該物證的純化方法。目前實(shí)驗(yàn)室純化方法多樣性，一般有磁珠法、純化柱法。筆者認(rèn)為從該案件的剪刀上提取的四個(gè)擦拭檢材，DNA濃度含量不高，要避免在提取、純化過(guò)程中有損失，所以才選擇QIAamp的純化柱。QIAamp DNA Micro試劑盒在有蛋白酶K和ATL緩沖液存在及高溫的變性條件下，樣品會(huì)發(fā)生裂解，在離液鹽和乙醇存在的條件下，DNA選擇性地結(jié)合至硅膠膜上，再通過(guò)洗滌去除蛋白、鹽等其他雜質(zhì)，最終，結(jié)合在硅膠膜上的DNA被洗脫下來(lái)。而此試劑盒中轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（Carrier RNA）在純化過(guò)程中減少了目標(biāo)DNA的非特異性吸附，降低了提取過(guò)程中的損耗；QIAamp MinElute Columns尤其適合小體系洗脫液洗脫，從而達(dá)到濃縮目的。

第三、選擇優(yōu)良的擴(kuò)增方法。微量物證DNA含量低，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，只有提高擴(kuò)增體系中樣品DNA的含量，盡量多加模板，少加水，適當(dāng)提高點(diǎn)擴(kuò)增體系中酶的含量，優(yōu)化擴(kuò)增體系。甚至模板含量不少的條件下可以分幾個(gè)梯度擴(kuò)增，增加1－2個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，但是絕對(duì)不能超過(guò)32個(gè)循環(huán)。

第四、對(duì)于混合基因型結(jié)果的判斷及分析。混合基因型是一個(gè)復(fù)雜的分型，判斷要相當(dāng)?shù)闹?jǐn)慎，思路要清晰。首先要明白只有單獨(dú)混合基因型的存在是不能作為認(rèn)定混合個(gè)體，必須要獲得每個(gè)混合個(gè)體的基因型?；旌匣蛐褪嵌鄠€(gè)基因座出現(xiàn)2個(gè)以上的等位基因，對(duì)混合基因型首先要排除生物學(xué)干擾因素，比如stutter峰及無(wú)效等位基因的存在，stutter峰一般峰高小于樣品峰，其次要獲得每個(gè)峰型的峰高，才能判斷是否為混合基因型、混合比例。該剪刀上出現(xiàn)的多個(gè)基因型的位點(diǎn)筆者都先確定了干擾峰，對(duì)是相對(duì)高峰前一個(gè)并且小于相對(duì)高峰15%的都去除，每個(gè)基因座的等位基因最大數(shù)目都在四個(gè)以?xún)?nèi)，所以筆者初步判斷為混合基因型；結(jié)合現(xiàn)場(chǎng)6號(hào)血跡、男性死者獲得的基因型才能判斷為該兩人混合所得。

第五、檢材處理過(guò)程中質(zhì)量的控制。微量物證的DNA含量相對(duì)少，稍微一點(diǎn)外源性DNA就能污染樣品，所以在對(duì)微量物證檢驗(yàn)過(guò)程中最主要是一定要有防護(hù)措施，其次是要在進(jìn)行每一步的過(guò)程中設(shè)陰性、陽(yáng)性對(duì)照，在檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)后要先查看每步陰性對(duì)照樣品是否存在污染，再查看每步陽(yáng)性對(duì)照樣品是否準(zhǔn)確，如果沒(méi)有存在污染或者錯(cuò)誤，那么微量物證樣品才能作為一個(gè)準(zhǔn)確的結(jié)果使用，如果對(duì)照樣品存在污染或者錯(cuò)誤的話(huà)可以查看是第幾步對(duì)照樣品出現(xiàn)問(wèn)題，是可以溯源的。

5.總結(jié)

第一、DNA檢測(cè)結(jié)果對(duì)案件現(xiàn)場(chǎng)、案件過(guò)程的重建有著關(guān)鍵作用。因?yàn)樘釞z分離的原則，實(shí)驗(yàn)室人員一直忽視對(duì)現(xiàn)場(chǎng)的勘察，長(zhǎng)期以檢材為檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)室人員缺乏對(duì)案件整體性的把握較差。該案件筆者單位領(lǐng)導(dǎo)組織DNA檢驗(yàn)人員對(duì)現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行勘查、指導(dǎo)分局提取現(xiàn)場(chǎng)檢材，實(shí)驗(yàn)室人員在現(xiàn)場(chǎng)勘查后對(duì)案件現(xiàn)場(chǎng)有了整體的把握，回到實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)后對(duì)照自己的檢驗(yàn)結(jié)果，分析作案過(guò)程，推測(cè)犯罪嫌疑人作案的心理活動(dòng)，為案件重建發(fā)揮了重要作用。該案件中在現(xiàn)場(chǎng)的多處血跡里查出了混合基因型，而且除了兩死者外只有另一男性的基因型，結(jié)合每個(gè)人的血跡分布后，重現(xiàn)了整個(gè)作案過(guò)程，技術(shù)上才一致認(rèn)同為一人作案可以完成，最終確定了偵查方向，最后在視頻偵查中鎖定了犯罪嫌疑人。

第二、DNA結(jié)果對(duì)致傷工具的認(rèn)定有著關(guān)鍵作用，能在可疑工具上檢驗(yàn)出死者或者犯罪嫌疑人的基因型結(jié)合死者創(chuàng)口形態(tài)是完全可以認(rèn)定致傷工具的，這個(gè)作用是其他檢驗(yàn)辦法無(wú)法完成的；該案件由于剪刀上有兩死者及另一男性成分后法醫(yī)再結(jié)合DNA結(jié)果對(duì)尸體創(chuàng)口形態(tài)分析，最終才形成統(tǒng)一的技術(shù)結(jié)論，為案件的偵破提供了準(zhǔn)確的方向。

第三、刑事技術(shù)是一個(gè)統(tǒng)一的整體，各專(zhuān)業(yè)之間是要密切配合，所得出的結(jié)論要互相印證，出現(xiàn)矛盾的時(shí)候要尋找并分析原因，DNA技術(shù)的出現(xiàn)及發(fā)展是建立在刑事技術(shù)上面的，所以DNA技術(shù)的應(yīng)用不能只停留在實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)上。

Abstract:In the process of handling major cases by public security organs,especially in handling difficult cases,DNA testing on the material evidence of small quantity plays a key role in solving the overall case.With such characteristics as invisibility,difficulty of being found and extracted,process of being contaminated and damaged,material evidences of small quantity are not easy to be extracted and tested.Therefore,in the case of June 3rd,DNA testing on the scissors with material evidence of small quantity is an important part in the whole investigational work,and it is of important enlightenment for guiding relative cases.

Key words:forensic examination of material evidence;material evidence of small quantity；DNA extraction；QIAamp DNA Micro Kit

（責(zé)任編輯：王道春）

DNA Testing on the Washed and Rained Scissors

ZHAO Lin,FU Yong,Hehai Jun,Li Hua

（Changsha Public Security Bureau,Changsha,430003,Hunan）

D918

A

1008-7575(2010)06-0016-02

2010-10-22

趙霖（1984－ ），男，云南昆明人，長(zhǎng)沙市公安局刑偵支隊(duì)技術(shù)大隊(duì)DNA實(shí)驗(yàn)室法醫(yī)師，三級(jí)警司。