郭學軍，陳苑，巫志鋒，張永斌，鄒移海

(1.廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，廣州 510405;2.廣東省中醫(yī)院，廣州 510405)

原花青素對腦缺血再灌損傷大鼠模型的影響

郭學軍1，陳苑1，巫志鋒2，張永斌1，鄒移海1

(1.廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，廣州 510405;2.廣東省中醫(yī)院，廣州 510405)

目的 研究原花青素對腦缺血/再灌損傷(ischemia/reperfusion，I/R)大鼠神經功能評分(neurological deficit score，NDS)、腦梗死體積、腦含水量等指標的藥理作用。方法 采用大鼠大腦中動脈阻斷(middle cerebral artery occlusion，MCAO)法復制類似人類缺血性卒中的I/R損傷模型。結果 該模型各時間點內均有程度不同的神經功能缺失，原花青素給藥組神經功能評分明顯低于對照組(P＜0.05)，假手術組大鼠均無神經功能缺失，腦水腫情況均較對照組明顯改善(P＜0.05)，腦梗死體積與鹽水對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，而假手術組均未見有梗死灶。結論 原花青素具有一定的保護大鼠I/R后受損腦組織的作用，可供后續(xù)研究，并可為缺血性卒中使用原花青素治療提供確鑿的理論依據。

原花青素;腦缺血;再灌注損傷;神經生長因子

腦血管疾病(cerebrovascular disease，CVD)是危害人類健康及生命的三大疾病之一。我國CVD的患病率約為5.0%，發(fā)病率約為2.0%，且有緩慢上升的趨勢，每年新發(fā)病例超過150萬例。缺血性腦血管病(ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是其中常見的一類，約占56.6% ～80.0%，在祖國醫(yī)學中，屬于腦卒中的范疇，不僅西醫(yī)治療該疾病有相關的治療方案，而且關于ICVD的中藥及植物提取物治療也有相當長的研究歷史。臨床上治療ICVD的單味中藥大多屬于活血化淤的范疇，如川芎、丹參、當歸、三七、地龍、水蛭等。用于治療ICVD常用的復方制劑劑型除傳統的口服煎劑、丸劑、片劑、膠囊劑、口服液、沖劑、膏劑、散劑、丹劑外，涂膜劑之外，其他給藥途徑也很豐富。如采用中藥離子導入、中藥灌腸劑，尤其是中藥注射劑型，如清開靈、醒腦靜、血塞通、生脈、腦絡靈、絡泰、路路通、心腦新等注射液［1］的開發(fā)應用大大提高了中藥治療 ICVD的成功率。

因此，中藥、天然藥物在 CVD的臨床治療方面具有明顯的開發(fā)優(yōu)勢，原花青素的現代藥理研究表明，其提取物具有抗氧化劑活性、酶抑制活性、抗致突變活性、降低毛細血管通透性(抗炎活性)、心血管活性等多方面的藥理作用［2－5］，而當腦缺血缺氧發(fā)生后，一系列損傷級聯反應的產生將導致腦組織的損害［6］，故可以延伸為此方面的應用，但是原花青素或其提取物是否具有確切的腦保護效應，未見國內外報道過相關的動物基礎研究。本研究采用大鼠大腦中動脈阻斷致局灶性I/R損傷模型，此模型與人類缺血性卒中較為類似，從神經功能評分、腦梗死體積、腦含水量等方面研究原花青素對大鼠 I/R后的藥理作用，為使用原花青素治療缺血性卒中提供確鑿的理論依據，從而拓寬其應用范圍。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件

SPF 級 SD(Sprague－Dawley，SD)雄性大鼠 120只，體質量270～300 g，購于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心［SYXK(粵)2008－0020］，飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心 SPF級實驗室［SYXK(粵)2008－0001］。飼以標準顆粒飼料，自由飲水。飼養(yǎng)環(huán)境溫度為 18～22℃，室內濕度保持在 50% ～70%，每天日照時間為8:00～20:00。

1.2 材料

原花青素由深圳市安心植物科技有限公司提供，使用前與0.3%CMC－Na配成混懸液供測試用(含 量 為 5 mg/mL)。TTC(2，3，4－triphenyl－2H－tetrazolium，氯化 2，3，5－三苯基四氮唑)購自廣州化學試劑分裝部，分析純，批號:200107214。Olympus光學顯微鏡(日本)，BI－2000型圖像采集分析系統(成都泰盟)，Sartorius 320－A型電子分析天平(德國)。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模方法:120只大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，采用隨機數值表分為假手術組40只，缺血對照組40只，原花青素治療組40只。缺血對照組與假手術組給予等體積等滲生理鹽水。采用稍加改良的Zea－longa0線栓法制備大鼠MCAO模型。栓線采用單沙尼龍線長4 cm直徑0.255 mm，一頭頂端用火燒鈍，去棱角使其光滑，使頂端直徑約0.26 ～0.28 mm，并距頭端18 mm處作一標記。酒精清潔后置于1%肝素鈉中備用。大鼠術前12 h禁食不禁水，以10%水合氯醛3 mg/kg體重腹腔注射麻醉，大鼠四肢固定于手術臺上，頸部備皮，常規(guī)消毒鋪洞巾，行頸部正中切口，逐層分離并暴露右側頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸內動脈 (internal carotid artery，ICA)、頸 外 動 脈 (external carotid artery，ECA)，避免刺激迷走神經。在 CCA、ICA、ECA上各置一根3/0絲線，在距 ICA、ECA分叉5 mm處結扎CCA，在 CCA根部結扎 ECA，提拉預置絲線阻斷 ICA血流，在其距 ICA、CCA分叉上剪一“V”形切口，將尼龍線燒鈍的一端小心沿切口插入，松開提拉線，徐徐向前進18～20 mm，稍遇阻力即停止前進。結扎ICA留置絲線，防栓子脫落。然后逐層縫合皮膚，術后2 h將尼龍線從ICA中撤出，直至頭端退至CCA分叉處(感阻力)，進行1、24及72 h再灌注，假手術組僅將栓線插入10 mm使尼龍線置于ICA而未進入MCA，其余步驟同前。術中保持肛溫(37±0.5)℃，模型成功的標志是大鼠即刻出現Horner征。凡術中動物死亡、出現蛛網膜下腔出血或無梗死灶均為MCAO模型制作失敗，不納入本實驗，再隨機補充病例，保證實驗動物每組數量不變。原花青素治療組在缺血前1 h及再灌損傷前1 h分別給予原花青素(10 mL/kg)灌胃預防給藥。

1.3.2 觀察指標及檢測方法

(1)神經功能評分

于處死前參考 Zea－Longa等的 5分制評分標準［7］:0分:無明顯神經病學癥狀，活動基本正常。1分:不能完全伸展左側前爪。2分:爬行時出現向左側轉圈。3分:行走時向偏癱側(左側)傾倒。4分:不能自動行走，有意識障礙。在規(guī)定時間點由協作者盲法評分。

(2)腦梗死區(qū)含水量測定

采用 Rosenberg［8］方法，采用干濕重法，在缺血再灌注12 h后行過量麻醉，直接斷頭后取缺血側自Bregma點向前取5 mm2大小腦組織腦組織，用濾紙吸去表面液體，分別用電子天平稱其濕重(室溫15～20℃，相對濕度為70% ～90%)，然后將腦組織置于電熱烤箱(100±21)℃內48 h烘干并衡重，迅速測干重，按下式計算:

(3)腦梗死體積測定

紅四氮唑(2，3，5－triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色法染色。實驗大鼠在規(guī)定時間點作神經功能評分后，用10%水合氯醛3 mg/kg靜脈麻醉后迅速開胸，經左心室插管灌入生理鹽水50 mL，繼之灌以溫生理鹽水配制的2%TTC 80 mL，灌注時大鼠浸在37℃水中，持續(xù)30 min，而后灌注4%多聚甲醛200 mL，持續(xù)1 h左右，開顱取腦。TTC被腦組織線粒體內過氧化氫酶還原，可使正常腦組織被染成深紅色，梗死灶為白色。將固定后的腦組織由前至后每隔2 mm厚度作冠狀面切開，按 Swanson［9］間接法測定，即按順序依次由前向后，由掃描儀將圖像信息輸入計算機，用圖像采集分析系統分別測定腦梗死面積，輸入片厚參數，計算出梗死體積 (mm3)。

1.4 統計分析

2 結果

2.1 神經行為學改變

從表1可看出，術后存活大鼠I/R 1h后均有程度不同的神經功能缺失，原花青素治療組神經功能評分明顯低于對照組(P＜0.05)，假手術組大鼠均無神經功能缺失。

2.2 腦含水量變化

除假手術組外，各組在I/R后1 h腦含水量就開始增加，到I/R后24 h，鹽水對照組與原花青素用藥組的腦組織含水量均達峰值。在I/R后72 h有所回落。原花青素用藥組在I/R后各時間點腦水腫情況均較對照組明顯改善(P＜0.05)，見表1。

表1 原花青素對大鼠神經功能評分的影響(±s，n=40)Tab.1 Impact of procyanidins on the neurological deficit score in rats

表1 原花青素對大鼠神經功能評分的影響(±s，n=40)Tab.1 Impact of procyanidins on the neurological deficit score in rats

注:與對照組比較，*P＜0.05Note:compared with the control group，*P＜0.05

組別Groups神經功能評分(Neurological deficit score)1 h 24 h 72 h對照組(Control group)1.92±0.36 3.11±0.87 3.02±0.43原花青素組(Procyanidins group) 1.54±0.21*1.76±0.37*2.57±0.62*假手術組(Sham－operated group)000

表2 原花青素對大鼠腦含水量的影響(±s，n=40)Tab.2 Impact of procyanidins on brain water content in rats

表2 原花青素對大鼠腦含水量的影響(±s，n=40)Tab.2 Impact of procyanidins on brain water content in rats

注:與假手術組比較，#P＜0.05;與對照組比較，△P＜0.05Note:Compared with the sham－operated group，*P ＜ 0.05;Compared with the control group，*P＜0.05

腦含水量(%)(Brain water content)1 h 24 h 72 h對照組(Control group) 77.20±0.35# 86.5±0.63# 81.55±0.62組別Groups#原花青素組78.32±0.41手術組(Sham－operated group)75.41±0.28 77.11±0.37 77.38±0.70(Procyanidins group) # 82.17±0.82#△ 79.41±0.74#△假

2.3 腦梗死體積

原花青素治療組I/R后各時間點梗死體積與鹽水對照組相比差異有顯著性(P＜0.05)，兩組在 I/R假手術組均未見有梗死灶。見表3。

表3 原花青素對大鼠腦梗死體積的影響(±s，n=40)Tab.3 Impact of procyanidins on volume of cerebral infarction in rats

表3 原花青素對大鼠腦梗死體積的影響(±s，n=40)Tab.3 Impact of procyanidins on volume of cerebral infarction in rats

注:與對照組比較，*P＜0.05Note:compared with the control group，*P＜0.05

腦梗死體積(mm3)Volume of cerebral infarction(mm3)組別Groups1 h 24 h 72 h對照組(Control group)106.0±9.7 136.5±11.3 162.7±17.8原花青素組(Procyanidins group) 98.4±8.5 107.3±14.8*122.5±20.1*假手術組(Sham－operated group)000

3 討論

近期分子水平對缺血性卒中的研究資料表明，腦組織缺血缺氧發(fā)生后，是一系列損傷級聯反應造成腦組織的進一步損害，包括興奮毒性氨基酸釋放，Ca2+超載，炎癥反應及促凋亡的發(fā)生。目前對于缺血性卒中的腦保護治療日益重視，主要通過降低一些腦缺血后損傷因子和增加一些保護因子及減少凋亡等達到保護缺血腦組織受損的目的［10－12］。目前利用大量離體和在體的腦缺血動物模型，已發(fā)現了許多中藥、天然藥物能通過干預上述某一損傷或保護環(huán)節(jié)，不同程度的減輕腦損傷，但是仍有大量中藥的基礎研究尚未系統的進行，從而限制了臨床的應用，而作為原花青素則是在此前提下提出的。本研究主要從神經行為學和病理組織學方面研究原花青素對I/R缺血組織的保護效應。

本文采用了與人腦血循環(huán)及再灌注損傷很接近的MCAO模型，在腦缺血2 h后再灌注。發(fā)現動物死亡率低，梗死灶及神經功能較穩(wěn)定。本實驗中排除了術后無梗死灶大鼠2只，出現蛛網膜下腔出血大鼠5只。研究結果表明，原花青素能顯著促進I/R后大鼠的神經功能恢復，在 I/R后72 h更為顯著，大大改善了大鼠腦梗死后的預后。同時原花青素治療組還能顯著縮小I/R后腦梗死體積及顯著降低腦水腫的反應，在I/R后24 h，原花青素減輕腦水腫反應的效果更顯著。從而最直觀的從大體組織水平上顯示了原花青素對腦組織的保護作用，為受試動物的神經行為學改變提供了病理學依據。在I/R后1 h，我們發(fā)現無論是神經行為，還是腦含水量及腦梗死體積，原花青素治療組與對照組之間均有顯著性差異，這可能因為在腦梗死的超早期，神經細胞、細胞間隙內的腦組織基質受損都較輕，發(fā)生壞死及凋亡等變化的神經元及膠質細胞較少，炎癥反應較輕，其神經元的形態(tài)變化處于代償狀態(tài)，缺血區(qū)改變尚處于未完全受損的狀態(tài)，損傷的級聯反應尚在啟動中，原花青素在缺血即刻及再灌注即刻給予干預，能夠減弱損傷級聯反應及再灌注損傷，提示原花青素可通過在腦梗死超早期給藥從而起干預治療的藥理作用。

［1］ 葛勤，田華，劉同華.中藥治療缺血性腦血管疾?。跩］.醫(yī)藥導報，2004，23(2):111－112.

［2］ 由倍安，高海青.葡萄籽原花青素藥理研究進展［J］.國外醫(yī)學·老年醫(yī)學分冊，2003，24(3):123－127.

［3］ 馬亞兵，高海青.葡萄籽原花青素抗動脈粥樣硬化研究進展［J］.山東醫(yī)藥，2002，42:82－83.

［4］ 馬亞兵，高海青，由倍安，等.葡萄籽原花青素抗LDL氧化修飾作用的研究［J］.中華醫(yī)藥雜志，2003，3(11):961－963.

［5］ 馬亞兵，高海青，由倍安，等.葡萄籽原花青素對動脈粥樣硬化兔血脂的調節(jié)作用［J］.中國藥理學通報，2004，20(3):325－359.

［6］ Bhardwaj A，Alkayed NJ，Kirsch JR，et al.Mechanisms of ischemic brain damage［J］.Curr Cardiol Rep，2003，5(2):160－167.

［7］ Zea－Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S， etal. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20(2):84－91

［8］ Rosenberg GA， Scremin O， Estrada E， etal. Arginine vasopressin V1－antagonist and atrial natriuretic peptide reduce hemorrhagic brain edema in rats［J］.Stroke，1992，23(12):1767－1773.

［9］ Swanson RA，Morton MT，Tsao WG ，et al，A semiautomated method for measureing brain infarct volume［J］.Cereb Blood Flow Metab，1990，10:290－293.

［10］ 董為偉.神經保護的基礎與臨床［M］.北京:科學出版社，2002，239－245.

［11］ Ovbiagele B，Kidwell CS，Starkman S，et al.Neuroprotective agents for the treatment of acute ischemic stroke［J］.Curr Neurol Neurosci Rep，2003，3(1):19－20.

［12］ Nils Gunnar，Wahigren，Patrick Lyden.Neuroprotectant in the treatment of stroke — An overview［J］.J Stroke Cerebrovasc Dis，2000，9:23－35.

Effects of Procyanidins on Ischemia/Reperfusion Brain Damage in Rats

GUO Xue－jun1，CHE Yuan1，WU Zhi－feng2，ZHANG Yong－bin1，ZOU Yi－h(huán)ai1
(1.Laboratory Animal Center，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China;2.Guangdong Provincial Hospital，Guangzhou 510405)

ObjectiveTo study the effects of procyanidins on neurological deficit score，cerebral infarction volume，and cerebral water content after ischemia/reperfusion(I/R)in rats.MethodsThe middle cerebral artery occlusion(MCAO)－induced focal I/R brain damage model of rats similar to human ischemic stroke was used.ResultsThe results showed that procyanidins lowered the neurological deficit score，cerebral infarction volume and cerebral water content significantly at intervals of 1 h，24 h and 72 h after I/R(P ＜ 0.05)，vs.control，while the sham－operated rats showed no infarction area.ConclusionsOur findings suggest that procyanidins show certain protective effect against I/R damage in the rat brain.Further studies of this effects are warranted to provide sufficient materials supporting the application of procyanidins in the treatment of ischemic stroke.

Procyanidins;Cerebral ischemia;Reperfusion injury;Nerve growth factor;Rat

R743.31，R332

A

1005－4847(2010)05－0425－04

10.3969/j.issn.1005－4847.2010.05.015

2010－03－29

郭學軍(1976－)，男，助理研究員，主要從事實驗動物學和藥用動物學的研究。E－mail:dwzxgxj@gzhtcm.edu.cn