李一帆,陳 東,張大威,薛 輝,劉佳梅

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,吉林長(zhǎng)春 130021;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室;3.廣東醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室;4.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院機(jī)能科學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái))

急性大鼠脊髓損傷Allen's法模型的改良及電生理評(píng)價(jià)

李一帆1,2,陳 東1,3*,張大威4,薛 輝1,劉佳梅1

(1.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室,吉林長(zhǎng)春 130021;2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室;3.廣東醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室;4.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院機(jī)能科學(xué)實(shí)驗(yàn)平臺(tái))

目的 建立一種更實(shí)用、標(biāo)準(zhǔn)、可靠的急性大鼠脊髓撞擊損傷模型,為脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。方法將36只成年雌性Wistar大鼠隨機(jī)分成三組,每組12只。脊髓損傷(SCI)組:用自制改良的Allen's撞擊器,以60gcm致傷力損傷大鼠T10胸椎對(duì)應(yīng)脊髓。假手術(shù)組:只打開椎板,暴露脊髓,不造成SCI。正常對(duì)照組:正常大鼠,不做任何處理。各組定期行為學(xué)觀察(BBB評(píng)分),術(shù)后30天進(jìn)行組織學(xué)觀察和神經(jīng)電生理檢測(cè)。結(jié)果HE染色:假手術(shù)組與正常對(duì)照組基本一致的。SCI組可見灰、白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)不完整,損傷區(qū)可見大片壞死灶、細(xì)胞腫脹。BBB評(píng)分:假手術(shù)組術(shù)后1周功能恢復(fù)接近正常。SCI組術(shù)后第2周開始恢復(fù),到第3周基本停止,最終BBB評(píng)分未超過6分,兩組比較有明顯差異。神經(jīng)電生理(SEP,MEP)檢測(cè):SCI組可以明顯看到SEP與MEP的峰-峰值急劇降低,且潛伏期明顯延長(zhǎng),差異顯著(P＜0.01)。結(jié)論改良后的急性大鼠脊髓損傷模型制作法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好,是較為理想的方法。

動(dòng)物模型;脊髓損傷;BBB評(píng)分;電生理;改良

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1169)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是交通、工礦事故及運(yùn)動(dòng)意外中常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病,損傷所致的截癱嚴(yán)重影響傷者的身心健康,目前,脊髓損傷模型繁多,但尚無統(tǒng)一的分型[1,2]。建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)、理想的SCI實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?是進(jìn)行SCI基礎(chǔ)研究的前提。本研究在Allen's打擊法的基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些改進(jìn),以建立一種更標(biāo)準(zhǔn)化、理想化的大鼠脊髓撞擊損傷模型。

1 材料與方法

1.1 材料

脊髓打擊裝置:自制改良的Allen's撞擊器,均由不銹鋼材料制成,擊打棍直徑4.0mm,打擊頭呈凸形,重量20 g,擊打棍套管內(nèi)直徑4.1mm,套管外側(cè)面有刻度標(biāo)記,可以調(diào)整擊打棍下落高度,范圍為3-10 cm。

1.2 動(dòng)物及分組

36只體重200～250 g雌性健康的Wistar大鼠,由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。常規(guī)飼養(yǎng)于安靜通風(fēng)環(huán)境下,室內(nèi)溫度20～23℃,濕度50%～65%,飼養(yǎng)3 d后手術(shù)。動(dòng)物隨機(jī)分三組,每組12只。正常對(duì)照組,不做任何處理;假手術(shù)組,只打開椎板,暴露脊髓,不造成SCI;脊髓損傷(SCI)組,按下列方法制作模型。

1.3 模型制作及術(shù)后護(hù)理

所有器械經(jīng)高壓蒸汽滅菌。取正常雌性Wistar大鼠,體重 200～250 g,用10%水合氯醛作腹腔麻醉(0.35 m l/100 g),將大鼠俯臥,固定于大鼠固定板上,在背部脊髓兩側(cè)觸摸大鼠最下肋與軟組織分界處(浮肋與第13胸椎連接處)作為骨性定位標(biāo)志,向上、下5 cm范圍備皮、脫毛后用碘酊、酒精常規(guī)消毒,鋪無菌手術(shù)單,在后正中線做縱行切口,大約3 cm,依次切開皮膚、皮下筋膜,暴露椎旁肌,肉眼觀察,可見椎旁肌表面銀白色腱膜,兩側(cè)腱膜在后正中線最接近處,約平對(duì)第10胸椎棘突,用玻璃分針鈍性剝離肌肉暴露棘突、椎板和橫突。參考定位:T9棘突傾向尾側(cè),T10棘突中立位,T11棘突傾向頭側(cè)[5]。確定T10胸椎位置,用骨剪在T9與T10、T10與T11棘突及相應(yīng)椎板之間分別做兩個(gè)橫行剪口,再在T10胸椎兩側(cè),橫突與椎板連接處做縱行剪口,形成一個(gè)方形剪口界線,然后用咬骨鉗咬住T10胸椎棘突用力拉起即“揭蓋”,去除T10椎板,形成方形骨窗,修整骨窗邊緣,充分暴露T10對(duì)應(yīng)的脊髓。用自制改良的Allen's撞擊器制備脊髓損傷動(dòng)物模型,打擊時(shí),用拉鉤拉開脊髓兩側(cè)軟組織,牽拉固定,使脊柱穩(wěn)定,不受呼吸運(yùn)動(dòng)影響,使20 g重量的擊打棍從3 cm高度自由落體,致傷能量60 g?cm,撞擊T10骨窗對(duì)應(yīng)的脊髓,造成急性脊髓損傷,擊打脊髓后,擊打棍不動(dòng),停留3min再移開。撞擊成功標(biāo)準(zhǔn)為:撞擊脊髓組織水腫、出血,硬脊膜完整呈紫紅色,緊張,膨隆,大鼠尾巴出現(xiàn)痙攣性擺動(dòng),雙下肢軀體回縮樣撲動(dòng),呈遲緩性癱瘓。常規(guī)分層縫合后回籠飼養(yǎng)。7 d內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng),7 d后5只合籠飼養(yǎng)。自然光照,定時(shí)定量給以軟飼料喂養(yǎng),飲水不加限制,飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～23℃,濕度50%～60%。術(shù)后開始每日腹腔注射青霉素 8萬U/只,慶大霉素0.2萬U/只,預(yù)防術(shù)后感染,維持7 d。術(shù)后人工排尿,左手撐起小鼠腹部,右手觸摸找到充盈的膀胱,然后按住膀胱底部,自上而下地輕柔擠壓,逼尿排出。擠壓膀胱后,及時(shí)清理會(huì)陰,使其保持干燥,并時(shí)常改變體位。如此人工排尿每日2次,直到動(dòng)物自身排尿反射恢復(fù)。每2～3 d更換一次墊料。大鼠共計(jì)死亡1只,出現(xiàn)在SCI組術(shù)后20 d,解剖后發(fā)現(xiàn)死因?yàn)槟c梗阻,隨后補(bǔ)充SCI組1只入實(shí)驗(yàn)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 組織學(xué)觀察 每組飼養(yǎng)30 d后,各取6只大鼠,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后,將大鼠固定于固定板上,生理鹽水、4%多聚甲醛常規(guī)灌流固定,暴露脊髓T8～T12,迅速取出脊髓組織,4%多聚甲醛后固定4 h,梯度蔗糖脫水,放入OCT中室溫浸10 min,包埋,入冷丙酮中冷凍后,-70℃保存。用恒冷箱切片機(jī)做冠狀面切片,厚16μm,行HE染色。

1.4.2 行為學(xué)觀察 參照Basso等提出并改良的脊髓損傷大鼠功能恢復(fù)評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)即 BBB評(píng)分法[6,7](共21級(jí)),雙盲法對(duì)各組動(dòng)物后肢運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)行評(píng)估,每隔3日定時(shí)記錄大鼠雙后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。

1.4.3 神經(jīng)電生理檢測(cè) 術(shù)后30 d,每組取剩余9只大鼠,做感覺誘發(fā)電位(SEP)和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)檢測(cè)。將受檢大鼠用10%水合氯醛作腹腔麻醉,在頭顱后部,消毒皮膚,切開頭顱后部皮膚,剝離骨膜,用牙科鉆在右側(cè)皮層中央后回感覺區(qū)相對(duì)應(yīng)的冠狀縫后3mm,失狀縫旁1mm處鉆一盲孔;左腿部剪毛,并暴露左腿坐骨神經(jīng)。用Powerlab誘發(fā)電位儀,BL-410生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng),刺激參數(shù):粗電壓 ,強(qiáng)度 3V,波寬1ms,頻率 10 Hz,增益 20 倍 ,濾波300Hz,時(shí)間常數(shù)0.01 s,掃描速度6.25 ms/div。檢測(cè)感覺誘發(fā)電位(SEP)時(shí),刺激電極位于坐骨神經(jīng),記錄電極置于皮層,負(fù)極置于頭皮下參考電極插于椎旁肌,信號(hào)計(jì)算機(jī)連續(xù)疊加100次,方能記錄到該誘發(fā)電位;檢測(cè)運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP)時(shí),刺激電極與記錄電極交換,參考電極位于硬腭下。所有大鼠檢測(cè)完后測(cè)量其潛伏期和峰-峰值,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析和處理

采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 大鼠脊髓組織學(xué)觀察

HE染色可以觀察到假手術(shù)組灰、白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)基本完整,神經(jīng)細(xì)胞在灰質(zhì)中分布均勻、胞體飽滿、形態(tài)正常、細(xì)胞膜完整,白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維排列整齊,細(xì)胞間質(zhì)均勻。SCI組可見灰、白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)不完整,損傷區(qū)灰質(zhì)可見大片出血、大片壞死灶、細(xì)胞腫脹、有的出現(xiàn)囊腔,白質(zhì)內(nèi)神經(jīng)纖維排列不規(guī)則(圖1、2)。

2.2 大鼠行為學(xué)觀察

手術(shù)前所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙后肢BBB評(píng)分均為21分。假手術(shù)組大鼠術(shù)后第1天,后肢出現(xiàn)短暫性活動(dòng)遲緩,第2天功能明顯恢復(fù),且恢復(fù)速度很快,1周后功能恢復(fù)接近正常,BBB評(píng)分接近20分,2周后功能恢復(fù)BBB評(píng)分達(dá)到21分。說明椎板的咬除對(duì)脊髓有一定的傷害,但這種損傷程度是短暫的,輕微的,大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能可迅速恢復(fù)。所有SCI組大鼠在撞擊脊髓損傷后都出現(xiàn)雙后肢癱瘓,只能用前肢拖著軀體移動(dòng),均造模成功。術(shù)后1周內(nèi)未見功能恢復(fù),2周開始恢復(fù),但恢復(fù)緩慢,到第3周基本停止,只能恢復(fù)到后肢3個(gè)關(guān)節(jié)的廣泛活動(dòng)而不能持重行走,SCI組與假手術(shù)組有明顯差異(P＜0.01),而假手術(shù)組與正常對(duì)照組3 d后對(duì)比未見差異(表1)。

圖1 假手術(shù)組脊髓冠狀面,HE染色×100

圖2 SCI組脊髓冠狀面HE染色×100

表1 各組后肢運(yùn)動(dòng)功能的BBB評(píng)分比較(n=12,±S)

表1 各組后肢運(yùn)動(dòng)功能的BBB評(píng)分比較(n=12,±S)

*P＜0.01 vs.SCIgroup;#P＜0.01 vs.Sham group

組別 3天 6天 9天 12天 15天 18天 21天 24天 27天 30天正常對(duì)照組 21*# 21* 21* 21* 21* 21* 21* 21* 21* 21*假手術(shù)組 9.42±0.37*19.56±0.76*20.13±0.82*20.88±0.11* 21* 21* 21* 21* 21* 21*SCI組 0 0.68±0.59 1.85±0.68 2.42±1.03 3.71±1.15 4.69±1.46 5.14±1.27 5.56±1.03 5.56±1.03 5.56±1.03

2.3 神經(jīng)電生理檢測(cè)

從表2、3以及圖3、4可以看出假手術(shù)組SEP與MEP的峰-峰值和潛伏期與正常大鼠相比未見差異,說明椎板的打開對(duì)脊髓上、下行傳導(dǎo)通路基本沒有影響,而SCI損傷組可以明顯看到SEP和MEP的峰-峰值急劇降低,且潛伏期明顯延長(zhǎng),與假手術(shù)組和正常對(duì)照組相比,差異顯著(P＜0.01)。

表2 各組SEP-感覺誘發(fā)電位潛伏期與峰-峰值比較(n=9,±S)

表2 各組SEP-感覺誘發(fā)電位潛伏期與峰-峰值比較(n=9,±S)

*P＜0.01 vs.SCIgroup

組別 潛伏期(mS) 峰-峰值(mV)正常對(duì)照組 2.06±0.02* 0.16±0.01*假手術(shù)組 2.05±0.02* 0.15±0.01*SCI組 5.23±0.26 0.03±0.01

表3 各組MEP-運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛伏期與峰-峰值比較(n=9,±S)

表3 各組MEP-運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位潛伏期與峰-峰值比較(n=9,±S)

*P＜0.01 vs.SCIgroup

組別 潛伏期(mS) 峰-峰值(mV)正常對(duì)照組 2.02±0.02* 80.79±0.55*假手術(shù)組 2.01±0.02* 80.76±0.53*SCI組 4.73±0.35 5.95±1.03

圖3 各組SEP波形

圖4 各組MEP波形

3 討論

A llen's打擊法以一定力量撞擊脊髓后造成脊髓水腫、缺血,并繼發(fā)一系列損傷反應(yīng)致脊髓損傷的典型表現(xiàn),這種模型比較接近人類SCI的病理生理特點(diǎn)及變化規(guī)律,但是也存在一定的缺點(diǎn),例如在原先的Allen's打擊法中,雖然模擬了致傷時(shí)的最初打擊狀態(tài),卻忽略了持續(xù)性的擠壓作用,而在人類急性SCI往往因脊柱骨折存在著持續(xù)性的擠壓作用[8]。同時(shí)因重物下墜撞擊脊髓的瞬間脊柱和脊髓的不穩(wěn)定及脊髓的偏向移位導(dǎo)致?lián)p傷的程度就有差異等。本實(shí)驗(yàn)改良的Allen's撞擊器,擊打棍直徑4.0mm,擊打棍套管內(nèi)直徑4.1mm,可以使擊打棍做自由落體運(yùn)動(dòng),而不會(huì)發(fā)生位置偏移,能夠準(zhǔn)確擊中目標(biāo)區(qū)域,擊打后擊打棍停留3min,與臨床SCI損傷更加接近,同樣的勢(shì)能保證損傷程度一致;擊打棍套管外側(cè)面有刻度標(biāo)記,可以調(diào)整擊打棍下落高度,范圍為3-10 cm,通過選擇擊打棍下落的高度,改變致傷勢(shì)能的大小,復(fù)制出不同損傷程度的SCI模型。

目前國(guó)內(nèi)外在選用大鼠作脊髓損傷模型時(shí),損傷節(jié)段大多數(shù)選擇胸段,但是在具體節(jié)段選定上,從T6-T12不一。本實(shí)驗(yàn)選擇T10胸椎對(duì)應(yīng)區(qū),主要理由一是在臨床上胸段為脊髓損傷最常見部位;二是在T10部位能夠精準(zhǔn)定位,保證模型損傷定位的一致性。在手術(shù)方法上本實(shí)驗(yàn)采用骨剪與咬骨鉗聯(lián)合“揭蓋”,開骨窗的方法,這樣可以很好的保護(hù)骨窗下面的脊髓,有效的避免了去除椎板過程中對(duì)脊髓造成的額外損傷,此方法操作簡(jiǎn)單,出血少,還可以保持硬脊膜的完整性,防止腦脊液外流,同時(shí)防止結(jié)締組織、組織間液、細(xì)菌或其他有害物質(zhì)的侵入。

神經(jīng)電生理檢查包括感覺誘發(fā)電位(SEP)和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(MEP),主要是反映SCI后神經(jīng)傳導(dǎo)功能。自Singer(1970)首次報(bào)道以來,誘發(fā)電位在SCI后的療效評(píng)估及功能評(píng)定方面的重要性逐漸被人們認(rèn)識(shí)[9],作為更加客觀和敏感的一種檢測(cè)方法已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于臨床SCI神經(jīng)功能評(píng)價(jià)[10]。MEP是評(píng)價(jià)下行運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)通路功能狀態(tài)的敏感手段,能直接反映脊髓下行傳導(dǎo)束或外周運(yùn)動(dòng)神經(jīng)的功能狀態(tài),并且與下肢運(yùn)動(dòng)功能有較強(qiáng)的相關(guān)性[11];SEP反映位于脊髓背索的上行傳導(dǎo)通路的功能狀態(tài),兩者結(jié)合可有效檢測(cè)脊髓損傷節(jié)段的損傷程度以及損傷后功能恢復(fù)程度。目前許多監(jiān)測(cè)者采用波幅較基準(zhǔn)下降50%,潛伏期較基準(zhǔn)延長(zhǎng)10%作為異常判定標(biāo)準(zhǔn)[12]。誘發(fā)電位的波幅反應(yīng)誘發(fā)電位的強(qiáng)度,當(dāng)傳導(dǎo)束受損時(shí),表現(xiàn)為波幅降低,峰-峰值減小。潛伏期反應(yīng)神經(jīng)纖維膜的傳導(dǎo)功能,在傳導(dǎo)束受損時(shí),可以使傳導(dǎo)速度減慢,出現(xiàn)潛伏期延長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)用SEP和MEP來檢測(cè)脊髓感覺和運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)功能,發(fā)現(xiàn)SCI組無論是感覺傳導(dǎo)還是運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)功能均未得到明顯恢復(fù),與假手術(shù)組及正常對(duì)照組相差甚遠(yuǎn),受試大鼠MEP的結(jié)果與其后肢運(yùn)動(dòng)功能BBB評(píng)分一致,假手術(shù)組與SCI組的BBB評(píng)分結(jié)果相比較,具有顯著性差異,而這兩項(xiàng)結(jié)果與大鼠脊髓組織學(xué)觀察結(jié)果相吻合。上述結(jié)果,為利用該改良法成功制作急性大鼠脊髓撞擊損傷模型提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之,該改良法克服了Allen's打擊法存在的外力作用時(shí)間不恒定、脊髓損傷程度相差大、范圍不一致、打擊點(diǎn)易偏移等缺陷。此方法能夠?qū)崿F(xiàn)定時(shí)、瞬時(shí)、定點(diǎn)、定高打擊,操作簡(jiǎn)單,受人為因素干擾小,精確度高。只要脊髓暴露適當(dāng),打擊時(shí)可以達(dá)到100%的成功率。目前應(yīng)用本方法已經(jīng)取得不少應(yīng)用成果,本模型制作方法朝著精確、可控制、可重復(fù)及可定量的方向發(fā)展,使動(dòng)物模型的建立更標(biāo)準(zhǔn)化、理想化,極大的提高了實(shí)驗(yàn)組間的可比性,更有利于對(duì)治療效果的量化分析和研究比較。

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Improvement and eletrophysiology assessment of the rats allen'smodel for acute spinal cord injury

LIYi-fan,CHEN Don,ZHANGDa-wei,eta l.(Norman Bethune School of Basic Medical Science,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo establish amore practical,standard and dependablemodel for rats acute spinal cord in jury and to lay the foundation of further research on spinal cord injury(SCI).MethodsThirty-six female ratswere randomly assigned to 3 groups(n=12 pergroup).SCIgroup:SCIwas created with amodified impingerof Allen's by a 60gcm impacting on the T10 spinal cord.Sham group:neural scutewas opened only and spinal cord was exposed without SCI.Normal control group:normal rats.Ethological observation(BBB scores)was done regularly.Histological and electrophysiological tests were done on the 30th day after operation.Resu lts HE staining resultsin Sham group and Normal control groupwere identical,butSCIgroup showed fragmented construction in greymatter and necrosis,and cellular swellingwas detected in injured region.BBB scores revealed thatnearly full functional recovery after operation in Sham group required 1Week.In SCIgroup functional recovery began in 2 ndweek after operation and stop in 3 rd week,and the scores failed toexceed 6 in the final.Significantdifference lay between Sham group and SCIgroup(P＜0.01).Electrophysiological(SEP,MEP)demonstrated that peak-to-peak value dropped sharply and latency was extended obviously in SCI group.ConclusionThismethod can be regarded as a simp ler and idealway whichwasingood reproducibility toestablish the ratsmodel for acute SCI.

Ratsmodel;Spinal cord injury;BBB score;Electrophysiology;Modification

1007-4287(2010)08-1169-04

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(30970739)吉林省科學(xué)技術(shù)廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助(20090726)

*通訊作者

R683.1;R687.32

A

2009-08-07)