曹 昭,萬 敏,孫陸果,胡小平,于永利,王麗穎,張培因*

(吉林大學白求恩醫(yī)學院1.分子生物學教研室;2.免疫學教研室,吉林 長春 130021)

兩種尿素濃度測定方法的比較

曹 昭1,萬 敏1,孫陸果1,胡小平1,于永利2,王麗穎1,張培因1*

(吉林大學白求恩醫(yī)學院1.分子生物學教研室;2.免疫學教研室,吉林 長春 130021)

*通訊作者

血清尿素作為臨床檢測腎小球濾過功能的一項指標被廣泛應用,目前主要測定方法有尿素酶速率法、尿素酶電極法[1]、二乙酰一肟法[2]和流動注射分析法[3]等,其中二乙酰一肟法應用最為廣泛,但具有線性范圍窄、反應時間長、易褪色和影響因素多等的缺點。為了克服這些不足,建立了一種快捷、方便的尿素檢測方法-對對二甲基氨基苯甲醛顯色法[4],其原理是對二甲基氨基苯甲醛可以與尿素反應生成帶檸檬黃綠色的物質,顏色的與一定濃度范圍的尿素呈線性相關。此外,該反應的最佳反應溫度25℃,顯色時間5 min就達到穩(wěn)定,即可進行比色測定。通過對兩種不同方法的測定結果比較,探討對二甲基氨基苯甲醛顯色法代替二乙酰一肟法,作為尿素含量測定方法的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 722型分光光度計。100 mmol/L尿素標準液;179.9 mmol/L二乙酰一肟溶液;顯色劑:二甲基氨基苯甲醛0.2 g,溶于9 ml無水乙醇后,加入1 ml濃鹽酸。酸性試劑:離子水約 100 ml,然后加入濃硫酸44 ml、85%磷酸66 ml。冷至室溫后,加入氨基硫脲50 mg及硫酸鎘2 g,溶解后稀釋至1 L。

1.2 方法

二乙酰一肟法 取尿素標準液在0-25 mmol/L范圍內,從高到底稀釋為5個濃度后,分別取0.01 ml加入各試管中后,加入5 ml酸性試劑和0.5ml二乙酰一肟溶液,混勻,置沸水浴加熱12 min,取出置冷水中冷卻5 min,以超純水調零,測定A540吸收測定值,做出標準曲線,計算樣品的尿素濃度。

對二甲基氨基苯甲醛顯色法 取尿素標準液在0～70 mmol/L范圍內,從高到底稀釋為稀釋為7個濃度,分別取0.5 ml加入各試管中后,加入5.25 ml超純水和0.5 ml顯色液。以超純水調零,測定A420吸收值,做出標準曲線,計算樣品的尿素濃度。

2 結果

2.1 標準曲線及線性方程

取濃度為100 mmol/L的尿素標準液,用超純水稀釋成各種不同濃度的樣品,用兩種方法分別按濃度從低到高、在從高到低的順序測定兩次后取平均值,將理論值(Y)與測定值(X)作線性回歸分析,二乙酰一肟法和對二甲基氨基苯甲醛顯色法分別在尿素溶液濃度為1 mmol/L-25 mmol/L和1 mmol/L-70 mmol/L范圍內符合郎伯-比爾定律,其回歸曲線見圖1,線性方程見表1。

圖1 標準曲線和線性范圍

表1 兩種方法的線性實驗結果

2.2 精密度對比試驗

取3個不同濃度的尿素溶液,分別用二乙酰一肟法和對二甲基氨基苯甲醛顯色法重復測定7次后,取平均值進行計算,其相對標準差分別為1.00-2.12、0.98-2.80,兩種方法對同一樣品的測定結果,經統(tǒng)計學分析,P＞0.05,無統(tǒng)計學意義,見表2。

表2 兩種測定方法的精密度對比(n=7)

2.3 回收率對比試驗

取3個不同濃度的尿素溶液,分別加入5 mmol/L尿素標準液,用二乙酰一肟法和對二甲基氨基苯甲醛顯色法重復測定7次后,取平均值進行計算,其回歸率分別為 98.3%-102.4%和 99.2%-102.3%,見表3。

表3 兩種測定方法的回收率對比(n=7)

3 討論

本研究結果顯示,二乙酰一肟法和對二甲基氨基苯甲醛顯色法測對同一尿素樣品連續(xù)測定,其回收率分別為98.3%-102.4%和99.2%-102.3%,結果無統(tǒng)計學差異,但對二甲基氨基苯甲醛顯色法的測定范圍大于二乙酰一肟法。二乙酰一肟法是應用最為廣泛,需要設備簡單,容易實現(xiàn),但需要加熱及冷卻,尤其是在標本數(shù)量多時,加熱開始難以達到100℃,各管間受熱溫度也可能不一致,而且具有線性范圍窄、反應時間長、易褪色等缺點(每小時小于5%)。為了克服這些缺點,研究者們[5-8]進行了諸多的改進,以提高其線性范圍、減少褪色,但均不能徹底解決。本室建立對二甲基氨基苯甲醛顯色法,與二乙酰一肟法比較,該方法檢試劑單一、操作簡單、顯色時間短且穩(wěn)定、線性范圍大、準確度高、精密度好,方法標準曲線線性關系良好,不需要特殊設備,能滿足檢測工作的要求,適應于基礎實驗室及相關部門的常規(guī)檢測。

[1]孫國林,周昭勤,徐海紅,等.三種血清尿素測定方法的比較[J].中國煤炭工業(yè)醫(yī)學雜志,2007,10(6):639.

[2]孫 蘭,胡毅志,胡國媛.游游池水總尿素的測定-二乙酰一肟-硫氨脲分光光度計法[J].環(huán)境與健康雜志,1995,12(4):176.

[3]莊景新,任永清.兩種方法測定游泳池水中尿素的比較[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2009,19(6),1269.

[4]林新華,李清祿,黃金英.酶催化反應抑制動力學光度法測定微量醌氫醌[J].福建農業(yè)大學學報,1996,25(1):114.

[5]鄭 婕,丁哄強.二乙酰一肟法測定游泳池水中尿素的改進[J].環(huán)境與健康雜志,2000,17(4):233.

[6]嚴小蓉.游泳池水中尿素檢測方法改進[J].中國實用醫(yī)藥,2009,4(5):27.

[7]黃麗君,吳富忠,王 恒.游泳池水中尿素二乙酰一肟檢測方法的改進[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2008,18(7):1431.

[8]陳武明,陳 波,徐明敏.游泳池水中尿素檢測方法改進探討[J].浙江預防醫(yī)學,2008,20(11):95.

1007-4287(2010)01-0135-02

曹昭(1979-),男,博士,從事重組蛋白質的表達、純化及功能研究。

2009-01-26)