鄭亦胡，周蒙滔，單云峰，張啟瑜

(溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院 普通外科，浙江 溫州 325000)

近年來，大量研究證實三氧化二砷在體外對于多種惡性腫瘤細胞具有誘導凋亡作用，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、肝細胞癌、鼻咽癌、膽囊癌、宮頸癌和子宮內膜癌[1-2]，但是對于三氧化二砷誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制卻仍然存在爭議。下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達是一種重要的作用機制[2-4]。最新的研究卻發(fā)現，Bcl-2具有細胞保護和破壞兩種表型，其不同的表型被其蛋白構象所調控[5]，這種構象的改變可以使Bcl-2從一個細胞保護作用變成破壞作用。本實驗擬研究三氧化二砷是否能夠誘導SGC7901胃癌細胞凋亡并觀察Bcl-2的表達量和表型的變化，探討其誘導凋亡的機制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 三氧化二砷購自哈爾濱伊達藥業(yè)公司，濃度：10 mg/10 mL。RPMI1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Invitrogen公司?？笲cl-2 N端兔多抗IgG、抗Bcl-2鼠單抗IgG、抗β-actin鼠單抗IgG1購自美國Santa Cruz公司。抗Bcl-2 BH3結構域抗體購自美國Abgent公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗鼠二抗、Cy3 標記的抗兔IgG、DAPI染料購自碧云天生物研究所。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所。哺乳動物蛋白抽提試劑購自美國Thermo Scientific公司。聚偏二氟乙烯 (PVDF)膜購自美國Millipore公司。ECL化學發(fā)光檢測試劑盒購自美國Pierce公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株SGC7901購自中科院上海細胞研究所，予含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，在5% CO2飽和濕度的37 ℃孵箱中培養(yǎng)，細胞長滿后經胰酶消化法傳代。

1.3 實驗設計 首先使用細胞毒檢測求得三氧化二砷作用SGC7901胃癌細胞24 h的50%細胞死亡的濃度（IC50），再用IC50的濃度作用SGC7901胃癌細胞，爾后進行細胞核形態(tài)分析、Bcl-2表型和Bcl-2表達的檢測。

1.4 細胞毒檢測 細胞以1.5×104個/cm2的密度接種于100μL的96孔板中預培養(yǎng)24 h。使用含0.1% BSA的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細胞同步化。爾后被不同濃度的三氧化二砷分別處理24 h，利用日本同仁化學研究所生產的CCK-8試劑盒進行細胞毒檢測，根據廠家的操作手冊進行操作。按公式計算：細胞生長抑制率（%）=（1- 實驗組光密度值/對照組光密度值）×100%。

1.5 凋亡細胞核形態(tài)分析 細胞以1.5×104個/cm2的密度，接種于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷處理24 h。細胞經4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。在暗室中經1μg/mL的DAPI染色15 min后，使用免疫熒光顯微鏡進行觀察（波長為340～380 nm、放大倍數為1000）。

1.6 Bcl-2的表型觀察和檢測 細胞以1.5×104個/cm2的密度，接種于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷處理24 h。經4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。使用1%的Triton X-100做透膜處理后，再使用5%的小牛血清蛋白進行封閉，添加一抗（1:50）在4 ℃過夜孵育，然后加入Cy3標記的二抗（1:100）在室溫下孵育2 h，最后加入1μg/mL的DAPI復染細胞核。使用免疫熒光顯微鏡進行觀察（放大倍數為1000）。一抗包括：抗Bcl-2 N端抗體、抗Bcl-2 BH3結構域抗體。

1.7 Western Blot蛋白印跡法檢測Bcl-2的表達 細胞以1.5×104個/cm2的密度接種于75 cm2大小的培養(yǎng)瓶中，經10μmol/L的三氧化二砷處理24 h。胰酶消化后收集細胞。蛋白抽提方法和Western Blot蛋白印跡法參照美國Pierce公司說明書。使用BCA法測定蛋白濃度，β-actin作為參照。

1.8 統計學處理方法 細胞毒檢測獲得的數據采用單因素方差分析，Western Blot獲得的數據采用t檢驗。

2 結果

2.1 細胞毒檢測 SGC7901細胞經不同濃度的三氧化二砷分別處理24 h后，顯示三氧化二砷誘導的死亡表現出對劑量的依賴關系。各濃度間相比差異有顯著性（P<0.05）。經三氧化二砷處理24 h，SGC7901細胞50%細胞的死亡濃度（IC50）約為10μmol/L（見圖1）。

圖1 三氧化二砷對SGC7901細胞毒性的影響

2.2 凋亡的檢測 未經三氧化二砷處理的正常細胞細胞核核膜光滑、核質均一；經三氧化二砷處理24 h后的細胞核具有凋亡細胞核的特征性核形態(tài)，如細胞核呈折縫樣，染色質出現濃縮，核膜破裂，染色質固縮，細胞核裂解為碎塊等（見圖2）。

圖2 細胞核形態(tài)分析：A為正常的SGC7901細胞核；B～F為經10μmol/L的三氧化二砷處理24 h后的細胞核

2.3 Bcl-2的表型變化 使用抗Bcl-2 N端的抗體得知SGC7901細胞高度表達Bcl-2總蛋白。未經三氧化二砷處理的細胞使用抗BH3結構域的Bcl-2抗體染色后，顯示非常弱的染色，而經三氧化二砷處理24 h后的細胞呈現強的抗BH3結構域的Bcl-2抗體染色（見圖3）。

圖3 Bcl-2的表型觀察和檢測：A、B為未經三氧化二砷處理的SGC7901細胞，分別使用抗Bcl-2 N端和抗BH3結構域的抗體進行染色；C為經10μmol/L的三氧化二砷處理24 h后的SGC7901細胞，使用抗BH3結構域的Bcl-2抗體進行染色

2.4 Bcl-2的表達 Bcl-2的表達在三氧化二砷處理前和處理24 h相比差異無顯著性（P>0.05）（見圖4）。

圖4 Western Blot檢測SGC7901細胞的Bcl-2表達：Lane 1為未經三氧化二砷處理的細胞；Lane 2為經三氧化二砷處理24 h后的細胞

3 討論

三氧化二砷除了在新診斷和復發(fā)的急性早幼粒白血病中被證實具有療效外，還可能是極其有希望治療其他腫瘤的藥物。目前已知三氧化二砷可以調節(jié)胞內的多種信號傳導途徑，包括阻止端粒酶的活性、誘導活性氧或者通過胞外的信號傳遞酶、Akt酶、NF-kB轉錄因子等抑制促細胞生長的信號途徑。三氧化二砷誘導腫瘤細胞的凋亡很大程度上依賴于對Bcl-2的調控。但是，目前對于Bcl-2在腫瘤中所扮演的角色仍然存在爭議?？傮w來說，Bcl-2的高度表達與多種腫瘤對化療藥物的抵抗呈正相關，并且過去的研究顯示在多種腫瘤細胞中過度表達Bcl-2是一個不利的預后因素。由于Bcl-2在嗅覺的成神經細胞瘤中普遍表達，通過研究Bcl-2的免疫反應活動和新輔助化療對腫瘤療效的相關性，證實Bcl-2的表達可能跟較差的預后存在聯系[6]。但是也有研究顯示在一些腫瘤中高度的Bcl-2表達卻和有利的因素及良好的預后相關。系統性的文獻回顧表明在非小細胞肺癌患者的幸存者中，Bcl-2的過度表達是一個良好預后的指標[7]。同樣在結直腸癌中，Bcl-2的表達與有利的因素及良好的預后有關[8]，在口腔鱗癌中則與全面提高的生存率有關[9]。因此我們觀察到SGC7901細胞經三氧化二砷誘導凋亡后發(fā)生Bcl-2表型的變化是一個極其重要的現象并且富有意義。因為長期以來，在研究三氧化二砷對腫瘤細胞的作用時，人們一直把目光停留在Bcl-2表達量的改變上面，未從Bcl-2的表型變化來探討三氧化二砷誘導腫瘤細胞凋亡的作用機制，而且目前國內外均鮮有相關文獻的報道。我們的研究證實了有兩種表型的Bcl-2共存于SGC7901細胞中，經三氧化二砷誘導凋亡后，促生存表型的Bcl-2將會向促凋亡表型的Bcl-2轉變。因此我們得出Bcl-2表型的改變可能參與了三氧化二砷誘導SGC7901細胞凋亡作用的結論。同樣我們的研究為在一些臨床資料中觀測到的Bcl-2相反的生物學活動性提供了合理的解釋：Bcl-2的表達和預后存在怎樣的關系可能主要取決于細胞中促生存的Bcl-2表型和促凋亡的Bcl-2表型的比例，而不是Bcl-2總的表達量。展望未來，我們的研究還為腫瘤的靶向治療提供了一個新的視角：對于那些高度表達Bcl-2的腫瘤，設計開發(fā)針對促進Bcl-2表型轉化的藥物可能比單純拮抗Bcl-2的抗腫瘤藥物是一個更好的選擇。

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