趙 強(qiáng)，鐘紅蘭，熊 華*，史蘇華，鄧 波，李 薇

米肽-葡萄糖濕法接枝反應(yīng)產(chǎn)物的功能性質(zhì)

趙 強(qiáng)，鐘紅蘭，熊 華*，史蘇華，鄧 波，李 薇

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

以米渣為原料制備的米肽與葡萄糖進(jìn)行濕法接枝反應(yīng)，考察影響反應(yīng)產(chǎn)物功能性質(zhì)(乳化及乳化穩(wěn)定性、抗氧化性)的4種因素。結(jié)果表明：隨著反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的增加，產(chǎn)物接枝度、褐變度增大，抗氧化性增強(qiáng)，時間過長則接枝度、乳化性及乳化穩(wěn)定性逐漸降低；隨著反應(yīng)起始pH6～10升高，米肽和接枝產(chǎn)物的乳化性均增加，抗氧化性和乳化穩(wěn)定性先增后減，且產(chǎn)物的乳化性和抗氧化性均大于米肽，pH值為8時接枝產(chǎn)物還原力達(dá)0.798；隨著反應(yīng)底物質(zhì)量濃度增加，米肽和接枝產(chǎn)物的乳化性均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，乳化穩(wěn)定性有明顯提高，抗氧化性增強(qiáng)；米肽和葡萄糖質(zhì)量比對產(chǎn)物的乳化性作用明顯，其質(zhì)量比為1:2時乳化性提高最顯著，提高幅度達(dá)35.13%；其質(zhì)量比對產(chǎn)物的抗氧化性影響不明顯。

米肽；接枝反應(yīng)；乳化性；抗氧化性

采用蛋白-多糖的接枝反應(yīng)，即基于蛋白的氨基端與多糖的羰基還原端之間發(fā)生的美拉德反應(yīng)，可以改善蛋白質(zhì)溶解性、熱穩(wěn)定性、乳化性、抗氧化活性以及抗變應(yīng)原性等功能性質(zhì)[1-2]。美拉德反應(yīng)又稱為“非酶褐變反應(yīng)”，研究表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物亦即蛋白-還原糖接枝物具有很好的抗氧化和乳化性能[3-4]。近年來，國內(nèi)外研究對蛋白-多糖的反應(yīng)產(chǎn)物的功能性質(zhì)的報道越來越多[4-6]，已成為食品營養(yǎng)與蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域的熱門課題，旨在將其應(yīng)用于食品體系來提高產(chǎn)品的抗氧化穩(wěn)定性。

植物水解蛋白是一類通過酸、堿或酶水解大豆、小麥、玉米等植物蛋白得到含有大量多肽、游離氨基酸的蛋白混合物[7]，其來源廣泛、價格低廉、溶解性優(yōu)良和營養(yǎng)價值較高，在食品生產(chǎn)中應(yīng)用前景廣闊，主要是作為原料制備美拉德反應(yīng)型肉味香精[8]，或作為提升食品感官和營養(yǎng)品質(zhì)的添加成分。

米肽是大米蛋白的酶法水解物，具有抗氧化[9]、抑制ACE活性[10]等功能，但由于酶解產(chǎn)生了大量的短肽，乳化性和穩(wěn)定性大大降低[11]，直接影響了食品品質(zhì)。本研究以酶法制備米肽，選用葡萄糖作為糖供體，采用濕法接枝反應(yīng)制備米肽-葡萄糖接枝產(chǎn)物，考察反應(yīng)條件對乳化性、乳化穩(wěn)定性及抗氧化性的影響，并比較接枝前后性質(zhì)的變化，旨在探討米肽與葡萄糖之間發(fā)生的接枝反應(yīng)，改善米肽的功能性質(zhì)，為其工業(yè)化應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米渣(蛋白質(zhì)含量(59.61±0.91)%) 江西恒天實業(yè)有限公司。

胰蛋白酶(酶活力4000U/g) 無錫市酶制劑廠；2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)、十二烷基磺酸鈉(SDS) 美國Sigma公司；葡萄糖、三氯乙酸、三氯化鐵、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等均為化學(xué)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BS224S萬分天平、PB-10型pH計 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；TDL-5型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；RH basic 1磁力攪拌器 德國IKA公司；FSH-Ⅱ型高速電動勻漿器 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；KDY- 9820凱氏定氮儀 廈門精藝興業(yè)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米肽的制備

米肽的制備按照本課題組已報道的方法進(jìn)行[12]，控制水解度＜10%；米肽蛋白質(zhì)含量＞85%，產(chǎn)率≥33%；短肽含量占米肽中總蛋白質(zhì)含量的74.27%，其中93%短肽的分子質(zhì)量小于10kD，近70%短肽分子質(zhì)量范圍為5kD＞MW＞1kD。

1.3.2 米肽-葡萄糖接枝物制備

工藝流程：米肽粉+葡萄糖→加水溶解→調(diào)節(jié)pH值→加熱→冷卻→接枝物(4℃冷藏)

準(zhǔn)確稱取1g米肽粉和0.5g葡萄糖(即按照質(zhì)量比2:1)，加入去離子水配成質(zhì)量濃度1g/100mL的米肽溶液，用0.1mol/L的NaOH和HCl調(diào)節(jié)到所需的pH值，分別在70、80、90℃水浴中加熱，每組3個平行，分別在反應(yīng)后0、0.5、1.0、1.5、2.0h取出反應(yīng)液10mL置于試管中，立即冰浴冷卻10min，所得透明反應(yīng)液即接枝產(chǎn)物，于4℃冷藏待測。

1.3.3 米肽-葡萄糖產(chǎn)物接枝度(degree of graft，DG)的測定

參照文獻(xiàn)[13]中的TNBS法略作改進(jìn)。取0.125mL接枝物溶液，加入5mL 0.1g/100mL SDS，渦旋振蕩混勻，從中取0.250mL加入到盛有2mL PBS緩沖液(0.05mol/L，pH8.2)的試管中，再加入1mL 0.1g/100mL TNBS溶液，渦旋振蕩混勻，在50℃水浴中避光反應(yīng)1h，然后取出加入2mL 0.1mol/L HCl終止反應(yīng)，室溫下放置30min，于340nm波長處測定吸光度。按式(1)計算接枝度。

式中： A0為接枝反應(yīng)前樣品的吸光度；At為反應(yīng)t時刻后樣品的吸光度。

1.3.4 接枝物褐變度的測定[14]

取0.125mL接枝物溶液，加入5mL 0.1g/100mL SDS溶液，渦旋振蕩混勻，在420nm波長處測定吸光度，以0.1g/100mLSDS溶液做空白對照。

1.3.5 接枝物乳化性及乳化穩(wěn)定性的測定

采用濁度法[15]，稍作改進(jìn)：取16mL接枝物溶液與4mL大豆油混合，在10000r/min條件下高速剪切乳化1min，用微量進(jìn)樣器準(zhǔn)確量取容器底部0.5cm處50μL的乳化液，加入到5mL 0.1g/100mLSDS溶液中混合均勻，即時測定500nm波長處的吸光度A0表示乳化性(emulsifying activity，EA)，以0.1g/100mLSDS做空白對照。靜置10min后重新取樣測定吸光度At，則乳化穩(wěn)定性(emulsifying stability，ES)可表示為：

式中：Δt為兩次測定乳化活性的時間間隔，本實驗中該值為10min。

1.3.6 接枝物抗氧化性的測定

接枝反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化效果與其還原力密切相關(guān)。還原能力大的樣品是良好的電子供體，其供應(yīng)的電子能使Fe3+還原成Fe2+，同時能與自由基反應(yīng)，中斷自由基的連鎖反應(yīng)使自由基成為較為穩(wěn)定的物質(zhì)[16]。還原力越強(qiáng)，抗氧化性越強(qiáng)，因此可通過測定還原力來說明抗氧化活性的強(qiáng)弱。

還原力測定方法[17]如下：取lmL接枝物溶液于具塞的離心管中，加入2.5mL PBS緩沖液(0.2mol/L，pH6.6)和2.5mL 10g/100mLK3Fe(CN)6溶液，混合均勻，50℃水浴保溫20min后待冷卻后加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸溶液，混勻后3000r/min離心10min。取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1g/100mLFeCl3，渦旋振蕩混勻，靜置10min后測定700nm波長處的吸光度，吸光度越大，樣品的還原能力越大，亦即抗氧化性越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 米肽-葡萄糖接枝反應(yīng)

蛋白質(zhì)-還原糖的接枝反應(yīng)，主要通過測定接枝度和褐變度。在米肽質(zhì)量濃度10mg/mL、米肽和葡萄糖質(zhì)量比2:1、pH7.0的反應(yīng)條件下，考察不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間下的米肽-葡萄糖(peptides-glucose，P-G)接枝物接枝度和褐變度的變化。結(jié)果見圖1。

圖1 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的米肽-葡萄糖接枝物褐變度和接枝度Fig.1 Plots of browning degree and DG of GRPs obtained at different temperatures versus reaction time

從圖1A、B可以看出，反應(yīng)溫度升高，反應(yīng)時間延長有利于米肽-葡萄糖接枝反應(yīng)的進(jìn)行。在90℃、反應(yīng)1h時接枝度最大，達(dá)39.62%；90℃、2h時體系的褐變程度最高；但溫度為80℃和90℃時、時間超過1h后，接枝度均略有下降，原因可能是反應(yīng)進(jìn)入到后期階段，接枝物可逆降解、或進(jìn)一步聚合等反應(yīng)所造成。

2.2 米肽-葡萄糖接枝物的乳化性(EA)及乳化穩(wěn)定性(ES)

2.2.1 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對米肽-葡萄糖接枝物乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

在米肽質(zhì)量濃度10mg/mL、米肽和葡萄糖質(zhì)量比2:1、 pH7.0的反應(yīng)條件下，研究不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對P-G接枝物的乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖2A、B。

圖2 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的米肽-葡萄糖接枝物乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.2 Plots of EA and ES of GRPs obtained at different temperatures versus reaction time

由圖2A可知，反應(yīng)溫度升高，米肽接枝葡萄糖接枝物的乳化性有所減小；而同一溫度下隨時間延長接枝物的乳化性先增加后減??；在70℃反應(yīng)1.5h時接枝物乳化性達(dá)到最大值0.498。原因可能是米肽接枝上葡萄糖，增加了米肽的疏水性，同時在反應(yīng)條件較為溫和的70℃反應(yīng)1.5h時反應(yīng)體系疏水-親水性達(dá)到了平衡；另一方面，隨溫度升高反應(yīng)程度加劇，1h即達(dá)到最大的接枝度(圖1B)，反應(yīng)體系pH值下降很快，導(dǎo)致乳化性隨溫度增加有所減小。由圖2B可知，接枝物的乳化穩(wěn)定性隨時間增加是下降的，到1.5h時趨于穩(wěn)定，反應(yīng)溫度為80℃時下降最明顯。

2.2.2 反應(yīng)起始pH值對米肽和米肽-葡萄糖接枝物乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

在溫度80℃、時間1h、米肽質(zhì)量濃度10mg/mL，米肽和葡萄糖質(zhì)量比2:1的反應(yīng)條件下，研究反應(yīng)起始pH值對P-G接枝物乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 不同起始反應(yīng)pH值條件下接枝反應(yīng)前后米肽和米肽-葡萄糖接枝物的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.3 EA and ES of rice peptides before and after grafting with glucose at different initial pHs

由圖3A可知，pH值升高，米肽和米肽-葡萄糖接枝物的乳化性均增加，且與不加糖的肽相比，在不同的起始反應(yīng)pH值下接枝物的乳化性均得到顯著改善(P＜0.05)。這除了與pH值升高溶解性增加有關(guān)外，還因為在堿性條件下，由于－OH的作用，使—COOH增多，增加了分子間的靜電斥力，使離散雙電層加厚，溶液界面膜加厚，同時有利于膠束的形成，因此乳化活性得到提高。由圖3B可知，米肽和P-G接枝物的乳化穩(wěn)定性均是先增后減，在起始pH6、7、8時均顯示米肽比P-G接枝物的乳化穩(wěn)定性更好，但在pH9、10時則是P-G接枝物的乳化穩(wěn)定性強(qiáng)于米肽。

2.2.3 底物質(zhì)量濃度對米肽和米肽-葡萄糖接枝物乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

在溫度80℃、時間1h、米肽和葡萄糖質(zhì)量比2:1、pH7的反應(yīng)條件下，考察底物質(zhì)量濃度(3、6、9、12、15mg/mL)對接枝物乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同底物質(zhì)量濃度接枝反應(yīng)前后米肽和米肽-葡萄糖接枝物的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.4 EA and ES of rice peptides before and after grafting with glucose at different substrate concentrations

由圖4A可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增大，米肽和P-G接枝物的乳化性均先增加后減??；P-G接枝物的乳化性并沒顯著改善，但是質(zhì)量濃度為9mg/mL和12mg/mL時乳化穩(wěn)定性有明顯的提高(圖4B)(P＜0.05)。原因可能是濃度較低時，增大質(zhì)量濃度則參與乳化的肽增多，乳化性增強(qiáng)，但質(zhì)量濃度達(dá)到一定程度時，溶液黏度上升，分子流動性變差，影響了P-G接枝物反應(yīng)，接枝度降低，導(dǎo)致乳化性降低。

2.2.4 米肽-葡萄糖質(zhì)量比對米肽和米肽-葡萄糖接枝物乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

在溫度80℃、時間1h、米肽質(zhì)量濃度10mg/mL、pH7的反應(yīng)條件下，考察米肽和葡萄糖質(zhì)量比對P-G接枝物乳化性和乳化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同米肽和葡萄糖質(zhì)量比條件下接枝反應(yīng)前后米肽和米肽-葡萄糖接枝物的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.5 EA and ES of rice peptides before and after grafting with glucose at rice peptide/glucose mass ratios

由圖5A可知，米肽和葡萄糖質(zhì)量比對P-G的乳化性作用明顯，米肽和P-G接枝物的乳化性都隨米肽與葡萄糖質(zhì)量比的下降先增加后減小，接枝反應(yīng)后的乳化性均有提高，在米肽和葡萄糖質(zhì)量比為1:2時乳化性提高幅度最大，達(dá)35.13%。圖5B表明乳化穩(wěn)定性則呈現(xiàn)先減后增的趨勢，P-G接枝物的乳化穩(wěn)定性除了質(zhì)量比為1:2時稍有增加，其余都減小。原因是葡萄糖量過多反而會影響溶液的黏度和分子流動性，繼而影響P-G接枝物反應(yīng)，接枝度降低，從而影響乳化性。

2.3 米肽-葡萄糖接枝物的抗氧化性

2.3.1 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對米肽-葡萄糖接枝物還原力的影響

在米肽質(zhì)量濃度為10mg/mL、米肽和葡萄糖質(zhì)量比為2:1、pH7的條件下，不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對P-G接枝物還原力的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間的P-G接枝物還原力Fig.6 Plots of reducing power of GRPs obtained at different temperatures versus reaction time

由圖6可知，還原力的變化與圖1中反應(yīng)溫度和時間對褐變度的影響曲線有一致性。溫度升高，褐變度增加，P-G中類黑素[18]濃度增加，抗氧化性增強(qiáng)。馬志玲等[19]的研究也得出同樣的結(jié)論，產(chǎn)生類黑素的同時，有一系列的美拉德反應(yīng)中間體-還原酮類物質(zhì)及雜環(huán)類化合物生成，這些產(chǎn)物對抗氧化性也有一定的貢獻(xiàn)作用。

2.3.2 反應(yīng)起始pH值對米肽-葡萄糖接枝物還原力的影響

在溫度80℃、時間1h、米肽質(zhì)量濃度10mg/mL、米肽和葡萄糖質(zhì)量比2:1的反應(yīng)條件下，研究起始反應(yīng)pH值對P-G接枝物還原力的影響。結(jié)果見圖7。

圖7 不同起始反應(yīng)pH值條件下接枝反應(yīng)前后米肽和P-G接枝物的還原力Fig.7 Reducing power of rice peptides before and after grafting with at different initial pHs

由圖7可知，米肽和P-G接枝物的抗氧化性均隨pH值的升高先增加后減小，接枝后的抗氧化性要明顯大于接枝前，pH8時米肽和米肽-葡萄糖接枝物的還原力最大，達(dá)0.798，但整體看在pH6～10范圍內(nèi)，起始反應(yīng)pH值對抗氧化性的影響不顯著(P＞0.5)。

2.3.3 底物質(zhì)量濃度對米肽-葡萄糖接枝物還原力的影響

在溫度80℃、時間1h、米肽和葡萄糖質(zhì)量比2:1、pH7的反應(yīng)條件下，研究底物質(zhì)量濃度對P-G接枝物還原力的影響，結(jié)果如圖8所示。隨著底物質(zhì)量濃度的增大，P-G接枝物的還原力顯著增加，原因主要是反應(yīng)過程隨著米肽質(zhì)量濃度增大，自身的抗氧化性在增強(qiáng)。

圖8 不同底物濃度接枝反應(yīng)后P-G接枝物的還原力Fig.8 Reducing power of rice peptides before and after grafting with at different substrate concentrations

2.3.4 米肽-葡萄糖質(zhì)量比對還原力的影響

在反應(yīng)溫度80℃、時間1h、米肽質(zhì)量濃度10mg/mL、pH7的條件下，研究米肽-葡萄糖的質(zhì)量比對P-G還原力的影響，結(jié)果見圖9。當(dāng)質(zhì)量比為1:1時，P-G的還原力最大，但還原力并未因為其質(zhì)量比的改變出現(xiàn)明顯的變化，說明質(zhì)量比對其影響不顯著。

圖9 不同米肽和葡萄糖質(zhì)量比條件下接枝反應(yīng)后P-G接枝物的還原力Fig.9 Reducing power of rice peptides before and after grafting with at different rice peptide/glucose mass ratios

3 結(jié) 論

米肽-葡萄糖接枝反應(yīng)隨反應(yīng)溫度升高、時間延長，產(chǎn)物接枝度和褐變度增大，其抗氧化性增強(qiáng)；時間過長則接枝度、乳化性及乳化穩(wěn)定性逐漸降低；反應(yīng)起始pH值升高，米肽和接枝產(chǎn)物的乳化性均增加，抗氧化性和乳化穩(wěn)定性隨反應(yīng)時間先增后減，接枝產(chǎn)物乳化性和抗氧化性增加幅度明顯高于米肽；隨著反應(yīng)底物濃度增加，米肽和接枝產(chǎn)物的乳化性均呈現(xiàn)先增后減的趨勢，乳化穩(wěn)定性有明顯提高，抗氧化性增強(qiáng)；米肽和葡萄糖質(zhì)量比對產(chǎn)物的乳化性作用明顯，質(zhì)量比為1:2時乳化性提高最顯著，達(dá)35.13%，但米肽-葡萄糖的質(zhì)量比對產(chǎn)物的抗氧化性影響不明顯。

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Functional Properties of Products of a Grafting Reaction between Rice Peptide and Glucose in Aqueous Solution

ZHAO Qiang，ZHONG Hong-lan，XIONG Hua*，SHI Su-hua，DENG Bo，LI Wei
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Rice peptides were grafted with glucose in aqueous solution under different levels of reaction temperature and time, initial pH, substrate concentration, rice peptide/glucose mass ratio in order to investigate the effects of these reaction conditions on the functional properties of the grafted products including emulsifying activity (EA), emulsion stability (ES) and reducing power. The results indicated that 1) the degree of grafting (DG), browning degree and reducing power of the graft reaction products (GRPs) increase with rising reaction temperature and prolonged reaction time. However, excessively long reaction time led to decreases in DG, EA and ES; 2) The EAs of rice peptides and GRPs were both enhanced as initial pH increased from 6 to 10, their reducing power and ES increased initially and then decreased, and GRPs showed higher levels of EA and reducing power than native rice peptides, and GRPs obtained using an initial pH of 0.798 had the highest reducing activity; 3) both the EAs of rice peptides and GRPs showed a trend to initially increase and then decrease with substrate concentration increased, and the emulsify stability and reducing power were improved remarkably; 4) The EA and ES of GRPs were obviously affected by rice peptide/glucose mass ratio, and EA was most significantly enhanced and reached up to 35.13% when the ratio was 1:2, while the ratio had no significant effect on the reducing power of GRPs.

rice peptide；grafting reaction；emulsifying activity；antioxidant activity

TS201.1

A

1002-6630(2010)19-0115-06

2010-06-30

食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室目標(biāo)導(dǎo)向資助項目(SKLF-MB-200809)；食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室自由探索資助項目(SKLF-TS-200818)；科技部科技人員入園入企項目(SQ2009GJC5005767)；2009年江西省研究生創(chuàng)新資金項目

趙強(qiáng)(1981—)，男，博士研究生，研究方向為功能性食品。E-mail：zqvzys811221@yahoo.com.cn

*通信作者：熊華(1957—)，男，教授，碩士，研究方向為功能食品與食品微膠囊技術(shù)。E-mail：huaxiong100@yahoo.com.cn