陳 敏， 熊麗琴， 李富友

復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系和先進(jìn)材料實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像技術(shù)與靶向成像應(yīng)用

陳 敏， 熊麗琴， 李富友

復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系和先進(jìn)材料實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

上轉(zhuǎn)換發(fā)光是指稀土離子吸收兩個(gè)或兩個(gè)以上低能光子 (近紅外光)而輻射一個(gè)高能光子(可見光)的發(fā)光現(xiàn)象。與傳統(tǒng)紫外激發(fā)相比，上轉(zhuǎn)換發(fā)光由于采用近紅外光激發(fā)而具有高的組織穿透深度、弱的生物樣品損傷且無生物樣品自發(fā)熒光，這些優(yōu)點(diǎn)表明上轉(zhuǎn)換發(fā)光在生物成像方面具有廣闊的應(yīng)用前景。文章介紹了基于稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光過程的顯微成像技術(shù)和活體成像技術(shù)，及其在腫瘤靶向成像領(lǐng)域的應(yīng)用。

上轉(zhuǎn)換發(fā)光；稀土納米材料；生物成像；靶向

0 引 言

隨著生物醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，重大疾病的早期診斷和發(fā)病機(jī)制的研究迫切需要相關(guān)科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展?？梢暬纳锍上窦夹g(shù)在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域扮演著越來越重要的角色。相比于其它生物成像技術(shù)而言，熒光成像具有價(jià)格低廉、成像快速的特點(diǎn)，并具有分子水平的敏感性 (單分子成像)[1]。其中，熒光探針在熒光成像中起到對觀察對象進(jìn)行標(biāo)記和示蹤的作用[2]。有機(jī)熒光團(tuán)是人們最早用于染色生物樣品的發(fā)光材料，也是目前使用最為廣泛的熒光探針，但其光穩(wěn)定性差，不適于長時(shí)間連續(xù)觀察；此外，其吸收和發(fā)射帶較寬，Stokes位移較小，在多色成像時(shí)易串色。半導(dǎo)體量子點(diǎn)具有光穩(wěn)定性好且發(fā)射峰窄的特點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)研究中備受重視[3,4]。但是，半導(dǎo)體量子點(diǎn)的潛在生物毒性和化學(xué)不穩(wěn)定性限制了它在生物成像領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用。而且，熒光染料和量子點(diǎn)通常是用高能量紫外(ultraviolet，UV)或者可見光作為激發(fā)光，帶來了一些明顯的缺點(diǎn)，如較低的光穿透深度、可能的生物組織破壞，以及生物樣品的自發(fā)熒光等。

近年來，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料 (upconversion nanophosphors，UCNPs)作為新一代生物發(fā)光標(biāo)記，受到了人們的廣泛關(guān)注。上轉(zhuǎn)換發(fā)光 (upconversion luminescence，UCL)是指稀土離子吸收兩個(gè)或兩個(gè)以上低能光子而輻射一個(gè)高能光子的發(fā)光現(xiàn)象，通常是指近紅外(near infrared，NIR)光轉(zhuǎn)換為可見光[5]。迄今為止，上轉(zhuǎn)換材料主要是摻雜稀土元素的固體化合物，利用稀土元素的亞穩(wěn)態(tài)能級特性，可以吸收多個(gè)低能量的長波輻射，從而使人眼看不見的紅外光變成可見光 (圖1)。相比有機(jī)熒光染料和量子點(diǎn)等下轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記而言，上轉(zhuǎn)換發(fā)光標(biāo)記因采用近紅外連續(xù)激光作為激發(fā)源，具有較深的光穿透深度、無生物背景熒光干擾、對生物組織幾乎無損傷等顯著優(yōu)勢[6～9]。這些特征使UCNPs在生物成像領(lǐng)域擁有巨大的應(yīng)用前景。

1 單光子激發(fā)發(fā)光、雙光子激發(fā)發(fā)光及上轉(zhuǎn)換發(fā)光的成像形式比較

稀土的上轉(zhuǎn)換發(fā)光是一個(gè)連續(xù)光激發(fā)的多光子發(fā)光過程，它不同于普通的單光子發(fā)光和雙光子熒光過程[5]。我們對UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光的成像形式、有機(jī)染料 (以羅丹明B為例)的單光子及雙光子激發(fā)發(fā)光的成像形式進(jìn)行了比較 (圖2)，發(fā)現(xiàn)三者有顯著的差別。在羅丹明B的單光子激發(fā)中，除了焦點(diǎn)處的染料分子產(chǎn)生熒光，焦平面上下的染料分子也被激發(fā)產(chǎn)生熒光 (圖2A)。非焦面的熒光會嚴(yán)重地影響焦面處的圖像，為了消除非焦面發(fā)光的影響，共聚焦熒光顯微鏡采用了針孔技術(shù)。在羅丹明B的雙光子激發(fā)中，由于激發(fā)功率和發(fā)射強(qiáng)度存在平方關(guān)系，只有激光束聚焦的焦點(diǎn)處的染料分子被有效激發(fā)而發(fā)光 (圖2B)；因此，雙光子熒光成像具有內(nèi)在的三維分辨率，不需要使用針孔技術(shù)。對UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光而言，沿著激發(fā)光的路徑都有上轉(zhuǎn)換發(fā)光 (圖2C)。此外，稀土離子的摩爾吸光系數(shù)很低，對激發(fā)光的能量改變很小，因此上轉(zhuǎn)換發(fā)光在焦平面上方和下方呈對稱的圓錐形分布。用980 nm飛秒激光激發(fā)得到的結(jié)果與上述現(xiàn)象相同。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因源于UCNPs獨(dú)特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光機(jī)制，在這一過程中，多光子的吸收和能量轉(zhuǎn)移是通過一系列實(shí)際存在的中間能級實(shí)現(xiàn)的，表現(xiàn)為激發(fā)功率和UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光強(qiáng)度之間存在非線性關(guān)系。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光的成像形式明顯不同于有機(jī)染料的單光子及雙光子激發(fā)發(fā)光的成像形式。同時(shí)，非焦面的上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號對UCNPs用于生物成像非常不利[6]。

圖2 有機(jī)染料的單光子(A)、雙光子(B)激發(fā)發(fā)光及UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光(C)的成像原理和形式，以及激發(fā)光通過物鏡聚焦之后的光子分布示意圖(D)[6]焦點(diǎn)處的光子密度最大，隨著與焦點(diǎn)的距離增大，光子密度迅速下降Fig.2 Principles and imaging modalities of single-photon emission(A),two-photon emission(B),and upconversion luminescence(UCL)(C),and the spatial compression of photons by the objective lens is shown in part (D)[6]The excitation photon density is greatest at the focal spot and rapidly decreases with distance from this region

2 基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的顯微成像技術(shù)

基于上述工作，2009年，我們發(fā)展了激光掃描上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微成像 (laser scanning up-conversion luminescence microscopy,LSUCLM)技術(shù)，圖3給出了激光掃描上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微鏡的光路圖。激光器發(fā)出的980 nm連續(xù)激光，首先通過整合掃描鏡，然后被物鏡聚焦到樣品上；從掃描點(diǎn)上產(chǎn)生的發(fā)射光被整合掃描鏡反射，然后通過一個(gè)反式的激發(fā)二色分鏡 (短通)，以濾掉980 nm激發(fā)光；發(fā)射光隨后通過共聚焦針孔和一個(gè)選擇收集波長范圍的狹縫光柵或帶通濾光片，最后進(jìn)入光電倍增管而被檢測。其中，引入共聚焦針孔技術(shù)可以有效地消除非焦面的上轉(zhuǎn)換發(fā)光的干擾，同時(shí)避免了焦面內(nèi)散射光的影響，從而提高分辨率。由于共聚焦針孔技術(shù)具有“光學(xué)切片”能力，用LSUCLM可以對上轉(zhuǎn)換發(fā)光圖像進(jìn)行三維重建，實(shí)現(xiàn)三維上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像[6]。

圖3 (A)LSUCLM的光路圖；(B)DiI與UCNPs同時(shí)標(biāo)記的單個(gè)活HeLa細(xì)胞成像圖像[6]Fig.3 (A)Laser path diagram of LSUCLM;(B)Image of a live HeLa cell dual-labeled with DiI and UCNPs[6]

我們還考察了LSUCLM成像的靈敏度和光漂白能力。用DiI(紅色)和低濃度(50 μg/mL)的UCNPs(綠色)對活細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記 (圖3)。值得注意的是，盡管UCNPs的上轉(zhuǎn)換發(fā)光信號的收集范圍 (500～600 nm)已經(jīng)覆蓋了DiI信號采集范圍 (560～600 nm)，單細(xì)胞的上轉(zhuǎn)換發(fā)光圖像上仍然沒有來自DiI和自發(fā)熒光的信號。這歸功于傳統(tǒng)發(fā)光材料對980 nm光的單光子吸收很弱，且傳統(tǒng)發(fā)光材料在連續(xù)光激發(fā)下同時(shí)吸收兩個(gè)光子的幾率很低。因此，以UCNPs為探針的LSUCLM成像方法，能夠完全消除來自內(nèi)源性熒光物質(zhì)和同時(shí)標(biāo)記的熒光染料的背景干擾，對所要成像的對象具有高靈敏度。我們進(jìn)一步將LSUCLM用于UCNPs和有機(jī)染料 (DAPI、DiI)共染色的HeLa細(xì)胞成像，考察了UCNPs的光穩(wěn)定性。如圖4所示，980 nm連續(xù)激光的持續(xù)照射對UCNPs和有機(jī)染料的光漂白很弱，和普通共聚焦顯微成像相比，LSUCLM的光漂白更弱[6]。

圖4 LSUCLM和普通共聚焦熒光顯微成像的光漂白情況比較[6]DAPI、DiI和UCNPs的發(fā)光信號分別用藍(lán)色、紅色和綠色表示。(A)使用高功率980 nm連續(xù)激光 (焦面處功率為～19 mW)激發(fā)UCNPs，同時(shí)使用低功率的405和543 nm激光 (焦面處功率分別為～15和0.8 μW)分別激發(fā)DAPI和DiI；(B)同時(shí)使用高功率的405、543和980 nm激光 (焦面處功率分別為～1.6、0.13和19 mW)Fig.4 Comparison of photobleaching in LSUCLM and conversional confocal microscopy imaging[6]The luminescence signals of DAPI and DiI are shown in blue and red,respectively,and that of UCNPs is displayed in green in the pseudocolor image.(A)Excitation was provided by a CW laser at 980 nm at a high power(～19 mW in the focal plane),whereas the excitations at 405 and 543 nm were controlled at a very low power(～15 and 0.8 μW in the focal plane for 405 and 543 nm,respectively)；(B)Simultaneous excitations was provided by CW lasers at 405,543 and 980 nm with powers of approximately～1.6,0.13,and 19 mW in the focal plane,respectively

和傳統(tǒng)的單光子、雙光子熒光成像技術(shù)相比，以UCNPs為發(fā)光探針的LSUCLM由于采用了980 nm連續(xù)激光作為激發(fā)源，具有很多獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：1)對有機(jī)染料和UCNPs的光漂白均非常低，可用于長期成像；2)完全消除了來自內(nèi)源性熒光物質(zhì)和同時(shí)標(biāo)記的熒光染料的背景干擾，對所要成像的對象具有超高的選擇性和靈敏度；3)使用廉價(jià)的近紅外連續(xù)激光器作激發(fā)光源，有望被更多的研究者使用；4)可以和普通共聚焦熒光成像系統(tǒng)很好地聯(lián)用，可以對UCNPs和有機(jī)熒光染料等多種探針同時(shí)標(biāo)記的生物樣品成像，能顯示復(fù)雜的生物樣品中更多的細(xì)節(jié)。由于LSUCLM具有上述優(yōu)勢，這一成像技術(shù)在化學(xué)、材料科學(xué)、生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景[6]。

3 基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的活體成像技術(shù)

熒光活體成像技術(shù)使研究人員能夠直接觀察活體動物體內(nèi)的基因表達(dá)和細(xì)胞活動，正在被越來越廣泛地應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域[10～12]。然而，生物樣品的自發(fā)熒光會在活體成像過程中顯得更加突出，對標(biāo)記分子的熒光信號造成非常嚴(yán)重的干擾。基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的激光掃描上轉(zhuǎn)換發(fā)光顯微成像技術(shù)，能夠很好地解決細(xì)胞內(nèi)的背景熒光干擾，從而實(shí)現(xiàn)在無自發(fā)熒光環(huán)境下的信號探測[6]。但動物活體成像自發(fā)熒光干擾的問題尚未解決，仍然需要進(jìn)一步的研究。為此，我們搭建了一臺穩(wěn)態(tài)激光泵浦上轉(zhuǎn)換發(fā)光小動物活體成像系統(tǒng)。如圖5所示，半導(dǎo)體激光器 (中心波長為980 nm)產(chǎn)生的穩(wěn)態(tài)激光束均通過光纖導(dǎo)入，沿激光束前進(jìn)方向上依次放置擴(kuò)束透鏡和光束整形鏡，在兩束激光束側(cè)下方放置樣品臺，小動物位于樣品臺上；通過發(fā)射濾光片選擇一定波長范圍的信號，由EMCCD接收。我們利用該系統(tǒng)成功地將稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像技術(shù)用于小動物活體成像。在成像過程中，只需將小動物麻醉而不需要將其處死、解剖，便可在成像系統(tǒng)上進(jìn)行觀察。這充分顯示了該系統(tǒng)能夠直接對具有上轉(zhuǎn)換發(fā)光性質(zhì)的材料進(jìn)行安全和實(shí)時(shí)的活體成像。

圖5 基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的活體成像系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)裝置示意圖[7]半導(dǎo)體激光器 (中心波長為980 nm)采用輸出功率為0～5 W可調(diào)的激光器，檢測器是Andor DU897 EMCCDFig.5 Diagram depicts the experimental setup for the up-conversion luminescencein vivoimaging system[7]Two external 0～5 W adjustable CW 980 nm lasers were used as the excitation sources,and an Andor DU897 EMCCD was used as the signal collector

多年來，對熒光顯微成像技術(shù)的改進(jìn)主要集中在減少背景熒光、降低光漂白、降低設(shè)備成本等方面?；谏限D(zhuǎn)換發(fā)光的活體成像系統(tǒng)安裝半導(dǎo)體激光器 (中心波長為980 nm)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)該系統(tǒng)是一種高靈敏度的成像技術(shù)，生物樣品內(nèi)源性熒光物質(zhì)和常用的有機(jī)熒光染料不具備上轉(zhuǎn)換發(fā)光性能，這使得該系統(tǒng)能有效地消除生物樣品自發(fā)熒光和有機(jī)熒光染料發(fā)光等背景熒光的干擾；2)該系統(tǒng)是一種能對生物樣品進(jìn)行較長時(shí)間連續(xù)觀察的成像技術(shù)，由于穩(wěn)態(tài)激光泵浦的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料在穩(wěn)態(tài)近紅外激光激發(fā)下幾乎不被光漂白，而且穩(wěn)態(tài)近紅外激光對有機(jī)熒光染料的光漂白很弱，對生物樣品的損傷?。?)該系統(tǒng)價(jià)廉，易于推廣。與雙光子熒光探針采用昂貴的飛秒激光器相比，采用980 nm連續(xù)光半導(dǎo)體激光作為激發(fā)光源，價(jià)格低廉，易于普及[7]。

4 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料在腫瘤靶向成像中的應(yīng)用

腫瘤細(xì)胞表面存在這樣一些特異性的受體，會在腫瘤組織中過度表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)。借助這些受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，利用配體-受體的高度結(jié)合能力，將所結(jié)合的特異性配體靶向轉(zhuǎn)運(yùn)到特定的組織和細(xì)胞，以達(dá)到腫瘤組織靶向分布和顯像的目的。近幾年來，高質(zhì)量的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子的控制合成逐漸成熟，以及以上轉(zhuǎn)換發(fā)光為基礎(chǔ)的顯微成像技術(shù)和活體成像技術(shù)的出現(xiàn)，使得UCNP用于腫瘤細(xì)胞的靶向成像得以實(shí)現(xiàn)[7,13～17]。

偶聯(lián)生物分子的上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子已經(jīng)運(yùn)用于腫瘤跟蹤等方面的活體靶向成像。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (arginine-glycine-aspartic acid,RGD)肽和葉酸 (folic acid,FA)是重要的配體，將RGD肽、葉酸連接到UCNPs上用于腫瘤細(xì)胞的成像最近被陸續(xù)報(bào)道[7,13,14,16]?；赗GD肽與αvβ3整合素受體之間的高親和力，同時(shí)為了滿足細(xì)胞﹑組織和活體成像對材料有不同穿透深度的需求，我們設(shè)計(jì)合成了具有綠光、紅光和近紅外光發(fā)射的稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料UCNPs(NaYF4∶20%Yb,1.8%Er,0.2%Tm)作為熒光探針用于RGD肽標(biāo)記[7]。無胸腺的裸鼠活體成像結(jié)果顯示：RGD肽標(biāo)記的UCNPs具有很好的腫瘤靶向效果。組織切片的Z掃描成像數(shù)據(jù)證明，上轉(zhuǎn)換成像甚至在組織深度600 μm仍沒有自發(fā)熒光干擾。值得說明的是，上轉(zhuǎn)換發(fā)光在活體中熒光信號的區(qū)域 (region of interest，ROI)分析顯示出，上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像在腫瘤和背景之間的信噪比高至～24(圖6)，而這是單光子和雙光子熒光成像無法達(dá)到的效果。

5 展 望

圖6 經(jīng)尾靜脈注射UCNPs-RGD后24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)裸鼠的上轉(zhuǎn)換發(fā)光成像圖[7]U87MG腫瘤(αvβ3整合素高表達(dá)，左后腿，用短箭頭顯示)，MCF-7腫瘤(αvβ3整合素低表達(dá)，右后腿，用長箭頭顯示)，(功率≈80 mW/cm2，老鼠表面溫度≈21.5℃)Fig.6 Time-dependentin vivoup-conversion luminescence imaging of subcutaneous U87MG tumor(left hind leg,indicated by short arrows)and MCF-7 tumor(right hind leg,indicated by long arrows)borne by athymic nude mice after intravenous injection of UCNP-RGD over a 24 h period[7]All images were acquired under the same instrumental conditions(power≈80 mW/cm2and temperature≈21.5℃ on the surface of the mouse)

生物成像的最終目的是通過熒光標(biāo)記探針實(shí)現(xiàn)對生物樣本中單個(gè)生物分子進(jìn)行超靈敏檢測，欲提高生物成像的效果以及檢測靈敏性，就需要尋找信號穩(wěn)定、標(biāo)記簡便、安全無毒、檢測靈敏的標(biāo)記物。近年來，關(guān)于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用方面的一些研究結(jié)果表明：上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料具有光穩(wěn)定性好、化學(xué)穩(wěn)定性高、吸收和發(fā)射帶很窄、發(fā)光壽命長、潛在生物毒性小等優(yōu)點(diǎn)；另外，采用近紅外連續(xù)激光作為激發(fā)光源，具有較深的光穿透深度、對生物組織幾乎無損傷、無生物背景熒光干擾等顯著優(yōu)勢。上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料的這些特征正是生物成像的理想標(biāo)記物應(yīng)具備的?？缮限D(zhuǎn)換發(fā)光納米材料成像技術(shù)畢竟是納米材料科學(xué)跟生物醫(yī)學(xué)“聯(lián)姻”的產(chǎn)物，與有機(jī)染料和量子點(diǎn)相比，其在生物檢測和生物成像方面的應(yīng)用研究還處于起步階段，相關(guān)應(yīng)用還停留在細(xì)胞和活體動物實(shí)驗(yàn)階段，尚未進(jìn)入臨床應(yīng)用。隨著上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的進(jìn)步，可以預(yù)見，上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米材料具有巨大的臨床應(yīng)用潛力，將會為腫瘤檢測、基因表達(dá)、蛋白質(zhì)分子檢測、藥物受體定位、藥物篩選和藥物療效評價(jià)等方面提供有效的技術(shù)支持。

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Upconversion Luminescence Imaging Techniques and Their Application in Targeted Bioimaging

CHEN Min,XIONG Liqin,LI Fuyou
Department of Chemistry&Advanced Materials Laboratory,Shanghai 200433,China

Apr 21,2010 Accepted：Jul 16,2010

LI Fuyou,Tel：+86(21)55664185,E-mail：fyli@fudan.edu.cn

Upconversion luminescence involves conversion of two or more low energy photons,usually near infrared(typically 980 nm),to higher energy visible emission through multiple photon absorption or energy transfer.Compared with the traditional ultraviolet excitation,upconversion luminescence exhibits deep tissue penetration depth，minimalphotodamage to biologicalsamples and non-autofluorescence ofbiological samples.Therefore,upconversion luminescence has great application prospects in biological imaging.Herein,on basis ofthe unique upconversion luminescence ofrare earth materials，the novelupconversion luminescence imaging technologies including upconversion luminescence microscopy and upconversion luminescence whole-body imaging have been developed for application in targeted bioimagingin vitroandin vivo.

Upconversion luminescence;Rare-earth nanomaterial;Bioimaging;Target

2010-04-21；接受日期：2010-07-16

李富友，電話：(021)55664185，E-mail：fyli@fudan.edu.cn

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