李 艷，盧 君，張利中

沙城龍眼葡萄園土壤中酵母菌多樣性研究

李 艷1,2，盧 君1，張利中3

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018；3.中國長城葡萄酒有限公司，河北 沙城 075400)

為分離篩選具有產(chǎn)區(qū)特色的菌種，本實(shí)驗(yàn)采用梯度稀釋和劃線分離技術(shù)，從沙城地區(qū)3個(gè)龍眼葡萄園土壤中共分離得到210株酵母菌。按照形態(tài)表型分為9類，又利用核糖體5.8S rDNA-ITS區(qū)域RFLP方法將這9類酵母在分子水平上進(jìn)行了區(qū)分，其中兩類酵母為常見酵母，分別為東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)和熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)。實(shí)驗(yàn)證明了該地區(qū)土壤中酵母菌的多樣性。

龍眼葡萄；土壤；酵母；形態(tài)表型；RFLP方法；生物多樣性

沙城葡萄酒產(chǎn)區(qū)地處懷涿盆地，為我國著名的葡萄產(chǎn)地，位于北緯40°附近，是釀酒葡萄種植最理想的黃金地帶和我國重要的葡萄原料基地之一，也是我國地理標(biāo)志產(chǎn)品“沙城葡萄酒”的原產(chǎn)地。

土壤是各種微生物的天然棲息地，其中蘊(yùn)含著豐富的酵母菌資源。從葡萄園土壤中分離酵母菌是開發(fā)和利用優(yōu)良釀酒酵母菌種的基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)沙城產(chǎn)區(qū)龍眼葡萄園土壤進(jìn)行酵母菌的分離和鑒定，旨在探索土壤中酵母菌的生物多樣性，并確定其優(yōu)勢酵母菌種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2008年10月從河北省沙城釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)的懷來縣沙城鎮(zhèn)葡萄園采集土樣。2009年4月和10月分別于沙城鎮(zhèn)所屬沙營、夾河和東水泉3個(gè)自然村的龍眼葡萄園采集土樣。采樣方法是每個(gè)葡萄園按照三點(diǎn)采樣法，每個(gè)采樣點(diǎn)分別采集3個(gè)土壤樣品，7個(gè)來源的土壤樣品合計(jì)63份。

正向引物：ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)，反向引物：ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) 委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶cof I，HinfI，HaeIII均購自Promega公司。

1.2 培養(yǎng)基

YEPD液(固)體培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸粉10、胰蛋白胨20、葡萄糖20、瓊脂15，固體培養(yǎng)基可加入2%瓊脂。

WL瓊脂培養(yǎng)基(%)：酵母浸粉0.4、胰蛋白胨0.5、葡萄糖5、KH2PO40.055、KCl 0.0425、CaCl20.0125、MgSO40.0125、FeCl30.00025、MnSO40.00025、溴甲酚綠2.2、瓊脂2，pH5.5[1-3]。

1.3 方法

1.3.1 土壤樣品處理

稱取1g土壤，置于20mL YEPD液體培養(yǎng)基中搖勻，28℃搖床富集培養(yǎng)12h，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，取1mL富集培養(yǎng)液作為分離菌種的樣品。每份土壤樣品富集培養(yǎng)兩次作為平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 酵母菌分離流程

無菌條件下取1mL含菌的富集培養(yǎng)液 → 用無菌生理鹽水梯度稀釋(10～107倍)→ 將合適梯度的稀釋液涂布于YEPD固體培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)3d → 菌落計(jì)數(shù) →隨機(jī)選取不同形態(tài)的酵母單菌落15個(gè)，經(jīng)多次劃線培養(yǎng)，純化單菌落 → 接種于 WL培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)5d后根據(jù)菌落形態(tài)和細(xì)胞的顯微形態(tài)進(jìn)行酵母菌的初步表型分類。

1.3.3 酵母菌DNA提取

酵母菌DNA的提取采用SDS裂解法[4]。

1.3.4 酵母菌PCR-RFLP分析

酵母菌5.8S-ITS rRNA 基因的擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見參考文獻(xiàn)[5-8]。采用3種限制性內(nèi)切酶cofI、HaeIII和HinfI對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切分析，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件見參考文獻(xiàn)[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌形態(tài)的表型分類

利用YEPD培養(yǎng)基對(duì)葡萄園土壤樣品進(jìn)行菌種的分離，共分離得到210株酵母菌，經(jīng)WL培養(yǎng)基培養(yǎng)，根據(jù)菌落形態(tài)和細(xì)胞的顯微形態(tài)將其表型區(qū)分為9個(gè)不同的培養(yǎng)類型，結(jié)果見表1。

表1 酵母菌形態(tài)分類統(tǒng)計(jì)Table 1 Morphological features of yeast isolates

根據(jù)表1的結(jié)果，參考楊瑩等[1]和Cavazza等[3]描述的酵母菌在WL培養(yǎng)基上的菌落特征, 可以推測出以上酵母菌可能的種屬分類，類型4與文獻(xiàn)[3]中描述的紅色，球形突起，突面，表面光滑、黏稠，黃油狀的酵母菌相似，推測其可能為紅酵母(Rhodutorula)，類型6與文獻(xiàn)[1,3]中描述的綠色，扁平，表面光滑不透明，黃油狀的酵母菌相似，推測其可能為有孢漢遜酵母(Hanseniaspora uvarum)，類型7為異常漢遜酵母(Hansenula anomala)，類型9與文獻(xiàn)[1,3]中描述的奶油色帶綠色球形突起，表面光滑、不透明，奶油狀的酵母菌相似，推測其可能為釀酒酵母(Saccharomyce scerevisiae)，類型1、2、3、5、8的酵母菌沒有查到相關(guān)文獻(xiàn)所匹配的菌落類型。由以上結(jié)果可以看出利用WL培養(yǎng)基雖然不能將全部酵母鑒定到種屬水平，但是在酵母的形態(tài)分類方面具有較好的識(shí)別能力。

從表1還可看出，在不同年份、不同季節(jié)和不同地理位置的葡萄園中出現(xiàn)的酵母菌種類不同。2008年釀酒季節(jié)從沙營葡萄園土壤中分離得到2種形態(tài)的酵母菌，而在2009年的釀酒季節(jié)就得到了4種形態(tài)的酵母菌，在非釀酒季節(jié)的春季得到2種形態(tài)的酵母菌。夾河和東水泉葡萄園土壤中2009年春季分別分離到2種形態(tài)的酵母菌，都少于釀酒季節(jié)，2009年10月夾河和東水泉葡萄園土壤中分別分離到5種和3種形態(tài)的酵母菌。3次采樣的結(jié)果為沙營龍眼葡萄園土壤共分離得到了6種形態(tài)的酵母菌，夾河和東水泉分別為6種和5種形態(tài)的酵母菌。在2009年春季3個(gè)葡萄園土壤中都分離到形態(tài)3酵母菌，2009年釀酒季節(jié)3個(gè)葡萄園土壤中都分離到形態(tài)2、6、9酵母菌。3個(gè)葡萄園均處沙城鎮(zhèn)，相距不太遠(yuǎn)，土質(zhì)和氣候基本相似，均為沙石土壤、地域開闊、通風(fēng)良好、光照充足。但是因地理位置不同，土質(zhì)和微氣候略有差異，東水泉是中糧酒業(yè)長城桑干酒莊所在地，土壤中含沙量高、礫石較大。夾河是“萬畝葡萄示范園”所在地，葡萄園背靠大山位于西坡側(cè)光，坡度約30～40度，海拔約50～100米。沙營和東水泉均為開闊的平地，但沙營的土質(zhì)沙礫較小。

2.2 酵母菌群組成

本研究對(duì)分離得到的各種形態(tài)的酵母菌落進(jìn)行了菌落計(jì)數(shù)和分析，不同地理位置的葡萄園、不同年份、不同季節(jié)采集的土壤樣品，經(jīng)過富集培養(yǎng)，培養(yǎng)液中酵母菌種類及各種酵母菌占總酵母菌數(shù)的百分比見表2。由此可以反映土壤中常見的酵母菌類型及分布情況。

由表2可看出，不同來源的土壤樣品中酵母菌群組成各不相同，優(yōu)勢菌種的類型也不相同。2009年釀酒季節(jié)降雨少于2008年同期，2009年的氣候更適合龍眼葡萄的生長，同期采集的葡萄成熟度高于2008年，含糖量高，故酵母菌種類也較豐富。春季采集的土壤樣品中酵母菌落總數(shù)少于秋季，是由于該地區(qū)風(fēng)沙較大、氣溫偏低，不適宜酵母菌的大量繁殖。在涉及到連續(xù)兩個(gè)年份兩個(gè)季節(jié)的3次采樣中，只有形態(tài)2的酵母菌在3次采樣中都分離到，形態(tài)1的酵母菌在連續(xù)兩個(gè)釀酒季節(jié)出現(xiàn)，說明這兩種酵母菌是沙營葡萄園土壤中最常見的酵母菌。

表2 不同采集地點(diǎn)的土壤富集培養(yǎng)液中酵母菌出現(xiàn)頻率Table 2 Distribution of 9 classified yeast groups in the enrichment culture of vineyard soil

2.3 酵母菌5.8S-ITS基因RFLP分析

在形態(tài)表型分類的基礎(chǔ)上，利用分子手段對(duì)酵母菌進(jìn)行分類鑒定，根據(jù)核糖體5.8S rDNA-ITS區(qū)域的RFLP分析結(jié)果，得到了9種不同的酶切片段圖譜，根據(jù)酶切產(chǎn)物片段大小的不同，將分離得到的酵母菌在分子水平上進(jìn)行了區(qū)分，對(duì)比Guillamón等[9]和Esteve-Zarzoso等[10]學(xué)者建立的初始酵母菌數(shù)據(jù)庫，將其中5種酵母進(jìn)行了分類鑒定，結(jié)果見表3。

表3 土壤中酵母菌株5.8S rDNA-ITS區(qū)域的RFLP分析結(jié)果Table 3 RFLP analysis of 9 classified yeast groups

從表3可以看出，利用HaeIII、Hinf I和cof I這3種限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切片段大小范圍為70～750bp，顯示出這9種酵母菌株的基因多樣性。將本實(shí)驗(yàn)中分離得到的9類酵母菌的酶切產(chǎn)物片段與數(shù)據(jù)庫中模式菌株進(jìn)行比對(duì)，能夠鑒定出5類酵母菌，另外4類酵母菌需要進(jìn)一步的研究，如比對(duì)數(shù)據(jù)更全的數(shù)據(jù)庫(http://www.yeast-id.com/)，該數(shù)據(jù)庫每年都在更新[10]。

由以上結(jié)果可知，通過對(duì)比數(shù)據(jù)庫得到的鑒定結(jié)果與利用WL培養(yǎng)基得到的鑒定結(jié)果一致，說明WL培養(yǎng)基在鑒定酵母菌種類方面具有較高的準(zhǔn)確性。

不同季節(jié)分離得到的酵母菌株，其PCR擴(kuò)增圖譜和酶切圖譜分別見圖1～3。

圖1 2008年10月沙營、夾河、東水泉葡萄園土壤酵母菌5.8S-ITS區(qū)域PCR-RFLP圖譜Fig.1 5.8S ITS RFLP patterns of yeast strains isolated from the soils from Shaying, Jiahe and Dongshuiquan vineyards in October, 2008

圖2 2009年4月沙營、夾河、東水泉葡萄園土壤中酵母菌5.8S-ITS區(qū)域PCR-RFLP圖譜Fig.2 5.8S ITS RFLP patterns of yeast strains isolated from the soils from Shaying, Jiahe and Dongshuiquan vineyards in April, 2009

圖3 2009年10月沙營、夾河、東水泉葡萄園土壤中酵母菌5.8S-ITS區(qū)域PCR-RFLP圖譜Fig.3 5.8S ITS RFLP patterns of yeast strains isolated from the soils from Shaying, Jiahe and Dongshuiquan vineyards in October, 2009

從以上電泳圖能夠看出，每種形態(tài)類型的酵母菌都對(duì)應(yīng)一種獨(dú)特的酶切圖譜類型，在2009年10月，分離得到的酵母菌類型最豐富，有6種，而在2008年10月的土壤樣品中只有兩個(gè)不同類型的酵母菌。有些酵母菌在兩個(gè)釀酒年份均可分離得到，并具有相同的電泳圖譜類型，說明這些酵母菌可能來自于不同菌源，是該地區(qū)相對(duì)普遍存在的酵母菌種。

2.4 酵母菌5.8S-ITS基因序列分析

在以上研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)于兩個(gè)年份的釀酒季節(jié)都分離到的形態(tài)1和2酵母菌，以及在2009年出現(xiàn)在3個(gè)葡萄園中，相對(duì)出現(xiàn)頻率較高的形態(tài)9酵母菌進(jìn)行核糖體5.8S-ITS基因序列分析[9-11]，對(duì)這3種酵母菌5.8SITS基因RFLP的鑒定結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表4。

表4 酵母菌5.8S-ITS區(qū)域的基因序列分析結(jié)果Table 4 5.8S-ITS sequence analysis of three selected yeast stains

由表4可見，菌落類型1、2的酵母菌，其序列分析鑒定結(jié)果與酵母菌5.8S-ITS基因RFLP分析的鑒定結(jié)果完全一致，菌落類型9的酵母菌通過序列分析被進(jìn)一步鑒定為釀酒酵母的雜交菌株(Saccharomyces bayanus× Saccharomyces cerevisiae)。序列分析的結(jié)果驗(yàn)證了5.8 SrDNA-ITS基因RFLP分析鑒定酵母菌種屬的準(zhǔn)確性。以上結(jié)果能夠確定沙城產(chǎn)區(qū)龍眼葡萄園土壤中最常見的酵母菌種分別為東方伊薩酵母(Issatchenkia orientalis)和熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)。釀酒酵母(Saccharomyces bayanus×Saccharomyces cerevisiae)是2009年釀酒季節(jié)土壤中普遍存在的酵母菌。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)在連續(xù)兩年內(nèi)對(duì)沙城產(chǎn)區(qū)三個(gè)龍眼葡萄園采集土壤樣品進(jìn)行菌種分離，對(duì)分離得到的酵母菌進(jìn)行分類鑒定采用的是傳統(tǒng)形態(tài)表型觀察與分子鑒定相結(jié)合的方法，確保了分類鑒定結(jié)果的可靠性。實(shí)驗(yàn)最終確定了沙城產(chǎn)區(qū)龍眼葡萄園土壤中酵母菌的生物多樣性組成，及常見的酵母菌種屬。龍眼葡萄是原產(chǎn)于我國的特色優(yōu)良釀酒和鮮食兩用葡萄品種，適合于釀造干白葡萄酒、白蘭地和起泡葡萄酒，在沙城地區(qū)有400年的種植歷史，在該地區(qū)分離篩選酵母菌，研究它們的生物多樣性對(duì)篩選和利用本土酵母菌并開發(fā)具有我國特色的葡萄酒產(chǎn)品具有實(shí)用價(jià)值。

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Biodiversity of Yeast in Soils from Longan Grape Plantations in Shacheng Region

LI Yan1,2，LU Jun1，ZHANG Li-zhong3
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China；2. R&D Center for Fermentation Engineering of Hebei Province, Shijiazhuang 050018, China；3. China Great Wall Wine Co. Ltd., Shacheng 075400, China)

To isolate and screen characteristic yeast strains, 210 yeast strains were isolated from soils from three Longan grape plantations in Shacheng region by gradient dilution and streak plate methods. These stains were classified into nine groups according to their morphological phenotypes, and the nine groups were identified by 5.8S ITS restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, and two of them, Issatchenkia orientalis and Candida tropicalis, were common yeast strains. This study confirms the biodiversity of yeast in the oil of this region.

Longan vineyard；soil；yeast；morphological phenotypes RFLP method；biodiversity

TQ92

A

1002-6630(2010)19-0313-04

2010-05-31

河北省2009年科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(092210003D)

李艷(1958—)，女，教授，本科，主要從事傳統(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術(shù)研究。E-mail：lymdh5885@163.com