楊 楠,喬善義,孟繁華

(1.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院,基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧沈陽 110016; 2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,毒物藥物研究所,北京 100850)

采用HPLC-MS/MS技術(shù)確定當(dāng)歸芍藥散中2個(gè)新化合物來源

楊 楠1,喬善義2,孟繁華2

(1.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院,基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧沈陽 110016; 2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院,毒物藥物研究所,北京 100850)

中醫(yī)經(jīng)典名方當(dāng)歸芍藥散(DSS)在古代用于治療痛經(jīng)等婦科疾病,現(xiàn)代廣泛用于痛經(jīng)、老年癡呆、更年期綜合征和黃褐斑等40多種疾病的治療。在篩選該方鎮(zhèn)痛活性部位的研究中,發(fā)現(xiàn)DSS中的A-N-30部位具有鎮(zhèn)痛活性,從中分離得到2個(gè)新化合物(1)和(2),并鑒定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)。為進(jìn)一步對2個(gè)新化合物進(jìn)行活性和結(jié)構(gòu)修飾等研究,需確定2個(gè)新化合物的來源,然后大量制備。采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)技術(shù),在電噴霧正離子檢測模式下,以一級質(zhì)譜掃描、子離子掃描和多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)方式,同時(shí)檢測該方劑的6個(gè)組成藥材,以2個(gè)新化合物為對照品,確定它們均來源于白術(shù)。

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS);來源;當(dāng)歸芍藥散;白術(shù)

當(dāng)歸芍藥散(Danggui Shaoyao San,DSS)出自《金匱要略》,全方由當(dāng)歸、白術(shù)、白芍、茯苓、澤瀉、川芎六味藥組成,是治療婦科諸癥的經(jīng)典名方[1]。近代藥理學(xué)研究表明,該方對下丘腦-垂體-生殖腺(卵巢)軸、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)、孕育等均有影響,臨床用于痛經(jīng)、老年性癡呆、更年期綜合征和黃褐斑等40多種疾病的治療[2]。在對DSS進(jìn)行鎮(zhèn)痛活性部位追蹤時(shí),發(fā)現(xiàn)并確定其 A-N-30部位具有較好的鎮(zhèn)痛活性[3],從中分離得到2個(gè)新化合物(1)和(2),并鑒定了它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)[4]。

由于2個(gè)新化合物在DSS-A-N-30中的含量很少,所以確定新化合物的來源是下一步對其進(jìn)行化學(xué)研究和藥理研究的關(guān)鍵。隨著高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC/MS-MS)聯(lián)用技術(shù)的廣泛應(yīng)用,尤其是電噴霧(ESI)等軟電離技術(shù)的快速發(fā)展,高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接用于中藥復(fù)雜體系中微量化合物的定性分析已逐漸成為中藥研究的熱點(diǎn)[5-6]。本工作采用 ESI源,在正離子檢測模式下,以一級質(zhì)譜掃描、子離子掃描和多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM)方式,對2個(gè)新化合物對照品和當(dāng)歸芍藥散各單味藥材A-N-30部位進(jìn)行分析,快速確認(rèn)2個(gè)新化合物的來源。

1 試驗(yàn)部分

1.1 樣品與試劑

當(dāng)歸、芍藥、川芎、白術(shù)、澤瀉、茯苓:均購自北京普生霖藥業(yè)有限公司,并經(jīng)生藥學(xué)鑒定;對照品化合物(1)和(2):由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所植物化學(xué)室制備,純度達(dá)95%以上。

除液相色譜所用試劑為色譜純外,其他試劑均為化學(xué)純或分析純。

1.2 主要儀器與試驗(yàn)條件

1.2.1 主要儀器 API 3000液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀:美國ABI公司產(chǎn)品,配有 Turbo Ionspray離子源及Analyst 1.4數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);Agilent 1100高效液相色譜儀:美國Agilent公司產(chǎn)品,配有四元梯度泵和自動進(jìn)樣器。

1.2.2 色譜條件 Hypersil ODS C18色譜柱(150×4.6 mm ×5μm);流動相為 A: (10 mmol·L-1)CH3COONH4,B:CH3OH; A∶B為100∶0(0 min)～70∶30(50 min)～10∶90(10 min)～0∶100(15 min);流速0.5 mL·min-1;進(jìn)樣量20μL。

1.2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(Turbo Ionspray),正離子掃描,檢測方式為一級質(zhì)譜掃描、子離子掃描和MRM,噴霧電壓4 500 V,離子源溫度400℃,霧化氣8 unit,卷簾氣11 unit,碰撞氣4 unit。

1.3 樣品制備

分別取50 g DSS各單味藥材,8倍量沸水煎煮3次,每次2 h,離心煎煮液,上清液減壓濃縮至浸膏。浸膏進(jìn)行HP-20大孔吸附樹脂柱層析,上樣流速 1.0 mL·min-1,洗脫流速1.0 mL·min-1,用水、5%乙醇和30%乙醇依次洗脫(水:10個(gè)柱床體積;5%乙醇:7個(gè)柱床體積;30%乙醇:6個(gè)柱床體積)。30%乙醇洗脫部位濃縮除醇后,冷凍干燥,得各單味藥A-N-30部位[7]。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜分析

對照品化合物(1)和(2)在電噴霧離子化正離子檢測模式下的一級和二級全掃描質(zhì)譜圖示于圖1和圖2。由圖中可見,在一級質(zhì)譜中化合物(1)和(2)的基峰為其準(zhǔn)分子離子 m/z254,分別對化合物(1)和(2)的準(zhǔn)分子離子 m/z254進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,主要產(chǎn)生m/z236、218、206和188等系列碎片離子。分別對DSS中6個(gè)單味藥A-N-30部位做一級和二級質(zhì)譜分析,在白術(shù)A-N-30部位的一級質(zhì)譜中有準(zhǔn)分子離子 m/z 254的基峰,對白術(shù)A-N-30部位中準(zhǔn)分子離子m/z254進(jìn)行二級質(zhì)譜分析,主要產(chǎn)生 m/z 236、218、206和188等系列碎片離子。因此,基本判斷白術(shù) A-N-30部位中含有化合物(1)和(2),白術(shù)的一級和二級全掃描質(zhì)譜圖示于圖3。

2.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

鑒于以上譜圖分析,為進(jìn)一步確定化合物(1)和(2)是否來源于白術(shù)A-N-30部位,對化合物(1)、(2)和白術(shù)A-N-30部位進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。由于對準(zhǔn)分子離子峰 m/z254進(jìn)行二級質(zhì)譜分析時(shí),化合物(1)、(2)和白術(shù)A-N-30部位同時(shí)產(chǎn)生m/z206和m/z188的碎片離子,所以在MRM掃描方式下,分別對對照品化合物(1)、(2)和白術(shù)A-N-30部位同時(shí)選擇多反應(yīng)離子監(jiān)測對m/z254→206和m/z254→188,結(jié)果示于圖4。結(jié)果顯示,化合物(1)的保留時(shí)間為44 min;化合物(2)的保留時(shí)間為36 min;白術(shù)A-N-30部位色譜圖中2個(gè)化合物的保留時(shí)間分別為36 min和44 min。白術(shù)中所含2個(gè)化合物的保留時(shí)間分別與對照品化合物(2)和(1)的保留時(shí)間一致,并且質(zhì)譜行為一致,因此判斷白術(shù)A-N-30部位中含有化合物(1)和(2)。由于化合物(1)和(2)是同分異構(gòu)體,盡管分離得到的對照品化合物(1)和(2)純度很高,但在各自化合物中仍然有微量另一同分異構(gòu)體存在,所以在對照品化合物(1)的色譜圖中檢測到保留時(shí)間為36 min的化合物(2),在對照品化合物(2)色譜圖中檢測到保留時(shí)間為44 min的化合物(1)。

圖1 化合物(1)的一級(a)和二級(b)全掃描質(zhì)譜圖Fig.1 The ESI-MS spectra(a)and MS-MS spectra(b)of compound(1)

圖2 化合物(2)的一級(a)和二級(b)全掃描質(zhì)譜圖Fig.2 The ESI-MS spectra(a)and MS-MS spectra(b)of compound(2)

圖3 白術(shù)A-N-30部位的一級(a)和二級(b)全掃描質(zhì)譜圖Fig.3 The ESI-MS spectra(a)and MS-MS spectra(b)of the fraction A-N-30 fromAtractylodes macrocephala Koidz.

3 結(jié) 論

本工作采用 HPLC-MS/MS技術(shù)確認(rèn)了DSS中2個(gè)新化合物(1)和(2)來源于白術(shù),為進(jìn)一步對2個(gè)新化合物進(jìn)行大量制備以及開展活性研究奠定了基礎(chǔ)。該方法快速、簡便、準(zhǔn)確,可應(yīng)用于中藥及復(fù)方制劑中各成分來源的分析及相關(guān)研究。采用 HPLC-MS/MS方法定性分析化合物來源時(shí),最好應(yīng)該有確定結(jié)構(gòu)的對照品與其對照,如果沒有確定結(jié)構(gòu)的對照品,也許會有色譜行為、一級和二級質(zhì)譜行為一致的同分異構(gòu)體存在的可能,而無法準(zhǔn)確判斷究竟為哪一個(gè)異構(gòu)體。因此,使用HPL C-MS/MS技術(shù)在確定中藥及復(fù)方制劑中成分來源時(shí),有確定結(jié)構(gòu)的對照品是關(guān)鍵一步;如果沒有對照品,宜進(jìn)行更多級質(zhì)譜分析,觀察其碎片情況,也許同分異構(gòu)體的碎片會有一定的差異,據(jù)此差異作出符合實(shí)際情況的判斷,結(jié)論會更可靠。

圖4 化合物(1),化合物(2)和白術(shù)A-N-30部位的MRM色譜圖a.化合物 (1);b.化合物 (2);c.白術(shù)A-N-30部位Fig.4 MRM chromatograms of compound(1),compound(2)and the fraction A-N-30 fromAtractylodes macrocephala Koidz. a.compound(1);b.compound(2);c.the fraction A-N-30 fromAtractylodes macrocephala Koidz.

[1]彭懷仁.《中醫(yī)方劑大辭典》四分冊[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1995:391.

[2]尚瑋瑋,喬善義.當(dāng)歸芍藥散研究概況[J].中國中藥雜志,2006,31(8):630-633.

[3]劉國云.當(dāng)歸芍藥散活性部位DSS-A-N-30對大鼠離體子宮平滑肌收縮的影響[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2007,21(5):427-433.

[4]胡緒瑋.當(dāng)歸芍藥散活性部位的研究[D].沈陽:沈陽藥科大學(xué),2008.

[5]ZHOU D Y,XU Q,XUE X Y,et al.Identification of O-dikgycosyl flavanones in Fructus aurantii by liquid chromatography with electrospray ionization and collision-induced dissociation mass spectrometry[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2006,42(4):441-448.

[6]SHI P Y,HE Q,SONG Y,et al.Characterization and identification of isomeric flavonoid O-dikgycosides from genus citrus in negative electrospray ionization by ion trap mass spectrometry and time-of-flight mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta,2007,598(1):110-118.

[7]胡緒瑋,喬善義,李 辰,等.當(dāng)歸芍藥散活性部位DSS-A-N-30中一種新的單萜苷[J].中國中藥雜志,2008,33(11):78-80.

Attribution of Danggui Shaoyao San’s New Compounds by HPLC-MS/MS

YANG Nan1,QIAO Shan-yi2,MENG Fan-hua2
(1.Key L aboratory of Structure-Based Drug Design&Discovery of Ministry of Education, School ofTraditional Chinese Materia Medica,Shenyang Pharmaceutical University,S henyang110016,China; 2.Institute ofPharmacology and Toxicology,Academy of Millitary Medicine,Beijing100850,China)

As a traditional Chinese medicine,Danggui Shaoyao San(DSS)was mainly used for gynecological disease in ancient times,and nowadays used for senile dementia,gynecological disease,hypoimmunity and so on.In our research for the active fraction of DSS, DSS-A-N-30 was found to have an analgesic activity.Two new compounds were isolated from DSS-A-N-30 and identified their chemical structures.To further study the activity and structural modification of the two new compounds,a sensitive and specific method was developed for the attribution of them in DSS-A-N-30 by using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).Experiments were performed on a triple-quadrupole tandem mass spectrometer using positive electrospray ionization(ESI), and multiple reaction monitoring(MRM)was applied.The results show that the two new compounds are attributed toA tractylodes macrocephalaKoidz..

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLCMS/MS);attribution;Danggui Shaoyao San;A tractylodes macrocephalaKoidz.

O 657.63

A

1004-2997(2010)03-0152-04

2009-11-23;

2010-01-29

國家科技支撐計(jì)劃課題(2006BAI08B03-08),國家十一五重大專項(xiàng)“重大新藥創(chuàng)制”課題(2009ZX09301-002)資助

楊 楠(1984～),女(漢族),山東人,碩士研究生,天然藥物化學(xué)專業(yè)。E-mail:yangnan616@yahoo.cn

喬善義(1961～),男(漢族),山東人,博士,研究員,從事中藥及天然藥物化學(xué)研究。E-mail:crbj611202@sina.com