胡 磊，左 鵬，葉邦策

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海200237）

微珠芯片免疫法對(duì)肉制品中萊克多巴胺殘留的檢測(cè)*

胡 磊，左 鵬，葉邦策

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院，上海200237）

構(gòu)建了一個(gè)基于功能化微珠表面競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)的流控芯片體系，在環(huán)氧化微珠表面固定小分子萊克多巴胺的蛋白全抗原，然后依次與一抗和攜帶熒光的二抗反應(yīng)，最后輸出熒光信號(hào)。在檢測(cè)中，采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法，先利用標(biāo)準(zhǔn)品制作競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后進(jìn)行實(shí)際樣本檢測(cè)。該系統(tǒng)檢測(cè)的萊克多巴胺的最低檢測(cè)限達(dá)到0.03 μg/L，檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)45 min。

微珠芯片；環(huán)氧化；萊克多巴胺；獸藥殘留；最低檢測(cè)限

萊克多巴胺（Ractopamine Hydrochloride，RA C），屬β-腎上腺素興奮劑（β-興奮劑）類藥物中的苯乙醇類衍生物，是通常所說(shuō)的瘦肉精，具有顯著提高胴體瘦肉率，改善動(dòng)物飼料利用效率的生產(chǎn)性能。萊克多巴胺也能提高飼喂動(dòng)物的瘦肉率，但因其危害大，我國(guó)已禁止使用[1]。畜禽飼喂萊克多巴胺對(duì)動(dòng)物和人都會(huì)產(chǎn)生危害，對(duì)動(dòng)物的危害表現(xiàn)在長(zhǎng)期使用后易引發(fā)肌肉震顫，四肢和面部肌肉最明顯，對(duì)人危害表現(xiàn)為人吃了殘留有萊克多巴胺的組織后可能會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀，通常表現(xiàn)為面色潮紅、頭暈、心悸、四肢麻木等不良反應(yīng)，對(duì)有心血管病的患者危害更大，嚴(yán)重的危及生命，我國(guó)已嚴(yán)禁在飼料中添加使用[2]，并且世界各國(guó)都在積極開發(fā)檢測(cè)萊克多巴胺的辦法。

目前檢測(cè)萊克多巴胺的方法主要有高效液相色譜法，毛細(xì)管電泳法，酶聯(lián)免疫法等等，雖然檢測(cè)方法多種多樣，但普遍存在檢測(cè)儀器昂貴，操作繁瑣等缺點(diǎn)，為此采用了一種新的生物芯片法-微珠芯片法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)分析。近年來(lái)，生物芯片作為一種新型的生物材料和實(shí)驗(yàn)方法得到了廣泛的應(yīng)用[3]，生物芯片有多種形式，包括微陣列芯片和微流控芯片，本文研究的是一種類似于微流控的微珠載體芯片，這種基于競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)原理的微珠載體芯片測(cè)定方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、通量高、試劑用量少等諸多優(yōu)點(diǎn)[4]。作者通過(guò)對(duì)蛋白全抗原的有效固定，并采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行測(cè)定，該方法簡(jiǎn)單、快速、高效，靈敏度高且廉價(jià)，適合萊克多巴胺的大規(guī)模檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

微珠芯片在線檢測(cè)系統(tǒng)如圖1所示，本系統(tǒng)包括蠕動(dòng)泵，微珠芯片，六通閥，以及相關(guān)管路，其中中間的六通閥為樞紐控制整個(gè)免疫檢測(cè)過(guò)程，圖1中2種狀態(tài)分別顯示洗滌，進(jìn)樣圖1（a）和循環(huán)反應(yīng)圖1（b）。

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig.1 Schematic of setup

1.2 試劑和儀器

Tweem 20；1，4-丁二醇二縮水甘油醚,美國(guó)Sigma公司；小牛血清白蛋白，美國(guó)Sigma公司；萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，二氧化硅微珠，氨基顯色劑TNBS，萊克多巴胺單克隆抗體，美國(guó)Biodesign公司；Cy5/Cy3標(biāo)記羊抗鼠IgG，美國(guó)Rockland公司；3-氨丙基三甲氧基硅烷APTMS，美國(guó)Sigma公司；pH試紙，考馬斯亮藍(lán)250。

Milli-Q型超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；管式流動(dòng)芯片分析儀；Centrifnge 5415R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppe ndorf公司；臺(tái)式恒溫振蕩器，上海精宏儀器設(shè)備有限公司；G-560E型漩渦混勻儀，美國(guó)Scientific indu stries公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏儀器設(shè)備有限公司，Genepix掃描儀，基因公司。

1.3 檢測(cè)原理

本實(shí)驗(yàn)是基于競(jìng)爭(zhēng)免疫反應(yīng)的原理實(shí)現(xiàn)的，在免疫反應(yīng)中，抗體可以和對(duì)應(yīng)抗原特異性結(jié)合，而抗抗體（二抗）又可以抗體結(jié)合，本實(shí)驗(yàn)將所測(cè)物質(zhì)作為抗原固定在玻璃微珠載體上，然后將待檢物和對(duì)應(yīng)抗體混合液同微珠上固定的抗原探針?lè)磻?yīng)，這時(shí)，溶液中抗原（待檢物）和微珠表面上抗原就會(huì)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合溶液中的相應(yīng)抗體，洗滌后，加入熒光標(biāo)記二抗會(huì)同已在微珠表面共價(jià)結(jié)合的抗體結(jié)合，而通過(guò)掃描就可以捕捉到已結(jié)合的熒光信號(hào)，就可以表征一抗和微珠上抗原探針的結(jié)合程度，用抗原標(biāo)準(zhǔn)品和探針競(jìng)爭(zhēng)的方式可以得到此免疫競(jìng)爭(zhēng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以對(duì)照得到同樣條件競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的實(shí)際樣本濃度。

1.4 微珠表面修飾策略

1.4.1 微珠表面的化學(xué)修飾

（1）二氧化硅微珠的羥基化修飾

用1.5 mL離心管稱量100 mg二氧化硅裸珠，用去離子水洗凈，加入1 mL6 mol/LHCl，37℃振蕩反應(yīng)過(guò)夜，然后用去離子水洗滌至中型，110℃真空干燥過(guò)夜。

（2）二氧化硅微珠的硅烷化修飾

氨基硅烷化，具體操作是：羥基化珠干燥完成后，加入含2%的2，3-氨丙基三甲氧基硅烷甲苯溶液，反應(yīng)5 h,然后110℃真空干燥2 h，用TNBS顯色劑檢驗(yàn)其反應(yīng)效果，保存待用，此珠稱為氨基珠。

（3）二氧化硅微珠的功能化修飾

通過(guò)系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在氨基硅烷化基礎(chǔ)上進(jìn)行環(huán)氧化，可以有效固定小分子的牛血清蛋白全抗原環(huán)氧化,在500 μL 1，4-丁二醇二縮水甘油醚（butane-1，4-diol diglyciydyl ether）的 PBS（pH 7.4）緩沖液中加入10 mg氨基珠，37℃反應(yīng)16 h，用PBS（pH 7.4）緩沖液洗滌3遍，無(wú)水乙醇洗滌1遍，常溫真空干燥。

1.4.2 間接熒光免疫實(shí)驗(yàn)法過(guò)程

（1）固定探針

將功能化修飾微珠與萊克多巴胺的蛋白BSA的偶聯(lián)物混合在37℃反應(yīng)過(guò)夜，之后用PBST，PBS各洗滌2遍。

（2）抗體抗原反應(yīng)

將微珠在蠕動(dòng)泵的作用下，泵入毛細(xì)管，然后用1 mL PBST和1 mL PBS導(dǎo)入管中進(jìn)行洗滌，洗滌完成后，導(dǎo)入適量濃度的一抗和標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品）混合溶液50 μL，此時(shí)恰好將整個(gè)管路充滿，然后將橡膠管兩頭連接，使之在加熱板的恒溫環(huán)境下循環(huán)流動(dòng)反應(yīng)，20 min后，再用1 mL PBST和1 mL PBS導(dǎo)入管中進(jìn)行洗滌。

（3）抗體二抗反應(yīng)

洗滌完成后，導(dǎo)入50 μL標(biāo)記熒光的二抗，同一抗反應(yīng)過(guò)程步驟，進(jìn)行恒溫封閉循環(huán)反應(yīng)，20 min后，再用1 mLPBST和1 mLPBS導(dǎo)入管中進(jìn)行洗滌。

（4）信號(hào)獲取及數(shù)據(jù)處理

洗滌完后使用Genepix掃描儀進(jìn)行掃描，并分析圖形及進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用間接競(jìng)爭(zhēng)法繪制小分子競(jìng)爭(zhēng)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用6條攜帶6組固定好該探針微珠的毛細(xì)管的橡膠管路，分別導(dǎo)入15 μL稀釋度為1︰100的單克隆抗體（1 mg/mL）和15 μL濃度（μg/L）分別為0，0.01，0.1，1，10，100標(biāo)準(zhǔn)品的混合樣。然后按

1.4.2方法進(jìn)行分析,最后得到經(jīng)過(guò)6點(diǎn)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)不斷優(yōu)化改變單抗?jié)舛龋云诘玫礁?jìng)爭(zhēng)性強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。優(yōu)化完成后，確定最低檢測(cè)限，各取檢測(cè)區(qū)間內(nèi)兩點(diǎn)做加標(biāo)回收率測(cè)定。

1.4.4 實(shí)際樣本檢測(cè)

實(shí)際樣本檢測(cè)：對(duì)于每一種實(shí)際樣本用固定有萊克多巴胺抗原的微珠進(jìn)行檢視，反應(yīng)流程與上述檢測(cè)方法相同，同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)際樣本得到的信號(hào)與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，反應(yīng)完成后，可即時(shí)得到樣本里各種殘留的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 微珠表面修飾策略

2.2 一抗、羊抗鼠IgG二抗反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

評(píng)價(jià)檢測(cè)方法的重要方面是檢測(cè)時(shí)間，所以有必要對(duì)2次免疫反應(yīng)進(jìn)行一系列的優(yōu)化，首先就是對(duì)反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化，一抗反應(yīng)時(shí)間和二抗反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化，設(shè)置了一組時(shí)間梯度5，10，15，20，30 min來(lái)進(jìn)行一抗反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化，圖2信號(hào)圖是反應(yīng)結(jié)果。

從圖2可以看出，一抗反應(yīng)在15 min，二抗反應(yīng)在10 min時(shí)反應(yīng)信號(hào)分別進(jìn)入平臺(tái)期，所以可確定優(yōu)化結(jié)果一抗反應(yīng)15 min，二抗反應(yīng)10 min，反應(yīng)中洗滌，加樣等時(shí)間需要20 min，所以本系統(tǒng)-微珠芯片多元檢測(cè)總體需要45 min時(shí)間。圖中對(duì)全抗原的濃度進(jìn)行梯度稀釋，發(fā)現(xiàn)RAC-BSA為7.06 mg/mL時(shí)，為其2倍稀釋下限，為有明顯信號(hào)的最低濃度，為節(jié)約原則，選取這一濃度點(diǎn)為實(shí)驗(yàn)濃度。

圖2 免疫反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果Fig.2 Optimizationresults of Immune reactiontime

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和回收率測(cè)定

2.3.1 一抗?jié)舛葍?yōu)化

在標(biāo)準(zhǔn)曲線的優(yōu)化過(guò)程中，一抗?jié)舛仁且粋€(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，因?yàn)樗鼪Q定免疫競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性，一抗?jié)舛葷舛热绻?，探針結(jié)合量小，則普遍信號(hào)就比較微弱，一抗?jié)舛热绻?，所有探針都被飽和結(jié)合，普遍信號(hào)就比較強(qiáng)，也沒(méi)有強(qiáng)烈的競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)趨勢(shì)，所以合適的一抗?jié)舛葢?yīng)該是讓探針與標(biāo)準(zhǔn)品有一個(gè)充分競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)效果，表現(xiàn)是在標(biāo)準(zhǔn)曲線上有一個(gè)明顯的競(jìng)爭(zhēng)下降趨勢(shì)。以萊克多巴胺為例，講述其優(yōu)化過(guò)程：

標(biāo)準(zhǔn)曲線條件的優(yōu)化主要是其一抗?jié)舛鹊膬?yōu)化，其濃度高時(shí)，結(jié)合位點(diǎn)被飽和，信號(hào)普遍較高，競(jìng)爭(zhēng)性較弱，隨著一抗?jié)舛认陆?，信?hào)降低的同時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)性也在加強(qiáng)，當(dāng)Rac一抗?jié)舛葹?.75 μg/mL時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)性最好，在0.01～1.00 μg/L上有明顯的下降趨勢(shì)，但一抗進(jìn)一步稀釋時(shí)，信號(hào)普遍明顯降低，競(jìng)爭(zhēng)性有趨緩，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，需要較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)性，所以選9.5 μg/mL為最佳一抗反應(yīng)濃度，在此條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。

圖3 萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Calibrationcurve of clenbuterol

完成優(yōu)化之后，就可以按照確定的優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行微珠芯片實(shí)時(shí)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)檢測(cè)實(shí)際樣本，實(shí)現(xiàn)高效檢測(cè)。

2.3.2 回收率測(cè)定

測(cè)定加標(biāo)回收率是評(píng)價(jià)任何一種檢測(cè)方法的必要程序，根據(jù)萊克多巴胺的檢測(cè)區(qū)間取2個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)行加標(biāo)回收的測(cè)定，各平行測(cè)定5個(gè)樣，并測(cè)定其平均回收率和測(cè)定數(shù)據(jù)的離散程度CV，見(jiàn)表1。并利用3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算方法確定最低檢測(cè)限，為0.03 μg/L，檢測(cè)范圍為0.04～1.00 μg/L，IC50為0.76 μg/L。

表1 萊克多巴胺加標(biāo)回收測(cè)定Table 1 Determinationof standardadditionrecovery of ractopamine

2.3.3 實(shí)際樣品檢測(cè)

用微珠芯片分析平臺(tái)對(duì)來(lái)自豬肉和豬肝的100個(gè)樣品做了萊克多巴胺的殘留檢測(cè)，結(jié)果陽(yáng)性符合率為100%，陰性符合率為98.4%。

3 結(jié)論

在環(huán)氧化微珠表面固定了小分子萊克多巴胺的蛋白全抗原，并采用基于此的微珠芯片實(shí)時(shí)檢測(cè)平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)萊克多巴胺的在線檢測(cè)，最低檢測(cè)限達(dá)到0.04 μg/L，檢測(cè)范圍為0.04～1.00 μg/L，并且1次檢測(cè)時(shí)間不超過(guò)45 min。該系統(tǒng)靈敏、準(zhǔn)確、廉價(jià)，所以適宜大規(guī)模檢測(cè)的初篩實(shí)驗(yàn)，并能在食品檢測(cè)中發(fā)揮作用。

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Detection of Ractopamine Residue in Meat Product by Microbead Biochip Based on Immunization

HU Lei，ZUOPeng，YEBang-ce
（School of Biotechnology，EastChinaUniversity of Science andTechnology，Shanghai 200237，China）

A kind of fluidic biochip based on competitive immunoreaction occurred on the funcational bead was constructed，the holoantigenof small molecularractopamine was immobilized on the epoxy-modified beads，then it reacted with the primary antibody and secondary antibody in turn.At last，signal was outputted.The internal standard-calibration curve method was used in detection，a calibration curve of competitive immunoreaction was made by using the standard sample before detecting actual samples，then detection of actual samples was carried out.The LOD（limit of detection）reached0.03 μg/L，detectiontime was less than45 min.

Microbeadbiochip；Epoxidation；Ractopamine；Drug residue；Limitof detection

O658

A

1671-0460（2010）04-0481-04

2010-06-28

胡 磊（1987-），男，湖北荊州人，碩士研究生，主要從事生物芯片研究。E-mail：hl3632086@163.com。