蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定及其來源分析

易松強(qiáng)，鄭火青，張翠平，魏文挺，胡福良*

蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定及其來源分析

易松強(qiáng)，鄭火青，張翠平，魏文挺，胡福良*

(浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

以對硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物，對蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明：蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定的最佳條件為以檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液為提取液，pH5.0，溫度60℃，底物濃度30mmol/L。酶促反應(yīng)在2.5h和37℃時酶促反應(yīng)曲線線性關(guān)系最好。研究還發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶可能是蜜蜂在采集加工過程中加入進(jìn)去的，同時，該酶活性還可能與蜂蜜的新鮮度相關(guān)。

蜂蜜；β-葡萄糖苷酶；酶活性；來源

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜或分泌物，經(jīng)過充分釀造而貯藏在巢脾內(nèi)的甜味物質(zhì)[1]。蜂蜜中含有豐富的生物酶，如淀粉酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖氧化酶、過氧化酶、磷酸酶等[2]。酶對熱穩(wěn)定性不強(qiáng)，若對蜂蜜長期貯存或進(jìn)行加工處理，酶的活性會逐步降低。因此，酶值是反應(yīng)蜂蜜質(zhì)量的一個重要指標(biāo)。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidaseEC3.2.1.21)又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，屬于纖維素酶類，別名龍膽二糖酶、纖維二糖酶和苦杏仁苷酶，是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶[3]，根據(jù)其底物特異性類屬于烴基β-葡萄糖苷酶、纖維二糖酶或水解烴基-β-糖苷基和寡聚糖的酶類。β-葡萄糖苷酶廣泛分布于植物、動物和微生物[4]。

β-葡萄糖苷酶活性的測定主要有以下3種方法[5]：一是Barush和Swiain法，它以水楊苷作底物，酶解產(chǎn)物用4-氨基安替比林作顯色劑，使釋放出來的水楊醇顯色，再用分光光度法比色測定；二是熒光法，利用傘形酮(7-羥基香豆素)與4-甲基傘形酮具強(qiáng)烈熒光的特點(diǎn)，將它們衍生為無熒光的底物，以此測定；三是比色法，以對硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物進(jìn)行酶解，底物水解后釋放出來的對硝基苯酚在波長400～420nm可見光范圍內(nèi)有特征吸收峰，可直接在此波長范圍比色測定。

本研究采用比色法測定不同蜂蜜的β-葡萄糖苷酶活性，并對其測定條件進(jìn)行優(yōu)化，包括反應(yīng)底物的濃度、緩沖液pH值、溫度、時間等。同時通過比較油菜花花蜜、蜜蜂體內(nèi)蜜囊中的蜂蜜和不同成熟度油菜花蜜的β-葡萄糖苷酶活性，分析蜂蜜中該酶的來源以及該酶與蜂蜜新鮮度的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油菜花花蜜、蜜囊蜜和油菜蜜均于2009年油菜花期采自浙江省平湖市；洋槐蜜和椴樹蜜陳蜜于2008年分別采自遼寧和吉林，由杭州健蜂蜂業(yè)有限公司提供。

對硝基苯酚(化學(xué)純)；對-硝基苯-β-D-葡萄糖苷Chemsynlab公司；其他試劑均為分析純；所用水均為蒸餾水。

UV2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司；電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；DK-8D型電熱恒溫水槽 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 油菜花花蜜

在油菜花盛開期，隨機(jī)選定幾片油菜田作為實(shí)驗(yàn)區(qū)，同時選含苞待放花朵較多的花枝進(jìn)行套袋處理。在次日上午9:30～11:30用毛細(xì)吸管吸取花朵中的花蜜，置于冰浴的0.5mL離心管中，達(dá)到一定量后將其密封并貯存于－18℃冰箱中。共收集油菜花花蜜6小管，每小管約0.4mL(約0.5g)，共約2.4mL。每小管用2mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，檢測β-葡萄糖苷酶活性。1.2.2蜜囊蜜

在蜂箱巢門口，用鑷子夾住一定數(shù)量的返巢采集蜂并裝入樣品袋，然后用鑷子將蜜蜂的蜜囊取出，并把蜜囊扯破讓蜜囊中的蜜滴到1.5mL的離心管中，達(dá)到一定量后將其密封并放入－18℃冰箱里貯存。共收集蜜囊蜜6小管，每小管1.0mL(約1.4g)，共6.0mL。樣品冷凍于－18℃?zhèn)溆?。每小管?.0g用5mL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，檢測β-葡萄糖苷酶活性。

1.2.3 油菜蜜

在油菜花期間，當(dāng)日早晨，先將隨機(jī)選定的6個實(shí)驗(yàn)強(qiáng)群繼箱中的蜜脾全部搖空，傍晚搖出蜂蜜并分裝到50mL的離心管中，分裝完畢立即置于－18℃冰箱內(nèi)貯存。以相同方法分別在搖空蜜脾3d和6d后生產(chǎn)更高濃度的油菜蜜。經(jīng)測定，3種油菜蜜的濃度分別為37、39、41°Be。樣品冷凍于－18℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 白糖蜂蜜

在外界蜜粉源嚴(yán)重缺乏的季節(jié)，選擇6群強(qiáng)群搖空蜜脾后，早、中、晚各一次飼喂?jié)馓撬B續(xù)飼喂2d，2d后搖出蜂蜜(白糖蜂蜜)。各群蜂蜜樣品分裝后冷凍于－18℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 粗酶液配制

準(zhǔn)確稱取1.00g蜂蜜于25mL燒杯中，用少量檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解，然后轉(zhuǎn)移到10mL容量瓶中，并用上述緩沖液定容。

1.2.6 酶活力的定義

酶活力單位是每分鐘催化形成1μmoL對硝基苯酚所需要的酶量為一個酶活力單位。蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活力為每克蜂蜜具有的酶活力單位數(shù)。

1.2.7 β-葡萄糖苷酶活性的測定

取0.5mL粗酶液，加入0.5mL不同濃度對硝基苯基β-D-葡萄糖苷(pNPG)。將此反應(yīng)混合液在不同溫度的水浴鍋內(nèi)水浴不同時間，待反應(yīng)結(jié)束后，立即加入2.5mL 1mol/L Na2CO3終止液終止反應(yīng)，冷卻至室溫后在400nm波長處測定吸光度[6]。另外，取相同條件的反應(yīng)液立即置于沸水浴中加熱5min滅活后加入2.5mL 1mol/L Na2CO3溶液，作為空白對照。

1.2.8 pH值和底物濃度對酶活性的影響

配制不同pH值(pH 4、5、6、7)的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4、5、6、7)，在37℃，底物(pNPG)濃度為10mmol/L，反應(yīng)1.5 h后，在400nm波長處測定其吸光度。配制不同的底物濃度(10、20、30、40、50mmol/L)，以適合pH值的磷酸鹽緩沖液作為提取液，在37℃水浴中加熱1.5h后，在400nm波長處檢測其吸光度。每組數(shù)據(jù)3個重復(fù)，以平均數(shù)計。

1.2.9 溫度和反應(yīng)時間對酶活性的影響

設(shè)pH5.0，反應(yīng)時間為1.5h，分別測定30、40、50、60、70、80℃時400nm波長處的吸光度，檢測得出該酶最適反應(yīng)溫度。設(shè)pH5.0，反應(yīng)溫度為30、37、45、50℃且各溫度下反應(yīng)時間為0、0.5、1、1.5、2、2.5h，檢測酶促反應(yīng)曲線。每組數(shù)據(jù)3個重復(fù)，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 緩沖液pH值對酶活性的影響

圖1 緩沖液pH值對酶活性的影響Fig.1 Effect of buffer pH on β-glucosodase activity

由圖1可知，3種蜂蜜都在pH 5.0時吸光度達(dá)到最大值，可知測定蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性所用緩沖液以pH 5.0為最佳。

2.2 溫度和反應(yīng)時間對酶活性的影響

如圖2所示，隨著反應(yīng)溫度的上升，酶活力顯著增加。但當(dāng)溫度繼續(xù)升高到60℃時，其酶活力逐步降低，表明該酶的最適溫度是60℃。

按1.2.9節(jié)方法，測400nm波長處吸光度，由圖3可見，線性回歸方程分別為y = 0.1946x + 0.0373，R2= 0.9746；y = 0.3466x－0.0144，R2= 0.9986；y = 0.3886x + 0.0527，R2= 0.9891；y = 0.4739x + 0.0768，R2= 0.98。從以上數(shù)據(jù)可知，酶促反應(yīng)在2.5h內(nèi)的線性關(guān)系中37℃最好，其他相對次之。所以，蜂蜜中β-葡萄糖苷酶酶活性分析條件以37℃最適。

圖2 反應(yīng)溫度對酶活性的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on β-glucosidase activity

圖3 不同溫度、時間的酶促反應(yīng)曲線Fig.3 β-glucosidase reaction curves at different temperatures

2.3 不同底物濃度對酶活性的影響

底物濃度是決定酶反應(yīng)速率的一關(guān)鍵因素。在低底物濃度時，反應(yīng)速率與底物濃度成正比；當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃髸r，隨著底物濃度增加，反應(yīng)速率亦雖隨之增加，但不會與底物濃度成正比；當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾拥揭欢ǔ潭群螅磻?yīng)速率不受底物濃度的影響而趨于恒定，這時表明已達(dá)到測定酶活性時底物過量的要求。底物濃度對酶活性的影響見圖4。

圖4 不同底物濃度對酶活性的影響Fig.4 Substrate concentration dependence of β-glucosidase activity

由4圖可知，當(dāng)?shù)孜餄舛仍?～30mmol/L時，隨底物濃度的升高，其產(chǎn)物生成速率也加快；但當(dāng)?shù)孜餄舛冗M(jìn)一步增加時，產(chǎn)物生成速率不斷減小隨之趨于恒定。因此，測定蜂蜜中β-葡萄糖苷酶酶活性時，其底物濃度應(yīng)大于30mmol/L。

綜上可知，蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定的最佳條件是：檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液pH5.0，反應(yīng)溫度為37℃，最適反應(yīng)溫度為60℃，底物濃度大于30mmol/L，反應(yīng)時間在2.5h內(nèi)。

2.4 蜂蜜中β-葡萄糖苷酶的來源

表1 油菜花花蜜和蜜囊蜜中的β-葡萄糖苷酶活力Table 1 β-glucosidase activity of rape honey and honey from bee bag

由表1可知，油菜花花蜜中的β-葡萄糖苷酶活性很低，而蜜囊蜜中的β-葡萄糖苷酶活性相對較高。t檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，蜜囊蜜中的β-葡萄糖苷酶活性顯著高于油菜花花蜜中該酶的活性。油菜花花蜜中酶活A(yù)400nm值均小于0.100，而儀器測量的準(zhǔn)確度為0.100～0.900，所以測量結(jié)果誤差大、精確度偏低。

表2 不同濃度梯度油菜蜜的酶活力Table 2 β-glucosidase activity of different concentrations of rape honey

表3 飼喂白糖水蜂群所產(chǎn)蜂蜜的酶活力Table 3 β-glucosidase activity of honey produced by bee population fed white sugar

由表3可看出，喂以白糖水的蜂蜜均檢測出β-葡萄糖苷酶活性，且樣本5的酶活特別高。而在表2中，不同濃度油菜蜜間的β-葡萄糖苷酶活性存在一定的差異。兩兩t檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，C組酶活力對A組和B組均差異極顯著，而B組酶活力對A組差異不顯著。

3 討 論

在酶的提取過程中，緩沖液的種類及pH值對提取效果影響非常大。宋曉青等[7]在蠟梅β-葡萄糖苷酶的活性分析、分離純化與性質(zhì)的研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)緩沖液pH值為5.0時，各種緩沖液處理的酶活力均達(dá)到最高，且檸檬酸-檸檬酸三鈉處理的酶活力高于其他緩沖液。李華等[8]分別用不同緩沖液提取葡萄漿果中β-葡萄糖苷酶時，發(fā)現(xiàn)檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液pH6.0時提取效果最好。這表明，β-葡萄糖苷酶的來源不同，其酶性質(zhì)也存在差異，并且各研究中其酶的優(yōu)化條件不同，也使優(yōu)化結(jié)果不一致。本實(shí)驗(yàn)用檸檬酸-磷酸氫二鈉提取蜂蜜中的β-葡萄糖苷酶，對其pH值進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，最適pH值在5.0左右，比Low等[6]報道的蜂蜜中β-葡萄糖苷酶的最佳pH值為4.2略高，但與Pontoh等[9]研究的從Apis mellifera胃和蜜囊中分離純化到的β-葡萄糖苷酶的最優(yōu)pH值為5.0相一致。

在其他植物以pNPG為底物檢測β-葡萄糖苷酶活性的研究中，對該酶的優(yōu)化結(jié)果大致是最適pH值為4.5～6.5，最適溫度30～60℃。從大麥[10]分離純化得到的β-葡萄糖苷酶的最適pH值為5.0，這與Sue等[11]研究的結(jié)果相一致。但這比香菇(pH4.0)[12]、稻谷(pH 4.5)[13]、大豆(pH4.5)[14]略高，而比柑橘(pH5.5)[15]、玉米(pH5.8)[16]和香子蘭(pH 6.5)[17]要低。從大麥[12]、香菇[13]中分離純化得到的β-葡萄糖苷酶的最適溫度為60℃，這與本研究結(jié)果一致。但這比大豆(45℃)[14]、香子蘭(40℃)[17]高。該酶酶促反應(yīng)曲線的最佳溫度是37℃，這與宋曉青[7]報道的結(jié)果相一致。

β-葡萄糖苷酶在植物、動物、真菌和細(xì)菌中都有廣泛分布，已報道的β-葡萄糖苷酶的最適pH值大多數(shù)在酸性范圍，并且變化不是很大。其最適溫度在40～110℃之間都有分布：一般來說，來自植物的β-葡萄糖苷酶最適溫度在40℃左右，而來自古細(xì)菌的β-葡萄糖苷酶其熱穩(wěn)定性和最適溫度要高于普通微生物或動物來源的β-葡萄糖苷酶[18]。如古細(xì)菌Pyrococcus furiosus的β-葡萄糖苷酶其最適溫度為102～105℃[19]。這也說明不同來源的β-葡萄糖苷酶，其性質(zhì)存在一定差異。

從本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可推測，蜂蜜中的β-葡萄糖苷酶主要來源于蜜蜂，也就是說蜜蜂在采集加工的過程中添加了這種酶。這與Pontoh等[9]在研究中暗示，β-葡萄糖苷酶可能由蜜蜂的咽下腺產(chǎn)生并分泌到口器而傳遞到外界相吻合。在對蜂群喂以濃白糖水的實(shí)驗(yàn)中，也可以初步確定蜂蜜β-葡萄糖苷酶極有可能是蜜蜂在采集加工過程中添加到蜂蜜中的。而在油菜花花蜜中檢測β-葡萄糖苷酶，發(fā)現(xiàn)其活性非常低，這可能是因?yàn)槿藶椴杉鄣倪^程中混入了一些花粉或其他微生物。但是至于蜜蜂為什么要添加β-葡萄糖苷酶到蜂蜜中，仍然還不清楚。

β-葡萄糖苷酶作為蜂蜜中的一種酶，可能與淀粉酶、轉(zhuǎn)化酶等有相似的性質(zhì)，彼此間存在相互關(guān)聯(lián)，即通過檢測其中一種酶活性時就可以預(yù)測另一種酶活性高低[20]。也可能在加工貯藏過程中存在相同的變化趨勢，其酶活力都會有一個下降的過程。但β-葡萄糖苷酶能否作為評價蜂蜜新鮮度的一個指標(biāo)，有待進(jìn)一步的研究。

[1]曾志將. 養(yǎng)蜂學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003.

[2]陳盛祿. 中國蜜蜂學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2001.

[3]International Union of Biochemistry. Enzyme nomenclature: recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the nomenclature and classification of enzymes[M]. San Diego: Academic Press, 1992: 310.

[4]ROBINSON J．The oxford companion to wine[M]. United States: Oxford University Press lnc, 1999: 95.

[5]王華夫, 游小青. 茶葉中β-葡萄糖苷酶活性的測定[J]. 中國茶葉, 1996(3): 16-17.

[6]LOW N H, VONG K V, SPORNS P. A new enzyme, β-glucosidase, in honey[J]. Journal of Apicultural Research, 1986, 25: 178-181.

[7]宋曉青. 臘梅花β-葡萄糖苷酶的活性分析、分離純化與性質(zhì)的初步研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[8]李華, 高麗. 葡萄漿果中β-葡萄糖苷酶活性測定條件的研究[J]. 釀酒科技, 2007(8): 146-149.

[9]PONTOH J, LOW N H. Purification and characterization of β-glucosidase from honey bees (Apis mellifera)[J]. Insect Biochemistry and Molecular Biology, 2002, 32: 679-690.

[10]LEAH R, KIGEL J, SVENDSEN I, et al. Biochemical and molecular characterization of a barley seed beta-glucosidase[J]. Journal Biological Chemistry, 1995, 270: 15789-15797.

[11]SUE M, IWAMURA H. Purification and characterization of a hydroxamic acid glucoside β-glucosidase from wheat (Triticum aestivum L.) seedlings [J]. Planta, 2000, 210: 432-438.

[12]孫艷梅, 張永忠, 徐雅琴, 等. 香菇中部分純化β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)[J]. 食品工業(yè)科技, 2007(12): 63-68.

[13]AKIYAMA T, KAKU H, SHIBUYA N. A cell wall-bound beta-glucosidase from germinated rice: Purification and properties[J]. Phytochemistry, 1998, 48: 49-54.

[14]MASARU M, SASAKI J, MURAO S. Studies on β-glucosidase from soybeans that hydrolyze daizin and genistin: Isolation and characterization of an isozyme[J]. Biosci Biotech Biochem, 1995, 59: 1623-1627.

[15]CAMERON R G, MANTHEY J A, BAKER P A, et al. Purification and characterization of a beta-glucosidase from Citrus sinensis var. Valencia fruit tissue[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49: 4457-4462.

[16]CUEVAS L, NIEMEYER H M, JONSSON L M V. Partial purification and partial characterization of β-D-glucosidase from maize[J]. Phytochemistry, 1992, 31: 2069-2612.

[17]ODOUX E, CHAUWIN A, BRILLOUET J M. Purification and characterization of vanilla bean (Vantilla planifolia Andrews) β-D-glucosidase [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 3168-3173.

[18]王志江, 魏紅福. β-葡萄糖苷酶的研究[J]. 飼料工業(yè), 2006, 27(22): 20-22.

[19]彭喜春, 彭志英. β-葡萄糖苷酶的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J]. 江蘇食品與發(fā)酵, 2001(4): 22-25.

[20]HUIDOBRO J F, SANTANA F J, SANCHEZ M P, et al. Diastase, invertase and β-glucosidase activities in fresh honey from northwest Spain[J]. Journal of Apicultural Research, 1995, 34(1): 39-44.

Determination ofβ-Glucosidase Activity and Source in Honey

YI Song-qiang，ZHENG Huo-qing，ZHANG Cui-ping，WEI Wen-ting，HU Fu-liang*
(College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029, China)

The determination conditions of β-glucosidase activity in honey were investigated by using p-Nitrophany β-DGluopyranoside (pNPG) as substrate. The optimal reaction pH and temperature of β-glucosidase were 5.0 and 60 ℃, respectively. The enzymatic reaction curve at 37 ℃ and a substrate concentration of 30 mmol/L presented the best linearity. This enzyme may be added into honey during harvest and processing and its activity can be an indicator for the freshness of honey.

honey；β-glucosidase；enzyme activity；source

S896.1

A

1002-6630(2010)19-0241-04

2009-11-21

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(NYCYTX-43)

易松強(qiáng)(1987—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槊鄯淇茖W(xué)。E-mail：yisongqiang87@yahoo.cn

*通信作者：胡福良(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槊鄯淇茖W(xué)。E-mail：flhu@zju.edu.cn