易少凌

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520

柚皮苷和柚皮素在Caco-2細(xì)胞模型的吸收研究

易少凌

廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東廣州 510520

目的：研究柚皮苷(Naringin)和柚皮素（Naringenin）在Caco-2細(xì)胞模型中的吸收特性。方法：用Caco-2細(xì)胞單層模型研究柚皮苷和柚皮素的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)，并考察柚皮苷和柚皮素隨時間吸收的變化。用高效液相色譜法檢測藥物濃度，計算其表觀滲透系數(shù)。結(jié)果：柚皮苷（50μM）、柚皮素（50μM）雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的濃度均隨著時間增加而增加，柚皮苷的頂端→基底端（AP面→BL面）和基底→頂端（BL面→AP面）的表觀滲透系數(shù)（Papp）均小于1.0×10-6cm.s-1，Papp(B-A)/Papp(A-B)約為0.4；柚皮素的頂端→基底端（AP面→BL面）和基底→頂端（BL面→AP面）的表觀滲透系數(shù)（Papp）均位于1.0×10-6cm.s-1～10×10-6cm.s-1之間， Papp(B-A)/Papp(A-B)約為2.0。結(jié)論：柚皮苷屬于吸收不良的藥物，而柚皮素屬于吸收中等偏差水平；柚皮素比柚皮苷更易被吸收，該藥物的吸收情況與是否存在糖基有關(guān)；柚皮苷被小腸頂側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)載體所攝取，而柚皮素的吸收則兼有外排作用。

柚皮苷；柚皮素；Caco-2細(xì)胞模型；雙向轉(zhuǎn)運(yùn)

柚皮苷（Naringin）又稱柚苷、柑橘苷、異橙皮苷，主要存在與蕓香科植物葡萄柚、橘、橙的果皮和果肉中，柚皮苷也是中草藥骨碎補(bǔ)、枳實(shí)、枳殼、橘紅的主要有效成分。各種植物中柚皮苷含量隨品種、產(chǎn)地的不同而有較大差別，通常未成熟的果含量更高。柚皮素是柚皮苷的苷元。它們均具有抑制P450酶、抗炎、抗腫瘤、利膽、抗氧化等作用。

據(jù)文獻(xiàn)報道，兔灌胃研究柚皮素的絕對生物利用度為4%～8%，但吸收機(jī)制不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在運(yùn)用Caco-2細(xì)胞模型研究柚皮苷和柚皮素的吸收。

1 材料和方法

1.1 材料、儀器、設(shè)備

柚皮苷Naringin（Product of USA，含量95%）；柚皮素Naringenin（Product of United Kindon，95%）；橙皮素Hesperetin（Product of United Kindon，含量95%）。

DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco’s Modified Eagle’s medium，GIBCO）；胎牛血清（Fetal bovine serum，杭州四季清）；非必需氨基酸（Nonessential amino acid，NEAA，GIBCO）；胰蛋白酶（Trypsin，上海生工）；β-Glucuronidase（product of England）；MTT（四甲基偶氮唑鹽，5mg/ml溶于PBS）；HBSS(Hank’s balanced salt solution，PH7.2～7.4）（含有16g/L的NaCl、0.04g/L的KCl、0.20g/ L的MgSO4·7H2O、0.134g/L的KH2PO4·14H2O、0.35g/L的NaHCO3、2.38g/L的HEPES、0.14g/L的CaCl2、1.0g/L的D-葡萄糖，用NaHCO3調(diào)PH值，均為分析純）；二甲基亞砜、甲醇、乙腈、丙酮（均為色譜純）；NaH2PO4(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，分析純，GB1267-77)；磷酸（廣州化學(xué)試劑廠，分析純，20000101-3）。

Caco-2細(xì)胞（ATCC(American Type Culture Collection，USA））；12孔Transwell（Corning Costar，Cambridge，MA，USA）；培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

Caco-2細(xì)胞在37℃，含5%的CO2環(huán)境中培養(yǎng)，用DMEM培養(yǎng)液。培養(yǎng)液中含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、2.38g/L的HEPES以及100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1鏈霉素雙抗液。當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%融合時，用0.25%胰酶+0.02%EDTA液消化細(xì)胞，按1∶3傳代培養(yǎng)，每兩天換一次培養(yǎng)液。

1.3 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

MTT實(shí)驗(yàn)是一種通過檢測活細(xì)胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的活性反映細(xì)胞活力的方法。上述培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞以1×104/孔接種于96孔培養(yǎng)板，于37℃，含5%的CO2環(huán)境中孵化36小時后去除培養(yǎng)基，分別加入含有不同濃度的柚皮苷、柚皮素的HBSS溶液200μl（含＜1%的DMSO），每個濃度3孔，空白3孔。在培養(yǎng)箱中孵化3小時后結(jié)束，吸出藥液，加入20μl含5mg/L MTT的PBS溶液繼續(xù)孵育4小時后，去除MTT，每孔加入200μl DMSO溶解紫色結(jié)晶產(chǎn)物。用酶聯(lián)免疫檢測儀在590nm比色測定，以A藥液/A空白-濃度繪圖。

1.4 細(xì)胞模型轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞模型的建立

上述培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞接種在12孔Transwell板上，接種密度為2×105/孔，內(nèi)層加培養(yǎng)液0.5ml、外層加培養(yǎng)液1.5ml，第1周隔天換液，后2周每天換液，待生長至21天左右，細(xì)胞形成緊密的單層，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 細(xì)胞單層完整性驗(yàn)證

在每種藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前及結(jié)束后，均用EVOM(Epithelial voltammeter，WPI，Sarasota，F(xiàn)L，USA)測定在pH值為7.2～7.4時的跨上皮細(xì)胞電阻（transepithelial electrical resistance，TEER），確定單層細(xì)胞的緊密性與完整性。

1.4.3 雙向轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)

運(yùn)用柚皮苷和柚皮素的跨膜通透率作為檢測其轉(zhuǎn)運(yùn)情況的標(biāo)準(zhǔn)。在pH值為7.2～7.4的情況下，進(jìn)行柚皮苷和柚皮素從Caco-2細(xì)胞單層頂端（A面）→基底端（B面） 以及基底端（B面）→頂端（A面）的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞用HBSS(pH7.2～7.4)液小心沖洗3次，最后1次在37℃培養(yǎng)箱中孵育0.5h。頂端（A面）→基底端（B面）：在A面分別加0.5ml的柚皮苷（29μg/ml，50μM）或柚皮素（13.6μg/ml，50μM）；B面加1.5ml的HBSS液。基底端（B面）→頂端（A面）：在B面分別加1.5ml的柚皮苷（29μg/ml，50μM）或柚皮素（13.6μg/ml，50μM）；A面加0.5ml的HBSS液。放入培養(yǎng)箱37℃孵育，分別于30min、60min、90min、120min從B面或者A面取樣檢測。

1.5 樣品濃度測定

1.5.1 測定前處理

200μl樣品，其中80μl直接進(jìn)樣，120μl經(jīng)酶水解后進(jìn)樣。處理方法如下：取樣品100μl于離心管中，加10μl 10μg/ ml的內(nèi)標(biāo)（橙皮苷），加5 000U/ml的酶50μl，于37℃中水解4h，加10μl pH4.55HAc，渦旋30s，加300μl丙酮，渦旋1min，10 800rpm，離心10min，取上清液，氮?dú)獯蹈桑?50μl CH3OH : pH2.55磷酸緩沖液（1:1），渦旋30s，10 800r/s，離心5min，取上清液，進(jìn)樣100μl。

1.5.2 分析方法及條件

柚皮苷和柚皮素均使用HPLC測定濃度。Waters高效液相色譜系統(tǒng)：Waters 600 Controller、Waters 717 plus自動進(jìn)樣器、Waters 486紫外檢測器、Waters Millennium 32色譜數(shù)據(jù)處理軟件；色譜柱（Thermo, Part No. 28 105-254 630）。流動相：甲醇（A）：PH2.55NaH2PO4(B)：乙腈（C），梯度洗脫，從0min～18min，A從45%～13%，B從55%～37%，C從0%～50%；從18min～20min，A從13%～45%，B從37%～55%，C從50%～0%，然后以這個比例平衡10min。

1.6 表觀滲透系數(shù)

根據(jù)下式計算得藥物的表觀滲透系數(shù)Papp（apparent permeability coefficients ）： Papp= (dQ/dt )/(A×C0)。其中：C0是藥物所在端（donor）的初始濃度，dQ為藥物在dt時間段內(nèi)在接受端（receiver）透過量， A是Transwell多聚碳酸酯膜的表面積。

2 結(jié)果

2.1 藥物含量測定

2.1.1 專屬性

專屬性實(shí)驗(yàn)顯示柚皮苷、柚皮素和橙皮苷出峰處，均未出現(xiàn)干擾峰，且在該條件下柚皮苷、柚皮素和橙皮苷完全分離（圖1）。

圖1 Naringin、Naringenin 的HPLC圖譜

2.1.2 未水解樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及精密度考察

制備濃度梯度為0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、5g ·L-1的柚皮苷與柚皮素的HBSS溶液1ml作為標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。直接進(jìn)樣50μl分析，以已知濃度為橫坐標(biāo)，所得峰面積為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程。柚皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y = 79568x+760.05，R2=0.9999，Nringenin的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 180748x+1120.2，R2=1，該法線性好，線性范圍均為0.01μg · ml-1～5.0μg· ml-1；絕對回收率大于70%；高(5μg· ml-1)、中(0.25μg· ml-1)、低(0.025μg· ml-1)3個濃度的日內(nèi)、日間精密度均小于10%。符合生物樣品分析的一般要求。

2.1.3 已水解樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及精密度考察

制備濃度梯度為0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1、5 g ·L-1的柚皮苷和柚皮素 的HBSS溶液1ml作為標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。依（樣品處理）的方法將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品經(jīng)酶水解后進(jìn)樣100μl分析，以已知濃度為橫坐標(biāo)，所得藥物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面的比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程。柚皮苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y =0.4548x+0.0103，R2=0.9998，Nringenin的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y =1.1638x+0.0381，R2=0.9998，該法線性好，線性范圍均為0.01μg· ml-1～5.0μg· ml-1；絕對回收率大于75%；高(5μg· ml-1)、中(0.25μg· ml-1)、低(0.025μg· ml-1)3個濃度的日內(nèi)、日間精密度均小于10%。符合生物樣品分析的一般要求。

2.2 Caco-2細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

當(dāng)藥物濃度對細(xì)胞無毒時，A藥液/A空白＞=1。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示，柚皮苷濃度 ＜30μg/ml時，A藥液/A空白＞=1；柚皮素濃度＜15μg/ml時，A藥液/A空白＞=1。該結(jié)果說明在實(shí)驗(yàn)濃度下藥物對Caco-2細(xì)胞無毒性。

2.3 單層細(xì)胞完整性的驗(yàn)證

在進(jìn)行柚皮苷和柚皮素的Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)之前，測定了單層細(xì)胞的胯膜電阻（TEER）以驗(yàn)證細(xì)胞膜的完整性，其TEER的值大于200Ω·cm2（在200Ω·cm2～500Ω·cm2之間），該細(xì)胞模型完整性在要求范圍內(nèi)，可用于進(jìn)行雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)。

2.4 柚皮苷、柚皮素雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)

Caco-2細(xì)胞模型對柚皮苷和柚皮素的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，柚皮苷（50μM）、柚皮素（50μM）雙向轉(zhuǎn)運(yùn)的濃度均隨著時間增加而增加，并在120min內(nèi)呈線性增加趨勢，其線性回歸相關(guān)系數(shù)達(dá)0.9以上（圖2），未出現(xiàn)飽和現(xiàn)象。Caco-2細(xì)胞模型對柚皮素的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，樣品未經(jīng)水解直接HPLC測定的圖譜中發(fā)現(xiàn)了柚皮苷峰，且其濃度隨著柚皮素吸收的增加而增加。柚皮苷的頂端→基底端（AP面→BL面）和基底→頂端（BL面→AP面）的表觀滲透系數(shù)（Papp）均小于1.0×10-6cm·s-1， Papp(B-A)/Papp(A-B)約為0.4；柚皮素的頂端→基底端（AP面→BL面）和基底→頂端（BL面→AP面）的表觀滲透系數(shù)（Papp）均位于1.0×10-6cm ·s-1～10×10-6cm·s-1 之間， Papp(B-A)/Papp(A-B)約為2.0(表1，表2)。

表1 柚皮苷、柚皮素的Papp值(未水解)，mean±SD，n=3

表2 柚皮苷、柚皮素的Papp值(已水解)，mean±SD，n=3

3 討論

Caco-2細(xì)胞來源于人類結(jié)腸癌細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)和生化特點(diǎn)類似于人類小腸上皮細(xì)胞，含有與小腸刷狀緣上皮相關(guān)的酶，能夠在細(xì)胞水平提供關(guān)于藥物分子通過小腸粘膜的吸收、代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)信息。該模型操作簡便，重現(xiàn)性好，可評價不同實(shí)驗(yàn)條件下藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)速率。

Caco-2細(xì)胞模型中，通常用Papp來評價藥物在腸道的吸收情況，F(xiàn)êger等和Artursson 等用Caco-2細(xì)胞模型研究了多種不同結(jié)構(gòu)藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Papp值為5×10-8cm·s-1～5×10-5cm·s-1。經(jīng)過與體內(nèi)結(jié)果進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，吸收為1%～100%的藥物，其Papp為（0.1～10） ×10-6cm·s-1；而吸收差的藥物（即吸收＜ 1% ）的Papp＜ 10-7cm·s-1。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，柚皮苷屬于吸收不良的藥物，柚皮素比柚皮苷更易被吸收，柚皮素屬于吸收中等偏差水平，這與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符（柚皮素兔灌胃的絕對生物利用度為4%～8%）。

理論認(rèn)為，Papp（A→B）與Papp（B→A）接近時，化合物以被動擴(kuò)散方式轉(zhuǎn)運(yùn)； Papp（A→B） 明顯大于Papp（B→A）時，化合物被小腸頂側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)載體所攝取；Papp（B→A）明顯大于Papp（A→B）時，化合物被小腸頂側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外排。雙向轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，柚皮苷Papp（B→A） /Papp（A→B）約為0.4，說明柚皮苷被小腸頂側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)載體所攝取；而柚皮素Papp（B→A）/ Papp（A→B）約為2.0，提示其在小腸吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中受到外排性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響。

在柚皮素的轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)了柚皮苷峰，且隨著柚皮素吸收的增加而增加，這可能是因?yàn)殍制に赝ㄟ^細(xì)胞時在酶的催化下發(fā)生了第Ⅱ相反應(yīng)（即結(jié)合反應(yīng)）的葡萄糖醛酸反應(yīng)，但需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，柚皮苷屬于吸收不良的藥物，柚皮素屬于吸收中等偏差水平；柚皮素比柚皮苷更易被吸收，該藥物的吸收情況與是否存在糖基有關(guān)；柚皮苷被小腸頂側(cè)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)載體所攝取，柚皮素的吸收兼有外排作用；柚皮素通過細(xì)胞時可能在酶的催化下發(fā)生了第Ⅱ相反應(yīng)（即結(jié)合反應(yīng)）的葡萄糖醛酸反應(yīng)，但需要更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)對研究兩種藥物在人體中的生物利用度和吸收機(jī)制均具有一定的參考作用。

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A

1674-6708（2010）24-0131-03