RT-PCR技術(shù)在BVDV檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

李兆華 （山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 濰坊 261041）

牛病毒性腹瀉/黏膜病，簡(jiǎn)稱牛病毒性腹瀉病。1946年在紐約州病牛中首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道為牛病毒性腹瀉病(BVD)，1953年Ransey與Chiver發(fā)現(xiàn)了牛黏膜病(MD)，后經(jīng)Gillespie等1961年研究證實(shí)兩種病為同一病毒引起，并于1971年由美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)統(tǒng)一命名為牛病毒性腹瀉/黏膜病，是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)或黏膜病病毒(Mucosal Disease Virus，MDV)引起的接觸性傳染病。屬黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，與豬瘟病毒(CSFV)和邊界病病毒(BDV)同屬，它們?cè)诨蚪Y(jié)構(gòu)和抗原性上有很高的同源性，有共同的可溶性抗原。BVDV與CSFV的核昔酸序列約有60%同源性，氨基酸約有85%同源性[1]，能突破宿主特異性發(fā)生交叉感染。很多學(xué)者對(duì)BVD進(jìn)行了深入研究，雖然己經(jīng)闡明某些機(jī)理，但在該病的診斷、防制等方面仍面臨困難。本文綜述了BVD的基因組結(jié)構(gòu)并就RT-RCR技術(shù)在其檢測(cè)中應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 BVDV的病原類型

目前發(fā)現(xiàn)BVDV的一個(gè)有趣的生物學(xué)特性是存在著不致細(xì)胞病變(noncytopathoge，nic97)的和致細(xì)胞病變(cytopathogenic，cp)的兩種生物型，這兩種生物型可在組織培養(yǎng)細(xì)胞中加以區(qū)分，即CP型病毒在宿主細(xì)胞中增殖時(shí)對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯損害，但CP型病毒可引起感染細(xì)胞病變(CPE)。CP型和NCP型BVDV是黏膜病(mucosal disease)發(fā)生的主要原因。從患有黏膜病的動(dòng)物體中，可以同時(shí)分離到NCP型的BVDV和CP型的BVDV，通過(guò)血清學(xué)及分子生物學(xué)分析，二者具有高度的相似性，說(shuō)明NCP型BVDV和CP型BVDV在抗原性上是非常接近的。試驗(yàn)證實(shí)，對(duì)NCP型BVDV持續(xù)感染的動(dòng)物再次感染抗原性相似的CP型BVDV時(shí)，將發(fā)生黏膜病[2]。由此可以斷定，黏膜病的發(fā)生的前提是NCP型BVDV的持續(xù)感染。許多研究從分子生物學(xué)角度說(shuō)明，粘膜病的發(fā)生是在NCP型病毒發(fā)生重組后產(chǎn)生的CP型病毒而引起的，也就是說(shuō)NCP型病毒通過(guò)與來(lái)自宿主細(xì)胞RNA的重組、病毒自身RNA的重排、缺失以及堿基替換等一系列過(guò)程產(chǎn)生了CP型病毒。因此，CP型病毒代表了NCP型病毒通過(guò)重組而產(chǎn)生的變種[3-5]。CP型毒株主要包括Avburn、NADL、Singer、Osloss、Oregon、Nose、ug-59、72、258、2890等常見(jiàn)毒株。NCP型毒株主要包括紐約-1、TGAN、NeB、Draper、Ry、619、890、1795、2724、7443等常見(jiàn)毒株。CP型毒株感染細(xì)胞早期，細(xì)胞核有強(qiáng)折光性，然后細(xì)胞變圓，3～4d出現(xiàn)核固縮、空泡和細(xì)胞脫落等典型CPE。其超微結(jié)構(gòu)顯示病毒子代合成快，很快產(chǎn)生大量病毒，細(xì)胞變性直至溶解。在基因水平上產(chǎn)生CP型BVDV的原因有:BVDV基因組的缺失、外源基因以及病毒自身基因的插入和基因的點(diǎn)突變?nèi)N形式，這些變化均影響NS2～3多聚蛋白的編碼，使其產(chǎn)生一個(gè)額外的裂解位點(diǎn)。因此，通過(guò)比較CP型和NCP型BVDV在感染細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)的差異，可以明顯發(fā)現(xiàn)其在表達(dá)蛋白水平上有一個(gè)共同的特征:即在CP型病毒感染的細(xì)胞中可檢測(cè)到成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和NS2，而在NCP型病毒感染的細(xì)胞中無(wú)NS3存在。因此，NS3被認(rèn)為是CP型病毒的標(biāo)志蛋白。NS3蛋白是一種具有三種酶活性即絲氨酸蛋白酶活性、核苷三磷酸酶活性、RNA解旋酶活性的多功能蛋白。試驗(yàn)證明NS3蛋白與細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)[6-8]。也就是說(shuō)，NS3蛋白與病毒對(duì)宿主的CPE密切相關(guān)，這種功能的發(fā)揮需要NS2的調(diào)節(jié)。NCP型毒株基本不出現(xiàn)CPE，超微結(jié)構(gòu)顯示病毒子代合成慢，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞只出現(xiàn)輕微變性，本病毒與豬瘟病毒一樣在牛睪丸細(xì)胞培養(yǎng)中能增強(qiáng)新城疫病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)。

2 BVDV的基因組

BVDV病毒粒子大小為40～60nm，為圓形顆粒，有囊膜，該病毒的基因組為單股正鏈RNA，有感染性。序列分析表明，CP型分離株基因組約為12.5kb，而NCP型則為12.3kb。BVDV基因組由5’非翻譯區(qū)(5’UTR)、一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框(ORF)和3’非編碼區(qū)(3’NCR)組成，基因順序?yàn)?’-P20-P14-gP48-gP25-gP53-P54/P80-P10-P30-P133(P58/P7 5)-3’[6]。BVDV的5’UTR約有360～386個(gè)核苷酸，無(wú)甲基化“帽子”結(jié)構(gòu)，序列保守性很高，可形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，內(nèi)部有核糖體結(jié)合位點(diǎn)，是進(jìn)行分子流行病學(xué)研究的首選區(qū)域。5’UTR包括三個(gè)可變區(qū)，在所有的瘟病毒分離株中，有兩個(gè)區(qū)域核苷酸序列高度保守，可用于設(shè)計(jì)引物，作為檢測(cè)BVDV的探針或?qū)VDV分型[9-11]。CP型BVDV NADL株的ORF起始于基因組5’端386位核苷酸的起始密碼子(ATG)，連續(xù)延伸到3’端12350位核苷酸的終止密碼(TGA)，且在366～386bp之間有24個(gè)核苷酸序列ATCTCTGCTGC(ATG)GCAC(ATG)G完全保守。該ORF編碼一個(gè)由3988個(gè)氨基酸殘基組成的分子量約為449kD的前體多聚蛋白，進(jìn)一步由病毒和細(xì)胞的酶加工成BVDV核衣殼的核心蛋白、3種囊膜蛋白，ORF酶解后剩余3’端約2600個(gè)密碼子編碼幾種非結(jié)構(gòu)蛋白[12]。NCP型BVDV SD-1株全基因序列是12308個(gè)核苷酸，其ORF起始于基因組5’端386位核苷酸，起始密碼為ATG，連接延伸到3’端12080和12082位的終止密碼子TGA，可編碼由3898個(gè)氨基酸殘基組成的分子量為438kD的蛋白。BVDV的3’NCR由223～229個(gè)核苷酸組成，無(wú)多聚腺苷酸(PolyA)結(jié)構(gòu)，屬內(nèi)保守性很高，與病毒復(fù)制酶對(duì)RNA模板鏈的識(shí)別有關(guān)[13]。

3 RT-PCR技術(shù)在BVDV檢測(cè)中的應(yīng)用

高存福等根據(jù)已發(fā)表的牛病毒性腹瀉病毒株(BVDV)5’端非編碼區(qū)保守序列設(shè)計(jì)合成了兩條引物，應(yīng)用RT－PCR技術(shù)對(duì)兩株BVDV標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行基因擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定。同時(shí)設(shè)豬瘟兔化弱毒疫苗株、輪狀病毒株、MDBK細(xì)胞作對(duì)照；結(jié)果兩株BVDV標(biāo)準(zhǔn)株均擴(kuò)增出了長(zhǎng)度為325bp的片段，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后形成長(zhǎng)度為111bp和214bp兩條片段，而對(duì)豬瘟兔化弱毒疫苗株、輪狀病毒株、MDBK正常細(xì)胞擴(kuò)增均為陰性，與預(yù)期結(jié)果一致。該方法的敏感性可高達(dá)0.1TCID50。加拿大動(dòng)物疾病研究所的S. A. Gillxrt等人制了一種套式復(fù)合PCR，對(duì)牛病毒性腹瀉病毒進(jìn)行因分型。這種測(cè)定方法可以檢出少到3個(gè)50%組織感染劑量的BVDV，可以對(duì)42個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)分離中的40個(gè)分離物進(jìn)行分型。用或不用RNA提取步驟，都能對(duì)所檢查的29份全血樣品進(jìn)行有效的BVDV分型。日本學(xué)者Vnuid. K等建立了反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT一PCR)試驗(yàn)，用以檢測(cè)牛病毒性腹瀉病毒BVDV，其引物選用BVDV基因的P80區(qū)片段。用RT—PCR檢出了所有供試的17株BVDV株，包括細(xì)胞病變株和非致細(xì)胞病變株。該方法的檢出限為1TCLD/ml。用RT-PCR法的檢出效率可與病毒分離法(VI)相比。從5頭患黏膜病、流產(chǎn)或腹瀉的牛采集了40份血清和組織樣品供檢，結(jié)果RT-PCR法從所有樣品中檢出了BVDV，而用VI法從流產(chǎn)犢牛采集的10份樣品沒(méi)有分離到病毒。楊桂梅等參照文獻(xiàn)報(bào)道的基因序列，設(shè)計(jì)合成了兩對(duì)能分別擴(kuò)增水泡性口炎病毒(VSV)與牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)基因片段的引物，并對(duì)PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了二重RT-PCR方法，可同時(shí)檢測(cè)VSV與BVDV病毒核酸。VSV產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序顯示與報(bào)道的核酸序列同源性為88.16%。二重RT_PCR同時(shí)檢測(cè)VSV與BVDV經(jīng)濟(jì)、快速、敏感、特異，可用于實(shí)驗(yàn)研究和流行病學(xué)調(diào)查。涂長(zhǎng)春等以牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)特異引物P1P3擴(kuò)增BVDV標(biāo)準(zhǔn)毒株及以豬瘟病毒(HCV)特異引物P2P3擴(kuò)增HCV陽(yáng)性病料，分別擴(kuò)增出326bp和252bp的特異片段;以P1、P2、P3擴(kuò)增BVDV和HCV人工混合感染樣品，擴(kuò)增出大小為326bp和252bp的2條片段，建立了特異的一步檢測(cè)BVDV和HCV的復(fù)合PCR方法。以建立的復(fù)合PCR方法檢測(cè)BVDV分離株，都擴(kuò)增出1條326bp的特異片段。

[1]謝西鋒, 崔保安. 牛病毒性腹泄的研究[J]. 中國(guó)獸醫(yī)雜志, 2001, 37(11): 29.

[2]Moening V, Frey HR, Liebler E, et al.Reproduction of mucosal disease with cytopathogenic bovin viral diarrhoea virus Selectedin vitro[J]. Vet Rec, 1990, 127: 200-203.

[3].Becher P, Meyer S G, Shannon A D, etal.Cytopathogenicity of border disease Virus is correlated with integration of cell Ular sequences into the Viralgenome[J]. J Virol, 1996, 70: 2992-2998.

[4].KupfermannH, Thiel HJ, DuboviE, etal.Bovine viral diarrheavirus:Characteriation of a Cy topathogenic defective interferingparticle with two internal deletions[J]. JVirol, 1996, 70: 8175-8181.

[5].Meyer SG, Taut N, Dubovi EJ, etal.Viral cytopathogenicity correlated with integration of ubiquit incoding sequences [J]. Virology, 1991, 180:602-6l6.

[6] 崔保安, 朱沙, 陳圣先. 牛病毒性腹瀉病毒蛋白特性的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2003, 30(2): 32-34.

[7].Muylaert E G, Mackenzie JM, Kenney M T.Ultra.Structure of KUnjin virus infected cells:Colocalization of NSl and NS3 with double strand RNA, and of NS2 with NS3, in viru6一induced membrane structure[J] .J Viro, 1997, 71:6650-6661.

[8]LinC, Lindenbach BD, Pragaic BM, etal.Pressing in the hepatitisC virus E2-NS2 region: identification of temperature Sensitive mutation which blocks RNA accumulation[J].J Viro, 1997, 71:291-298.

[9].Elber S K, Becher P, etal.Processing in the pestivirus E2-NS2 region:indentification of proteins p7 and E2 [J]. J Vorol, 1996, 70:4131-4135.

[10]DE Moerlooze. L, Lecomte C, Brown-shimmer S et al. Nucleotide sequence of the bovine viral diarrhea virus Oslossstrain: comparison with related viruses and identification of specific DNA probes in the 5′untranslated region[J]. J Gen Virol, 1993, 74:1433-1438.

[11] QI F X, Ridpath J F, Lewis T, et al. Analysis of the bovine viral diarrhea virus genome for possible cellular insertion[J]. Virol, 1992, 189:285-292.

[12]Ridpath J F, Bolin S R, Katz J. Comparison of nucleic acid hybridization and nucleic acid amplication using conservedsequences from the5’-noncoding region for detection of bovine viral diarrhea virus[J].J Clin Microbiol, 1993, 31: 986-989.

[13]Deng R, Brock KV. Molecular cloning and nucleotide sequence of a pestivirus genome noncytopathic bovine viral diarrhea virus strain SD-1[J].Virol, 1992, 191: 867-879.