解繼勝，張海燕，都鎮(zhèn)先，鄧娓娓，王華芹

（1.右江民族醫(yī)學(xué)院 組織胚胎學(xué)教研室，廣西 百色 533000；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院老年病干診科；3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，沈陽 110001；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化與分子生物學(xué)教研室，沈陽 110001）

近來研究顯示［1］腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）能誘導(dǎo)許多腫瘤細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞基本沒有影響，因而可能成為很有前景的抗癌藥。但甲狀腺惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性具有相當(dāng)?shù)漠愘|(zhì)性［2，3］。因此，TRAIL 凋亡誘導(dǎo)增敏劑的發(fā)現(xiàn)將能有效擴(kuò)展TRAIL的腫瘤治療效應(yīng)。衣霉素是一種天然抗生素，阻止細(xì)胞內(nèi)N端連接寡糖類生物合成的第一步，曾用于TRAIL自發(fā)性耐藥前列腺癌和獲得性耐藥大腸癌治療［4］，但其增加TRAIL抗腫瘤作用分子機(jī)制尚未闡明。為此，本研究以人甲狀腺未分化癌細(xì)胞為對(duì)象，通過TRAIL單用及聯(lián)用衣霉素，探討衣霉素對(duì)TRAIL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的增敏效應(yīng)及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑

甲狀腺未分化癌ARO細(xì)胞株和正常甲狀腺上皮細(xì)胞株HTori-3分別由美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心和歐洲標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心提供。衣霉素和可溶性TRAIL分別購于Sigma公司和R&D公司。以下抗體用于蛋白印記分析：γ-tubulin（Sigma公司），phospho S249 Rb（Abcam 公司），cyclin D1（Santa Cruz生物工程公司）。ECL試劑盒（英國(guó)Amersham生命科學(xué)公司）；脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

2種細(xì)胞均于含10%胎牛血清1640（sigma公司）培養(yǎng)基中、37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，均選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按干預(yù)因素將甲狀腺未分化癌細(xì)胞ARO分為TRAIL組、衣霉素組、TRAIL+衣霉素組（聯(lián)合用藥組）；同時(shí)以正常甲狀腺上皮細(xì)胞株HTori-3為對(duì)照（對(duì)照組）。單藥組為向細(xì)胞中分別加入 0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 μg/ml TRAIL 和 0，1，2.5，5，10，20 μg/mL 衣霉素作用24或48 h；聯(lián)合用藥組為用5 μg/mL衣霉素預(yù)處理 24 h 后，應(yīng)用 0，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 μg/ml TRAIL處理細(xì)胞24 h。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

按照廠商說明利用膜聯(lián)蛋白-PE凋亡檢試劑盒I（BD Bioscience）檢測(cè)細(xì)胞死亡，然后經(jīng)熒光活性細(xì)胞掃描（FACScan）流式細(xì)胞儀分析（Becton Dickinson，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ）。每次試驗(yàn)至少計(jì)數(shù) 500 個(gè)細(xì)胞核，所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次。

1.4 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法

細(xì)胞經(jīng)70%乙醇固定，PBS再水化，碘化丙錠（Sigma）染色，然后利用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法（FACScan，Becton Dickinson）分析DNA容量。細(xì)胞周期分布通過ModFit軟件（Verity Software House）分析。流式細(xì)胞儀對(duì)各組細(xì)胞DNA含量進(jìn)行分析，2N峰代表G0/G1期，交叉峰代表S期，4N峰代表G2/M期。

1.5 Western blot檢測(cè)多種蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，裂解破碎離心后，測(cè)上清蛋白濃度，用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素（PVDF）膜上，以5%脫脂奶粉TBST封閉后，依次加入一抗phospho S249 Rb，cyclin D1；以γ-tubulin為內(nèi)對(duì)照，4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，然后參照ECL試劑盒說明進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯像。

1.6 微小RNA干擾（siRNA）

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的微小干擾RNA序列如下：抗細(xì)胞周期蛋白D1 的 siRNA（sicycD1），GUUCAUUUCCAAUCCGCCC；亂序的無意義 siRNA（scramble，與任何已知基因無同源性，作為對(duì)照），CCGUAUCGUAAGCAGUACU；抗細(xì)胞周期蛋白D1的位點(diǎn)錯(cuò)配（下劃線序列）siRNA（simutcycD1，用于確認(rèn) sicycD1的特異性），GUUCAUUUGGAAUCCGCCC。按照試劑盒說明利用陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。

1.7 構(gòu)建細(xì)胞周期蛋白D1穩(wěn)定過表達(dá)ARO細(xì)胞系

編碼細(xì)胞周期蛋白D1的互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）是利用PCR方法源于人腦cDNA 文庫（Invitrogen，Carlsbad，CA），然后亞克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3。該構(gòu)建物經(jīng)DNA測(cè)序核實(shí)無誤，按照試劑盒說明利用陽離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。對(duì)照細(xì)胞用pcDNA3-Flag轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染細(xì)胞用G418（800 mg/mL）培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，得到陽性克隆后，進(jìn)一步擴(kuò)增培養(yǎng)，利用細(xì)胞周期蛋白D1或Flag抗體通過免疫印跡分析鑒定相關(guān)陽性蛋白表達(dá)細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 衣霉素作用ARO對(duì)TRAIL的敏感性的影響

結(jié)果發(fā)現(xiàn)即使大劑量TRAIL（2 mg/ml）作用48 h，ARO細(xì)胞凋亡率僅為12%（圖1A），表明ARO細(xì)胞抵抗TRAIL的抗腫瘤作用。20 mg/ml的衣霉素單獨(dú)用藥，ARO細(xì)胞凋亡率為11.5%（圖1B）。然而，5 mg/ml衣霉素預(yù)處理24 h后，明顯增加TRAIL誘導(dǎo)的ARO細(xì)胞凋亡，濃度為2 mg/ml時(shí)，ARO細(xì)胞凋亡率可高達(dá)56.5%，與TRAIL組、衣霉素組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）（圖 1C）。TRAIL、衣霉素單藥及兩者聯(lián)合用藥對(duì)HTori-3的生存均無明顯影響，細(xì)胞凋亡率<5%（圖1D）。

2.2 衣霉素對(duì)ARO細(xì)胞G1向S期的進(jìn)展影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示對(duì)照組中G0/G1期細(xì)胞比率為31%，而TRAIL單藥組G0/G1期細(xì)胞比率為34%，兩組間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；衣霉素組與聯(lián)合用藥組中G0/G1期細(xì)胞比率分別為51%和58%，兩組間亦沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與對(duì)照組和TRAIL組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01）。這提示衣霉素可明顯增加G0/G1期細(xì)胞，誘導(dǎo)G1/S期細(xì)胞阻滯。

2.3 衣霉素對(duì)ARO細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白D1和磷酸化Rb蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示衣霉素作用于甲狀腺癌ARO細(xì)胞，減少細(xì)胞周期蛋白D1蛋白表達(dá)的水平。與細(xì)胞周期蛋白D1促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期進(jìn)展的功能相一致，衣霉素導(dǎo)致細(xì)胞周期蛋白D1減少后也引起磷酸化蛋白R(shí)b的顯著下調(diào)（圖2）。

2.4 CyclinD1微小RNA干擾細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感性的影響

sicycD1有效封閉了細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，與衣霉素處理結(jié)果相似；而對(duì)照組及抗細(xì)胞周期蛋白D1的位點(diǎn)錯(cuò)配，即simutcycD1組中cyclinD1的表達(dá)無明顯變化（圖3）。與對(duì)照組及simutcycD1組（約50%）相比，sicycD1及衣霉素組中的細(xì)胞生存率顯著下降，可達(dá)20%左右。

2.5 細(xì)胞周期蛋白D1過表達(dá)對(duì)衣霉素增敏TRAIL作用的影響

我們首先建立了細(xì)胞周期蛋白D1穩(wěn)定過表達(dá)ARO細(xì)胞系（圖4A）。細(xì)胞周期蛋白D1過表達(dá)明顯降低衣霉素的增敏作用（圖4B）。

3 討論

本研究檢測(cè)TRAIL單獨(dú)用藥對(duì)ARO細(xì)胞的毒性作用，與先前報(bào)道相似［5］，ARO細(xì)胞顯示了對(duì)TRAIL治療的抵抗作用。TRAIL誘導(dǎo)甲狀腺癌凋亡的效應(yīng)各異和許多腫瘤本身或通過治療而獲得的對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的抵抗，限制了TRAIL治療腫瘤的療效。衣霉素已被用于增敏前列腺癌的自發(fā)TRAIL抵抗和結(jié)腸癌獲得性的TRAIL抵抗。先前報(bào)道［4］證實(shí)衣霉素通過上調(diào)CHOP及其隨后的DR5表達(dá)而增敏前列腺癌的TRAIL效應(yīng)，但我們先前用衣霉素處理的甲狀腺癌ARO中未見到上調(diào)的DR5表達(dá)［6］。本研究結(jié)果證實(shí)衣霉素通過下調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)而增敏了甲狀腺癌細(xì)胞ARO對(duì)TRAIL的效應(yīng)。

有報(bào)道證實(shí)衣霉素可阻斷G1/S細(xì)胞周期進(jìn)程［7，8］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，并且先前研究［9～11］提示能夠阻滯細(xì)胞停留在細(xì)胞周期G1期的藥物能夠提高TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。細(xì)胞周期蛋白D1是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，據(jù)報(bào)道［12］其通常過度表達(dá)于甲狀腺癌，更常見于未分化甲狀腺癌。細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)受抑使細(xì)胞停滯于G1期，不能進(jìn)入細(xì)胞有絲分裂的S期，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖受抑，細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)衣霉素處理癌細(xì)胞后出現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)下調(diào)。細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)下調(diào)在衣霉素增敏TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的重要作用，亦被我們通過沉默細(xì)胞周期蛋白D1可增敏TRAIL的凋亡效應(yīng)的觀察所證實(shí)；反之，強(qiáng)制細(xì)胞周期蛋白D1過表達(dá)可降低衣霉素介導(dǎo)的TRAIL增敏效應(yīng)。因此，認(rèn)為細(xì)胞周期蛋白D1可能是甲狀腺癌TRAIL抵抗的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者之一，衣霉素的TRAIL增敏效應(yīng)可能至少部分源于通過衣霉素介導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)受抑。鑒于許多甲狀腺癌中細(xì)胞周期蛋白D1均被擴(kuò)增和過表達(dá)，因此這些腫瘤可能更適于衣霉素和TRAIL的聯(lián)合治療。

我們的研究顯示衣霉素和TRAIL聯(lián)合處理對(duì)甲狀腺未分化癌ARO細(xì)胞產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒作用，而對(duì)分化的甲狀腺上皮細(xì)胞HTori-3無顯著影響。因此，對(duì)于TRAIL抵抗的甲狀腺癌，TRAIL聯(lián)合亞毒性劑量的衣霉素治療可能會(huì)成為潛在的有效策略，但尚需大規(guī)模的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床前期試驗(yàn)的進(jìn)一步證實(shí)。

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