柑桔無病毒苗木繁育規(guī)程

1 范圍

本標準規(guī)定了柑桔無病毒苗木繁育的術語和定義、要求、柑桔病毒病和類似病毒病害檢測方法、脫毒技術以及無病毒母本園、無病毒采穗圃和病毒苗圃的建立和管理。

本標準適用于全國柑桔產(chǎn)區(qū)的甜橙、寬皮柑桔、柚、葡萄柚、檸檬、來檬、枸櫞（佛手）、酸橙和金柑以及以它們?yōu)橛H本的雜交種的無病毒苗木的繁育。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

GB 5040 柑桔苗木產(chǎn)地檢疫規(guī)程

GB 9659 柑桔嫁接苗分級及檢驗

3 術語和定義

3.1 適栽品種 commercialvariety

適合于當?shù)卦耘嗟母探燮贩N。

3.2 原始母樹 originalmother tree

對病毒病和類似病毒病感染狀況尚不明確的母本樹。

3.3 病毒病和類似病毒病 virus and virus-diseases

由病毒、類病毒、植原體、螺原體和某些難培養(yǎng)細菌引起的植物病害。

3.4 指示植物 indicator plant

受某種病原物侵染后，能表現(xiàn)具有特征性癥狀的植物。

3.5 莖尖嫁接 shoot-tip grafting

將嫩梢頂端生長點連同2～3個葉原基，長度為0.14～0.18 mm的莖尖嫁接于試管內(nèi)生長的砧木的過程。

3.6 脫毒 virus exclusion

采用莖尖嫁接或熱處理+莖尖嫁接方法，使已受病毒病和類似病毒病感染的植株的無病毒部分與原植株脫離而得到無病毒植株的過程。

3.7 無病毒母本樹 virus-free mother tree

用符合本規(guī)程要求的無病毒品種原始材料繁育或經(jīng)檢測符合本規(guī)程要求的無病毒的可供采穗用的植株。

3.8 無病毒母本園 virus-free mother block

種植無病毒母本樹的園地。

3.9 無病毒采穗圃 virus-free increasing block

用無病毒母本樹的接穗繁殖的苗木建立的用于生產(chǎn)接穗的圃地。

3.10 無病毒苗圃 virus-free nursery

用從無病毒采穗圃或無病毒母本園采集的接穗繁殖苗木的圃地。

4 要求

4.1 接穗和砧木

4.1.1 繁殖柑桔無病毒苗木所用的接穗和砧木的品種都是適栽品種。

4.1.2 繁殖柑桔無病毒苗木所用的砧木用實生苗。

4.2 柑桔無病毒苗木不帶有下述病毒病和類似病毒病

4.2.1 國內(nèi)已有品種的苗木不帶黃龍?。╤uanglongbing）、裂皮?。╡xocortis）、碎葉?。╰atter leaf），柑桔衰退病毒莖陷點型強毒系引起的柚矮化病 （pummelodwarf）和甜橙莖陷點?。╯weet orangestem-pitting）以及溫州蜜柑萎縮?。╯atsumadwarf）。

4.2.2 從國外引進的柑桔苗木，除不帶4.2.1所列病害外，還要求不帶鱗皮病（psorosis）、木質陷孔?。╟achecxia）、石果病（impictratura）、 頑 固 病 （stubbom）、 雜色退綠?。╲ariegated chlorosis）和來檬叢枝?。╨imewitches’broom）等各種病毒病和類似病毒病害。

4.3 柑桔無病毒苗木不帶潰瘍病

按GB 5040規(guī)定執(zhí)行。

4.4 柑桔無病毒苗木的生長規(guī)格

嫁接口高度、干高、苗木徑粗和根系生長按GB 9659規(guī)定執(zhí)行。

5 原始母樹的選定

5.1 適栽品種（單株系）名單由省級農(nóng)業(yè)行政部門確定。

5.2 原始母樹用適栽品種的優(yōu)良單株，或具有該品種典型園藝學性狀的其他單株。

6 原始母樹感染病毒病和類似病毒病害情況鑒定

6.1 從原始母樹采接穗，在用40目塑料網(wǎng)紗構建的網(wǎng)室內(nèi)嫁接繁殖4株苗木，以備病毒病和類似病毒病鑒定和脫毒用。

6.2 病毒病和類似病毒病鑒定可采用指示植物法（見本標準7和附錄A），亦可采用快速法，后者包括血清學鑒定、聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定和分子生物學鑒定（見附錄C）。

6.3 鑒定證明原始母樹未感染本標準要求不得帶有病毒病和類似病毒病害，從該母樹采接穗在網(wǎng)室內(nèi)繁殖的苗木（同6.1），即系柑桔無病毒苗木，可用作柑桔無病毒品種原始材料。

6.4 鑒定證明原始母樹已感染本標準要求不帶的病毒病和類似病毒病害，該母樹要進行脫毒。

7 指示植物鑒定

7.1 鑒定的病害，指示植物種類（品種），鑒別癥狀，適于發(fā)病的溫度和鑒定一植株所需指示植物株數(shù)見附錄A。

7.2 指示植物鑒定在用40目網(wǎng)紗構建的網(wǎng)室或溫室內(nèi)進行。

7.3 指示植物中，Etrog香櫞的亞利桑那861或861-S-1選系和鳳凰柚用嫁接苗或扦插苗，其他指示植物用實生苗和嫁接苗。

7.4 接種木本指示植物用嫁接接種，一般用單芽或枝段腹接，除黃龍病鑒定外，亦可用皮接。接種草本指示植物用汁液摩擦接種。

7.5 在每一批鑒定中，鑒定一種病害需設接種標準毒源的指示植物作正對照，設不接種的指示植物作負對照。

7.6 指示植物接種時，在一個品種材料接種后，所用嫁接刀和修枝剪用1%次氯酸鈉溶液消毒，操作人員用肥皂洗手。

7.7 指示植物要加強肥水管理和病蟲害防治，以保持指示植物的健壯生長，并及時修剪，誘發(fā)新梢生長，加速癥狀表現(xiàn)。

7.8 在適宜發(fā)病條件下，每3～10天觀察一次發(fā)病情況，在不易發(fā)病的季節(jié)，每2～4周觀察一次。

7.9 指示植物的發(fā)病情況，一般觀察到接種后24個月為止。觀察期間，如果正對照植株發(fā)病而負對照植株未發(fā)病，可根據(jù)指示植物發(fā)病與否判斷被鑒定植株是否帶病。在鑒定某種病害的指示植物中有1株發(fā)病，被鑒定的植株即判定為帶病。

8 脫毒

8.1 脫毒技術

對已受裂皮病、木質陷孔病、頑固病、來檬叢枝病、雜色退綠病或黃龍病感染的植株，采用莖尖嫁接法脫毒；對已受碎葉病、溫州蜜柑萎縮病、衰退病、鱗皮病或石果病感染的植株，采用熱處理+莖尖嫁接法脫毒。

8.2 莖尖嫁接脫毒技術的操作

8.2.1 莖尖嫁接在無菌條件下操作。

8.2.2 砧木準備。常用枳橙或枳的種子。剝?nèi)?nèi)、外種皮，經(jīng)用0.5%次氯酸鈉溶液（加0.1%吐溫20）浸10秒后，滅菌水洗3次，播種于經(jīng)高壓消毒的試管內(nèi)MS固體培養(yǎng)基上，在27℃黑暗中生長，兩周后供嫁接用。

8.2.3 莖尖準備及嫁接。采1～2cm長的嫩梢，經(jīng)0.25%次氯酸鈉溶液（加0.2%吐溫20）浸5秒，滅菌水洗3次后切取頂端生長點連同其下2～3個葉原基，長度為0.14～0.18 mm的莖尖嫁接于砧木，放入經(jīng)高壓消毒的裝有MS液體培養(yǎng)基的試管中，在生長箱或培養(yǎng)室內(nèi)保持27℃、每天16小時、1 000 lx光照和8小時黑暗條件下生長。

8.2.4 莖尖嫁接苗的移栽或再嫁接。試管內(nèi)莖尖嫁接苗長出3～4個葉片時，可移栽于盛有消毒土壤的盆中，或將莖尖嫁接苗再嫁接于盆栽砧木上，以加速生長。

8.2.5 脫毒效果的確認。從莖尖嫁接苗取枝條嫁接于指示植物，或取樣用快速鑒定法鑒定其感病情況，如果呈陰性反應，證明原始母樹所帶病原已經(jīng)脫除。所需鑒定的病害種類與原始母樹所感染的相同。

8.3 熱處理+莖類嫁接脫毒技術的操作

供脫毒的植株每天在40℃有光照條件下生長16小時和在30℃黑暗條件下生長8小時，連續(xù)10～60天后采嫩梢進行莖尖嫁接，其他步驟與8.2同。

9 柑桔無病毒品種原始材料的網(wǎng)室保存

9.1 網(wǎng)室用40目網(wǎng)紗構建，網(wǎng)室內(nèi)工具專用，修枝剪在使用于每一植株前用1%次氯酸鈉溶液消毒。工作人員進入網(wǎng)室工作前，用肥皂洗手；操作時，人手避免與植株傷口接觸。

9.2 每個品種材料的脫毒后代在網(wǎng)室保存2～4株，用做柑桔無病毒品種原始材料。

9.3 網(wǎng)室保存的植株除有特殊要求的以外，采用枳作砧木。

9.4 網(wǎng)室保存植株用盆栽，盆高約30 cm，盆口直徑約30cm。

9.5 網(wǎng)室保存植株每年春梢萌發(fā)前重修剪一次，每隔5～6年，通過嫁接繁殖更新。

9.6 網(wǎng)室保存植株每年調查一次黃龍病、柚矮化病和甜橙莖陷點病發(fā)生情況，每5年鑒定一次裂皮病、碎葉病、溫州蜜柑萎縮病和鱗皮病感染情況。發(fā)現(xiàn)受感染植株，立即淘汰。

10 無病毒母本園的建立與管理

10.1 地點

10.1.1 在黃龍病發(fā)生區(qū)，柑桔無病毒母本園建立在由40目塑料紗網(wǎng)構建的網(wǎng)室內(nèi)，或建立在與其他柑桔種植地的隔離狀況符合GB 5040規(guī)定的田間。

10.1.2 在非黃龍病發(fā)生區(qū)，柑桔無病毒母本園建立在田間，用圍墻或綠籬與其他柑桔種植地隔開。

10.2 無病毒母本樹的種植株數(shù)

每個品種材料的無病毒母本樹在無病毒母本園內(nèi)種植2～6株。

10.3 管理

10.3.1 無病毒母本樹啟用的時間。植株連續(xù)結果3年顯示其品種固有的園藝學性狀后，開始用做母本樹。

10.3.2 柑桔無病毒母本樹的病害調查、檢測和品種純正性觀察以及處理方法

10.3.2.1 每年10—11月，調查黃龍病發(fā)生情況，調查病害的癥狀依據(jù)見附錄B。

10.3.2.2 每年5—6月，調查柚矮化病和甜橙莖陷點病發(fā)生情況，調查病害的癥狀依據(jù)見附錄B。

10.3.2.3 每隔3年，應用指示植物、RT-PCR或血清學技術檢測裂皮病、碎葉病和溫州蜜柑萎縮病感染情況。

10.3.2.4 每年采果前，觀察枝葉生長和果實形態(tài)，確定品種是否純正。

10.3.2.5 經(jīng)過病害調查、檢測和品種純正性觀察，淘汰不符合本規(guī)程要求的植株。

10.3.3 用于柑桔無病毒母本樹的常用工具專用，枝剪和刀、鋸在使用于每株之前，用1%次氯酸鈉溶液消毒。工作人員在進入柑桔無病毒母本園工作前，用肥皂洗手；操作時，人手避免與植株傷口接觸。

11 無病毒采穗圃的建立與管理

11.1 地點

11.1.1 在黃龍病發(fā)生區(qū)，無病毒采穗圃建立在由40目塑料紗網(wǎng)構建的網(wǎng)室內(nèi)，或建立在與其他柑桔種植地的隔離狀況符合GB 5040規(guī)定的田間。

11.1.2 在非黃龍病發(fā)生區(qū)，無病毒采穗圃建立在田間，用圍墻或綠籬與其他柑桔種植地隔開。

11.2 管理

11.2.1 繁殖無病毒采穗植株所用接穗全部采自無病毒母本園。

11.2.2 無病毒采穗圃植株可采集接穗的時間，限于植株在采穗圃種植后的3年內(nèi)。

11.2.3 用于柑桔無病毒采穗圃的常用工具專用，枝剪在使用于每個品種材料之前，用1%次氯酸鈉液消毒。工作人員在進入柑桔無病毒采穗圃工作前，用肥皂洗手；操作時，人手避免與植株傷口接觸。

11.2.4 每年5—6月，調查柚矮化病和甜橙莖陷點病發(fā)生情況；10—11月，調查黃龍病發(fā)生情況，調查病害的癥狀依據(jù)見附錄B，調查中發(fā)現(xiàn)病株，立即挖除。

12 無病毒苗圃的建立與管理

12.1 地點

12.1.1 在黃龍病發(fā)生區(qū)，無病毒苗圃建立在由40目塑料紗網(wǎng)構建的網(wǎng)室內(nèi)，或建立在與其他柑桔種植地的隔離狀況符合GB 5040規(guī)定的田間。

12.1.2 在非黃龍病發(fā)生區(qū)，無病毒苗圃建立在田間，用圍墻或綠籬與其他柑桔種植地隔開。

12.2 管理

12.2.1 繁殖苗木所用接穗全部來自無病毒采穗圃或無病毒母本園。

12.2.2 用于柑桔無病毒苗圃的常用工具專用，枝剪和嫁接刀在使用于每個品種材料之前，用1%次氯酸鈉溶液消毒。工作人員在進入柑桔無病毒苗圃工作前，用肥皂洗手；操作時，人手避免與植株傷口接觸。

12.2.3 苗木出圃前，調查黃龍病、柚矮化病和甜橙莖陷點病發(fā)生情況，調查病害的癥狀依據(jù)見附錄B，發(fā)現(xiàn)病株，立即拔除。

附錄A

（規(guī)范性附錄）

應用指示植物鑒定柑桔病毒病和類似病毒病害的標準參數(shù)

鑒定一植株所需指示植物株數(shù)/株裂皮病 Etrog香櫞的亞利桑那861或861-S-1選系 嫩葉嚴重向后卷 27～40 5病 害 指示植物種類（品種） 鑒定癥狀 適于發(fā)病的溫度/℃碎葉病 Rusk枳橙 葉部黃斑、葉緣缺損 18～26 5黃龍病 椪柑或甜橙 葉片斑駁型黃化 27～32 10柚矮化病 鳳凰柚 莖木質部嚴重陷點 18～26 5甜橙莖陷點病 madam vinous甜橙 莖木質部嚴重陷點 18～26 5溫州蜜柑萎縮病 白芝麻 葉部枯斑 18～26 10鱗皮病 鳳梨甜橙、madam vinous甜橙、dweet桔橙葉脈斑紋，有時春季嫩梢迅速枯萎（休克） 18～26 5頑固病 madam vinous甜橙 新葉小，葉尖黃化 27～38 10木質陷孔病 用快速生長的砧木嫁接的parson專用桔 嫁接口和第一次重剪后分枝處充膠 27～40 5石果病 dweet桔橙、鳳梨甜橙、madam vinous甜橙 橡葉癥 18～26 5來檬從枝病 墨西哥來檬 芽異常萌發(fā)引起的枝葉叢生 27～32 10雜色退綠病 伏令夏橙、哈姆林甜橙 葉正面退綠斑，相應反面褐色膠斑 27～32 10

附錄B

（規(guī)范性附錄）

田間應用目測法診斷黃龍病、柚矮化病和甜橙莖陷點病的癥狀依據(jù)

病 害癥狀依據(jù)黃龍病 葉片轉綠后從葉脈附近和葉片基部開始退綠，形成黃綠相間的斑駁型黃化，發(fā)病初期，樹冠上部有部分新梢葉片黃化形成“黃梢”柚矮化病 小枝木質部陷點嚴重，春梢短、葉片扭曲甜橙莖陷點病 小枝木質部陷點嚴重，小枝基部易折裂，葉片主脈黃化，果實變小

附錄C

（規(guī)范性附錄）

應用快速法鑒定柑桔病毒病和類似病毒病害

方 法病 害血清學A蛋白酶聯(lián)免疫吸附法 溫州蜜柑萎縮病雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法 碎葉病、鱗皮病雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳 裂皮病和木質陷孔病分子生物學多聚酶鏈式反應 黃龍病、來檬叢枝病和雜色退綠病反轉錄多聚酶鏈式反應 裂皮病、木質陷孔病、衰退病和鱗皮病半巢式反轉錄多聚酶鏈式反應 碎葉病