孫 筱 筠， 張 宗 申

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

東北紅豆杉又名紫杉，是國(guó)家Ⅰ級(jí)重點(diǎn)保護(hù)植物。近年來(lái)，人們從東北紅豆杉根、莖、葉中分離出抗癌活性成分——紫杉醇[1-2]。研究表明：紫杉醇能與微管蛋白結(jié)合，并促進(jìn)其聚合，抑制癌細(xì)胞的有絲分裂，阻止癌細(xì)胞的增殖，具有明顯的抗白血病、肺癌、卵巢癌、乳腺癌的作用[3]。據(jù)分析，我國(guó)4個(gè)紅豆杉品種中以東北紅豆杉枝葉中所含的紫杉醇最高[4]。紅豆杉屬植物在自然條件下種子萌發(fā)率低，再加上屬于雌雄異株，自然結(jié)種率低，種質(zhì)資源少，種子休眠期長(zhǎng)等原因繁殖速度慢[5]，因此通過(guò)自然種子繁殖紅豆杉受到很大限制。與通過(guò)自然種子的繁殖方式相比，人工種子具有繁殖速度快、節(jié)省資金、人力和土地等優(yōu)點(diǎn)，因此對(duì)于紅豆杉屬物種的保護(hù)和藥用價(jià)值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

愈傷組織：取大連工業(yè)大學(xué)校園內(nèi)種植的東北矮紫杉嫩莖，在mB5[6]培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，每25天繼代1次，(24±1)℃下黑暗培養(yǎng)，挑選乳白色、質(zhì)地松散、表面呈顆粒狀的愈傷組織作為繁殖體。

腋芽在大連地區(qū)4月份的矮紫杉枝條上采取。

1.2 方 法

1.2.1 用愈傷組織制作人工種子

包埋劑濃度的選擇:將愈傷組織切成直徑2～3 mm的小塊，放入不同濃度的海藻酸鈉溶液中(見(jiàn)表1，用mB5培養(yǎng)基配制)充分混合，浸泡3～4 min，然后用膠頭滴管每次吸取1個(gè)繁殖體滴入2.5% CaCl2溶液中。形成的人工種子用無(wú)菌水沖洗3～4次，置于無(wú)菌紙上吸去人工種子表面水分。將制作好的人工種子置于鋪有無(wú)菌水浸潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)溫度(24±1)℃，每天光照12 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。觀察人工種子形態(tài)并每5 d測(cè)量1次失水率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

人工胚乳成分的配制：在mB5培養(yǎng)基配制的3.0%海藻酸鈉溶液中，分別添加不同濃度的可溶性淀粉、草酸、水楊酸、低分子殼聚糖和高分子殼聚糖，然后用愈傷組織制備人工種子(CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%)。觀察人工種子形態(tài)并每5 d測(cè)量1次失水率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 用腋芽制作人工種子

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的優(yōu)化：將剝?nèi)〉囊秆坑?5%酒精處理30 s，再于0.1%升汞溶液中處理5 min，然后用無(wú)菌水沖洗3～5次。在包埋基質(zhì)中添加不同種類及濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑(包埋基質(zhì)為3.0%海藻酸鈉溶液，包含mB5培養(yǎng)基、3.0%蔗糖、1.5%可溶性淀粉、10-6mg/L水楊酸)，絡(luò)合電解質(zhì)為2.5% CaCl2。將制好的人工種子置于含有相應(yīng)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的mB5固體培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)，培養(yǎng)溫度(24±1)℃，每天光照12 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，30 d后統(tǒng)計(jì)人工種子萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 包埋劑濃度對(duì)用愈傷組織制備的東北矮紫杉人工種子包埋效果及保水性的影響

不同濃度的海藻酸鈉對(duì)人工種子形成的質(zhì)量、形成時(shí)間和保水性都有影響。隨著海藻酸鈉濃度的升高，人工種子形成的時(shí)間縮短，保水性也越來(lái)越好。由表1和表2可以看出，海藻酸鈉濃度過(guò)低，形成的人工種子的時(shí)間較長(zhǎng)，顆粒不均，種子較軟容易粘連；濃度過(guò)高，雖然形成的人工種子顆粒均一，但硬度大、不透明，會(huì)阻礙種子的萌發(fā)。只有3.0%海藻酸鈉包埋制成的人工種子大小均勻，硬度適中，透明而富有彈性，所以3.0%海藻酸鈉在2.5% CaCl2中反應(yīng)8～10 min是制備人工種子的最佳條件(見(jiàn)圖1a)。

表1 不同濃度包埋劑對(duì)人工種子質(zhì)量、形成時(shí)間的影響Tab.1 The effects of different concentration on encapsulation formulation of artificial seeds

表2 不同濃度包埋劑包埋人工種子的失水情況(24 ℃)Tab.2 The effects of embedding agent concentration on the water loss of artificial seeds (24 ℃)

a, 3.0%海藻酸鈉+2.5%CaCl2制成的人工種子; b, 萌發(fā)前的人工種子; c, 萌發(fā)后的人工種子

2.2 添加可溶性淀粉、誘導(dǎo)子對(duì)用愈傷組織制備的人工種子包埋效果及保水性的影響

在包埋基質(zhì)中添加可溶性淀粉、草酸、水楊酸和殼聚糖對(duì)人工種子保水性均有較大影響。如表3所示，添加可溶性淀粉可以提高種子的保水性，其中添加1.5%可溶性淀粉的失水率最低，儲(chǔ)藏15 d后失水率為25.29%。這可能與可溶性淀粉的多孔結(jié)構(gòu)能夠增加對(duì)水分的吸附作用、從而導(dǎo)致水分散失緩慢有關(guān)；但是可溶性淀粉含量越高，制備出來(lái)的種子黏性也越大，種子之間更容易粘連，并且黏度越大，種子的透氣性相對(duì)也越差，這些因素對(duì)種子的萌發(fā)會(huì)有一定的抑制作用。添加草酸和水楊酸對(duì)人工種子保水性差別不大，均在24%～35%，且硬度適中對(duì)種子形成時(shí)間及形態(tài)影響較小。其中，以添加10-6mg/L水楊酸的種子顆粒最均一，色澤最好。在包埋基質(zhì)中添加的殼聚糖濃度越高，種子形成的時(shí)間越短，保水性也越好。但是添加殼聚糖形成的種子雖然顆粒均一，但顏色暗黃，硬度過(guò)大，可能影響種子萌發(fā)。

在制備人工種子的過(guò)程中，在胚乳中添加可溶性淀粉和誘導(dǎo)子可以改善人工種子的保水性，從而提高了人工種子的保存時(shí)間。但從上述結(jié)果分析，在添加可溶性淀粉和誘導(dǎo)子的時(shí)候，要綜合考慮其對(duì)種子質(zhì)量的影響，選擇適宜的添加濃度是關(guān)鍵。

表3 可溶性淀粉、草酸、水楊酸、殼聚糖對(duì)東北矮紫杉人工種子的保水效果(24 ℃)Tab.3 The effects of soluble starch, oxalate acid, salicylic acid and chitosan on the water retenation of artificial seeds (24 ℃)

2.3 添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)用腋芽制備的矮紫杉人工種子萌發(fā)的影響

在胚乳中單獨(dú)添加NAA對(duì)矮紫杉人工種子的萌發(fā)有較大的促進(jìn)作用。由表4可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著NAA濃度增加，種子萌發(fā)率上升，以1.5 mg/L NAA的促進(jìn)效果最好，培養(yǎng)30 d 后萌發(fā)率達(dá)到了38.1%；然而，隨著6-BA濃度的增加，人工種子的萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)。

表4 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)矮紫杉人工種子萌發(fā)率的影響Tab.4 The effects of plant growth regulator on the germination rate of artifical seeds of Taxus cuspidata CV.Nana

由表4可以看出，與單獨(dú)添加NAA和6-BA相比，同時(shí)添加NAA和6-BA對(duì)東北矮紫杉人工種子的萌發(fā)有一定的抑制作用，而不添加任何激素的人工種子也能萌發(fā)，這可能是因?yàn)闁|北矮紫杉的腋芽本身帶有的激素濃度可以保證其萌發(fā)的需要，但萌發(fā)率并不高。

3 討 論

海藻酸鈉凝膠包埋系統(tǒng)具有無(wú)毒且價(jià)格低廉、工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因此本試驗(yàn)采用海藻酸鈉作為東北矮紫杉人工種子的包埋系統(tǒng)。試驗(yàn)得出東北矮紫杉人工種子的最佳制作條件為3%海藻酸鈉在2.5% CaCl2中反應(yīng)8～10 min。然而從試驗(yàn)中可以看出海藻酸鈉包埋系統(tǒng)保水性較差，至使水溶性養(yǎng)分很快浸出，另外制成的人工種子只能短期儲(chǔ)存，在萌發(fā)出芽時(shí)常常受阻。故今后的研究應(yīng)尋找更適合于人工種子實(shí)際應(yīng)用的固形包埋基質(zhì)。

黃紹興等[7]將木薯淀粉加入到海藻酸鈉凝膠系統(tǒng)中制成復(fù)合包埋基質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改善了由單一海藻酸鈉凝膠系統(tǒng)制作的人工種子胚乳的吸水性，從而提高了人工種子的發(fā)芽率。本試驗(yàn)在人工胚乳中添加可溶性淀粉對(duì)人工種子的保水性和質(zhì)量起到了促進(jìn)的作用，但濃度是關(guān)鍵因子，太高會(huì)影響種子的物理性質(zhì)，如黏度等，對(duì)人工種子的萌發(fā)會(huì)有一定的影響。

李烜赫等[8]在誘導(dǎo)子對(duì)紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞紫杉醇產(chǎn)量的影響研究中發(fā)現(xiàn)，生物或非生物誘導(dǎo)子可誘導(dǎo)紅豆杉細(xì)胞產(chǎn)生抗逆反應(yīng)，啟動(dòng)次生代謝途徑，從而導(dǎo)到紫杉醇的大量合成。草酸和水楊酸作為誘導(dǎo)子添加到人工種子中對(duì)人工種子質(zhì)量影響效果不大，但提高了種子的保水性和形態(tài)，其中以10-6mg/L水楊酸的效果最好，人工種子顆粒最均一，成色最好，且濃度低，可節(jié)約制作成本。

高分子殼聚糖和低分子殼聚糖對(duì)人工種子的保水性和成形時(shí)間及顏色都有顯著的影響。含量越高保水性越好，同時(shí)成形時(shí)間越短，但種子硬度很大，顏色很深，對(duì)人工種子的萌發(fā)會(huì)有一定的抑制作用。因此，今后對(duì)人工胚乳添加成分上還要作進(jìn)一步的研究，以便對(duì)人工種子進(jìn)行更好的儲(chǔ)藏。

在人工胚乳中加入NAA有利于人工種子的萌發(fā)，以1.5 mg/L NAA對(duì)人工種子萌發(fā)促進(jìn)效果最為顯著，萌發(fā)率達(dá)到了38.1%，而6-BA則有一定的抑制作用。雖然本實(shí)驗(yàn)中人工種子能夠萌發(fā)，但萌發(fā)率并不高。因此，今后需要對(duì)提高東北矮紫杉人工種子萌發(fā)率的技術(shù)繼續(xù)研究。

[1] 李伯林,趙群華. 紅豆杉植物愈傷組織的培養(yǎng)及紫杉醇形成初探[J]. 南京大學(xué)學(xué)報(bào), 1995, 31(3):55-58.

[2] 吳曉慶. 抗腫瘤新藥紫杉醇研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 1996, 17(3):13l-l35.

[3] 陳慶紅,陳慶瑛,黃利亞,等. 東北紅豆杉開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)野生植物資源, 2005, 24(1):41-42.

[4] 車熙哲,趙傳彥,趙海濤. 東北紅豆杉的發(fā)展前景與效益分析[J]. 特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物, 2004(5):26-27.

[5] 陳慶紅,陳慶瑛,黃利亞,等. 東北紅豆杉開(kāi)發(fā)研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)野生植物資源, 2005, 24(1):41-42.

[6] LEE B S, SON S H. A method for the producing taxol and taxanes from embryo cultures of Taxus species:Europe, WO 9502063[P]. 1995-07-12[2009-10-09]. http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?IA=KR1994000088&DISPLAY=DESC.

[7] 黃紹興,黃美娟,朱澂. 木薯淀粉對(duì)人工胚乳性能及對(duì)人工種子發(fā)芽率的影響[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 1995, 11(1):39-44.

[8] 李烜赫,楊坤. 誘導(dǎo)子對(duì)紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞紫杉醇產(chǎn)量的影響[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2006, 41(6):55-57.