李光光 陳國(guó)菊 曹必好 張財(cái)順 雷建軍

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院生物技術(shù)研究所，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜系，廣東廣州 510642）

不同辣椒基因型辣椒素的積累特性

李光光 陳國(guó)菊 曹必好 張財(cái)順 雷建軍*

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院生物技術(shù)研究所，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院蔬菜系，廣東廣州 510642）

用高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)4份辛辣型辣椒材料在花后10個(gè)時(shí)期果肉、胎座和種子的辣椒素類物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，辣椒素類物質(zhì)以胎座中最高，果肉次之，種子最少，其中牛角椒類型華椒3號(hào)、華椒4號(hào)和華椒5號(hào)的辣椒素類物質(zhì)含量在花后40～50 d達(dá)到最高，朝天椒在花后25 d達(dá)到最高。

辣椒素；二氫辣椒素；HPLC；胎座；果肉

辣椒素（Capsaicin）最早由Thres（1876年）從辣椒（Capsicum annuum L.）果實(shí)中分離出來，是一種香草酰胺衍生物，化學(xué)結(jié)構(gòu)為8-甲基-N-香草基-6-壬烯基酰胺（C18H27NO3）。其中，辣椒素占69 %，是辣味的主要決定因子；其次是二氫辣椒素（Dihydrocapsaicin），占22 %；其余同系物僅占少量，ω-羥基辣椒素是不辣的化合物（D í az et al.，2004）。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)19種辣椒素同系物，其同系物結(jié)構(gòu)類似辣椒素。它們具有顯著的醫(yī)療與天然的防污、除污等作用。辣椒素具有加速脂肪燃燒（Badmaev & Majeed，1995）、抗菌消炎、鎮(zhèn)痛（吳明光，1994）、增強(qiáng)機(jī)體耐力及抵抗力等藥用作用（Hui et al.，2003；Srinivasan，2005），對(duì)實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性鼻炎有治療作用（陳麗 等，2009）。盡管國(guó)內(nèi)已經(jīng)在其提取工藝和辣椒素合成規(guī)律上有了很多的研究，但多數(shù)是關(guān)于辣椒果實(shí)以及制品中辣椒素的檢測(cè)。本試驗(yàn)以辣椒不同器官、不同時(shí)間、不同品種的辣椒素含量為研究對(duì)象，以揭示辣椒素積累的一般規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料

4份辛辣型辣椒材料（華椒3號(hào)、華椒4號(hào)和華椒5號(hào)果實(shí)大牛角形，果皮黃綠色有光澤，牛角椒類型；另一份為朝天椒）與2份甜椒材料（Sprite和Fiestae）均是華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院所有，于2008年12月隨機(jī)種植在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)躍進(jìn)北試驗(yàn)基地，2009年3月下旬開始現(xiàn)蕾開花，掛牌。在花后10、15、20、25、30、35、40、45、50、60 d的10個(gè)時(shí)期分別提取辛辣材料3個(gè)器官（胎座、果肉和種子）的辣椒素和二氫辣椒素。以2份甜椒材料商品成熟期的3個(gè)器官（胎座、果肉和種子）作陰性對(duì)照，3次重復(fù)。

1.2 方法

1.2.1 辣椒素類物質(zhì)的提取 辣椒素類物質(zhì)易溶于有機(jī)溶劑（狄云 等，1999），參考中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T21266—2007）中的方法。將果實(shí)分為胎座、果皮和種子3個(gè)部分，50 ℃烘箱中烘干（水分含量15 %～20 %），趁熱用研缽磨碎；準(zhǔn)確稱取2.500 g過40目篩的粉末樣品，放入50 mL的離心管，貼上標(biāo)簽；分別加入甲醇（色譜醇，天津科密歐）+四氫呋喃（分析純，廣試一廠）（1 V∶1 V）混合液25 mL，蓋上管，在60 ℃水浴條件下，使用超聲波清洗器（用100 %功率）提取30 min；濾紙過濾，收集濾液。然后將濾渣連同濾紙，重復(fù)加入有機(jī)溶劑和超聲波提取3次；3次過濾的濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在75～80 ℃下濃縮至40 mL左右，加甲醇+四氫呋喃（1 V∶1 V）混合液定容于50 mL容量瓶（如果辣椒素類物質(zhì)含量少，可濃縮定容在10 mL容量瓶中）；經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行色譜分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精確稱取50 mg辣椒素（純度>95 %，美國(guó)）和50 mg二氫辣椒素（純度>90 %，美國(guó)）放入經(jīng)甲醇（HPLC專用色譜醇）洗滌過的燒杯中，迅速加少量甲醇溶解，然后將溶液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中，再用甲醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)母液貯存。分別吸取辣椒素、二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)母液將其配制成1.00、0.50、0.25、0.20、0.10、0.05、0.01 mg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為SB-C18（5 μm，250 mm×4.6 mm），檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm，測(cè)定柱溫為30 ℃，流動(dòng)相為甲醇+水（4 V∶1 V），流速為1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

按上述色譜條件進(jìn)行HPLC分析，用標(biāo)準(zhǔn)混合液的色譜峰所保留的時(shí)間定性，用辣椒素、二氫辣椒素標(biāo)準(zhǔn)曲線及試樣中的峰面積定量。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)辣椒素和二氫辣椒素的含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS統(tǒng)計(jì)軟件處理。

1.3.1 辣椒素類物質(zhì)的含量

公式 ① 中:X為試樣中辣椒素或二氫辣椒素的含量；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的辣椒素或二氫辣椒素含量；V為樣品定容體積；M為樣品質(zhì)量；w為辣椒素或二氫辣椒素標(biāo)樣純度。

1.3.2 辣椒素類物質(zhì)總量

公式 ② 中T為試樣中辣椒素類物質(zhì)總量；X1和X2分別為辣椒素和二氫辣椒素的含量；90 %為辣椒素與二氫辣椒素折算為辣椒素類物質(zhì)總量的系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒素類物質(zhì)出峰結(jié)果

如圖1、2所示，HPLC檢測(cè)辣椒素、二氫辣椒素標(biāo)樣0.5 mg·mL-1的色譜圖出峰時(shí)間分別為4.287、5.017 min，樣品華椒3號(hào)胎座（25 d）辣椒素、二氫辣椒素的色譜圖出峰時(shí)間分別為4.222、4.950 min，兩者出峰時(shí)間大約是一致的，說明數(shù)據(jù)可用來分析辣椒素類物質(zhì)的含量。

用混合標(biāo)樣得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為:辣椒素含量y=0.0004x+0.0146（R2=0.9796），二氫辣椒素含量y=0.0001x+0.0128（R2=0.9897）。

圖1 HPLC檢測(cè)標(biāo)樣的色譜圖

圖2 HPLC檢測(cè)樣品的色譜圖

圖3 辣椒素類物質(zhì)在4份辛辣型辣椒品種中的含量變化

2.2 辣椒素類物質(zhì)的方差分析

4份辛辣材料的胎座、果肉和種子在10個(gè)不同時(shí)期辣椒素、二氫辣椒素、辣椒素總量與斯科維爾指數(shù)（SHU）的方差分析結(jié)果可知:辣椒品種間（F=2.85，P<0.0001）、不同器官間（F=21.90，P<0.0001）以及不同時(shí)間之間（F=3.32，P=0.0019）差異極顯著；3個(gè)不同器官的辣椒素和二氫辣椒素在不同基因型辣椒中（F=4.05，P=0.0102）差異顯著。

用HPLC檢測(cè)2份甜椒材料的胎座、果肉和種子的辣椒素類物質(zhì)，結(jié)果表明:辣味材料的前15 d辣椒素類物質(zhì)與2份甜椒材料的方差值為R2=1.0，說明辣椒素類物質(zhì)并無顯著的變化，辣味材料中辣椒素類物質(zhì)的合成還沒有開始。

2.3 辣椒素類物質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化

采集不同時(shí)期的材料得到的辣椒素類物質(zhì)的含量用HPLC檢測(cè)，然后分別用辣椒素類物質(zhì)的曲線方程計(jì)算，所得到的辣椒素類物質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化如圖3所示。不同材料的辣椒素類物質(zhì)的積累過程基本上是一致的，在前期緩慢積累，到一定時(shí)期合成的辣椒素類物質(zhì)急劇增加，后期減少。辣味材料中的辣椒素類物質(zhì)以胎座中最多、果肉次之、種子中最少，而且辣椒素類物質(zhì)的含量取決于基因型、器官以及開花后的時(shí)間。

辣味重的材料中只有朝天椒的辣椒素類物質(zhì)的合成是在青果期達(dá)到最高峰，而其他3個(gè)辣味材料的辣椒素類物質(zhì)含量都是在果色轉(zhuǎn)紅期最高。供試材料中的辣椒素類物質(zhì)總量以華椒3號(hào)的胎座在50 d時(shí)含量最高，達(dá)23.55139 mg·g-1；而前期25 d，只有朝天椒的辣椒素總量最高，在胎座的含量達(dá)11.82893 mg·g-1，是同期果肉（0.30495 mg·g-1）的39倍。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)用HPLC檢測(cè)的2個(gè)甜椒材料的3個(gè)器官中辣椒素類物質(zhì)含量都很低，一般認(rèn)為甜椒材料的辣椒素類物質(zhì)很低，HPLC幾乎檢測(cè)不到，而被當(dāng)作無辣椒素類物質(zhì)品種（Yazawa et al.，2004；成善漢 等，2009），且2個(gè)甜椒材料的3個(gè)器官辣椒素類物質(zhì)含量與辛辣材料前15 d不同器官中含量的方差值為R2=1.0，說明辣椒素類物質(zhì)的合成從開花后15 d才開始積累。辣椒素在果實(shí)中的含量極不均勻，3個(gè)器官的辣椒素類物質(zhì)含量以胎座中的含量最高，果肉次之，與Jinap和Daund（1990）、Estrada等（2002）研究結(jié)果相同。這是因?yàn)榭刂评苯匪仡愇镔|(zhì)合成的關(guān)鍵性限速酶主要定位于果實(shí)胎座表皮細(xì)胞的液泡膜上（Fujiwake et al.，1980），辣椒素類物質(zhì)可以在果實(shí)胎座表皮細(xì)胞的液泡中首先形成，并通過子房隔膜運(yùn)輸?shù)焦獗砥ぜ?xì)胞的液泡中積累（Jinap ＆ Daund，1990），但大部分并未運(yùn)送到果肉和種子，以及植株的莖稈和葉片中（Estrada et al.，2002）。戴雄澤等（2008）認(rèn)為高辣味的辣椒以小辣椒為主，牛角型的辣椒屬于低辣度類型。但本試驗(yàn)檢測(cè)得到辣椒素類物質(zhì)總量以華椒3號(hào)的胎座在50 d為最高，在前期25 d，只有朝天椒的辣椒素總量在胎座的含量最高，這可能是取材時(shí)期不一致的結(jié)果。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，辣椒素類物質(zhì)的含量在辛辣材料中都是先緩慢增加，到某一個(gè)時(shí)期，急劇累加到最大值，而后又逐漸減少。但在華椒系列3個(gè)材料（牛角椒）中是以紅色期（花后40～50 d）為最高，這與張珍（2006）研究的中椒6號(hào)和遼椒7號(hào)辣椒素的累積結(jié)果一致；朝天椒以綠色期最高，且紅色期果肉低于綠色期的辣椒素含量（Gnayfeed et al.，2001）。這是由于辣椒素在果實(shí)中的積累受到合成與降解兩方面的共同調(diào)節(jié)，已有研究表明:辣椒果實(shí)中的過氧化物酶參與了辣椒素的氧化，使得辣椒素轉(zhuǎn)化為其他次生物質(zhì)，降低了辣椒果實(shí)中辣椒素的含量（Goodwin et al.，2003）。富宏丹等（2006）研究3個(gè)不同辣椒品種胎座和果肉中的辣椒素與其降解相關(guān)酶之間的關(guān)系，認(rèn)為在整個(gè)辣椒果實(shí)發(fā)育時(shí)期，過氧化物酶、多酚氧化酶活性均和辣椒素含量呈一定的負(fù)相關(guān)。因此，這兩種酶有可能參與了辣椒素的氧化降解，且在該過程中有互補(bǔ)作用。

辣椒素的檢測(cè)有紫外分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法以及熒光分光光度法，這些分析方法都可以比較可靠地檢測(cè)辣椒樣品中的辣椒素類物質(zhì)。本試驗(yàn)用HPLC檢測(cè)到的辣椒素含量在0.05368～23.55139 mg·g-1，二氫辣椒素含量在0.00050～1.83186 mg·g-1。成熟期的辣椒中含有紅色素，而紅色素易溶于有機(jī)溶劑。陳小全等（2009）認(rèn)為在50 ℃條件下，用超聲波提取10 min就能得到紅色素，而且在光照和加熱的條件下極為穩(wěn)定，本試驗(yàn)在未對(duì)粗樣品提純的情況下，用HPLC仍可以檢測(cè)到辣椒材料中很微量的辣椒素類物質(zhì)。但是在檢測(cè)的峰圖中，容易出現(xiàn)雜峰，干擾辣椒素類物質(zhì)出現(xiàn)的時(shí)間。因此，要用標(biāo)樣反復(fù)檢測(cè)辣椒素和二氫辣椒素的出峰時(shí)間，為準(zhǔn)確找到對(duì)應(yīng)的峰圖位置作參照。

與標(biāo)樣得到的色譜圖相比，樣品的右部分色譜圖有雜峰，是因?yàn)樘崛〉臉悠肺唇?jīng)過處理，含色素、蛋白、葡萄糖和脂肪等物質(zhì)（石若夫和柯薇，2007），而這些提取物在不同基因型辣椒中含量差異較小（戴雄澤 等，2008），因而都表現(xiàn)出了對(duì)儀器檢測(cè)結(jié)果的干擾。

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Accumulative Characteristics of Capsaicin with Different Capsicumgenotypes

LI Guang-guang, CHEN Guo-ju, CAO Bi-hao, ZHANG Cai-shun, LEI Jian-jun*
（Biotechnology Institute of Horticulture College, South China Agricultural University, Vegetables Department of Horticulture College, South China Agricultural University, Guangzhou510642, Guangdong, China）

Capsaicin contents in pulp, placenta and seed of4 pepper（Capsicum annuum L.）accessions at10 periods were tested by HPLC. The result showed that capsaicin content was the highest in placenta, followed by pulp, and the least seed. The capsaicin content reached the highest at40-45th day after flowering in cayenne pepper varieties‘Huajiao No.3’，‘Huajiao No.4’and‘Huajiao No.5’.‘Chaotianjiao’reached the highest content at25th day after flowering.

Capsaicin; Dihydrocapsaicin; HPLC; Placenta; Pulp

S641.3

A

1000-6346（2010）24-0031-05

2010-06-29；接受日期:2010-08-20

國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2006BAD01A7-04-09）

李光光，碩士研究生，專業(yè)方向:蔬菜生物技術(shù)育種，E-mail:ligg007@sohu.com

*通訊作者（Corresponding author）:雷建軍，教授，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方向:蔬菜生物技術(shù)育種，E-mail:jjlei@scau.edu.cn