張麗影，于國萍,*，于純淼

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

丹參紅色素的亞臨界水萃取工藝

張麗影1，于國萍1,*，于純淼2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

利用亞臨界水萃取丹參藥材中的丹參紅色素。以丹參酮Ⅱ-A的提取率作為丹參紅色素提取率的考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)研究在丹參紅色素的亞臨界水萃取過程中萃取溫度、萃取時(shí)間、物料粒徑、液固比、提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)因素對(duì)丹參紅色素提取率的影響。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇萃取溫度、萃取時(shí)間、物料粒徑、液固比4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定丹參紅色素的最佳亞臨界水萃取工藝。結(jié)果表明：4個(gè)因素對(duì)丹參紅色素提取率影響的主次順序?yàn)闇囟?物料粒徑>料液比>時(shí)間；最優(yōu)組合為A3B1C1D3，即萃取溫度200℃、物料粒徑40～60目、液固比25:1(mL/g)、萃取時(shí)間10min。在此最優(yōu)組合基礎(chǔ)之上，選擇體積分?jǐn)?shù)15%乙醇溶液作為萃取溶進(jìn)行萃取，此時(shí)所得色素提取率最高為0.319%。

丹參；亞臨界水；丹參酮Ⅱ-A；丹參紅色素；提取率

Abstract：Red pigment was extracted fromSalvia miltiorrhizausing subcritical water. The major factors including extraction temperature, extraction time, particle size, liquid-material ratio and ethanol concentration played an important role in subcritical water extraction processing. The effects of above factors on extraction rate of red pigment were investigated. Moreover, the optimal extraction conditions of red pigment were explored by orthogonal experiments to be extraction temperature of 200 ℃,particle size of 40－60 meshes, liquid-material ratio of 25:1, extraction time of 10 min and ethanol concentration of 15%. The extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhizawas 0.319% under the optimal extraction conditions.

Key words：Salvia miltiorrhiza；subcritical water；tanshinone II-A；red pigment；extraction rate

丹參系唇形科鼠尾草屬植物(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖，具有活血通經(jīng)、除煩清心[1-2]、改善冠脈循環(huán)、消炎抗菌等藥理作用，并且對(duì)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和血行擴(kuò)散有明顯促進(jìn)作用。丹參藥用有效成分分為脂溶性和水溶性兩大部分[3-4]。目前從丹參中分離得到的脂溶性成分和水溶性成分據(jù)報(bào)道有34種之多[5]。脂溶性成分為二帖醌類化合物，為色素成分，稱為丹參紅色素，也稱為總丹參酮。該色素是一種天然食用色素，安全性高，具有一定的藥理作用，有利于人體健康。

常用的丹參紅色素提取方法有水煎煮法、有機(jī)溶劑浸提法、超臨界CO2提取法等。這些方法或是提取時(shí)間長、有機(jī)溶劑使用量大，或是對(duì)有效成分的選擇能力較差。亞臨界水(subcritical water，SBW)是指壓力和(或)溫度在其臨界值(T=374℃，P=21.8MPa)之下的附近區(qū)域的液態(tài)水[6-7]。亞臨界水萃取技術(shù)(subcritical water extraction，SWBE)是指以水為提取劑，通過改變萃取溫度，改變水的極性，從而可以選擇性的萃取樣品中的無機(jī)或有機(jī)、極性或非極性的有機(jī)化合物[8]。SWBE是一種近十幾年發(fā)展起來的較新的不使用或少使用有機(jī)溶劑的綠色萃取技術(shù)[9]，具有設(shè)備簡單、易于操作、快速、得率高等優(yōu)點(diǎn)，其在中藥的生產(chǎn)、應(yīng)用和分析領(lǐng)域有著很好的發(fā)展前景。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行丹參紅色素的亞臨界水萃取技術(shù)的研究，為中藥有效成分的提取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丹參根莖 寶豐醫(yī)藥有限公司；丹參酮Ⅱ-A標(biāo)準(zhǔn)品 中國藥品生物檢定所；蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

FW-100型萬能粉碎機(jī) 天津泰斯特儀器有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海博通儀器設(shè)備有限公司；SHZ-3循環(huán)水多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KCFD05-03型亞臨界反應(yīng)釜 煙臺(tái)高新區(qū)科立自控設(shè)備研究所；AL-104型精密電子天平 上海梅特勒-托利多儀器設(shè)備有限公司；FDU-1100型冷凍干燥機(jī) 東京RIKAKIKAI公司；KQ-500B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；UVmini-1240紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

使用萬能粉碎機(jī)將干燥的丹參根莖粉碎、過篩，得到不同物料粒徑的丹參粉末，備用。

1.3.2 亞臨界水萃取丹參紅色素的影響因素

考察萃取溫度、萃取時(shí)間、物料粒徑、料液比和提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)5個(gè)因素[10-11]對(duì)丹參紅色素提取率的影響。稱取一定物料粒徑的丹參粉末適量，用不同液固比的亞臨界水在一定溫度下萃取一定時(shí)間進(jìn)行單因素試驗(yàn)。確定單因素水平后，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇萃取溫度、萃取時(shí)間、物料粒徑、料液比進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定丹參紅色素的最佳亞臨界水萃取工藝條件。其中萃取溫度為120、140、160、180、200℃；萃取時(shí)間為5、10、15、20、25min；物料粒徑為≤40、40～60、60～80、80～100、≥100目；液固比為10:1、15:1、20:1、25:1(mL/g)；乙醇體積分?jǐn)?shù)為0、5%、10%、15%、20%。

1.3.3 丹參紅色素提取率的測定方法

丹參紅色素也稱總丹參酮，以其中的主要成分丹參酮Ⅱ-A作為丹參紅色素的考察指標(biāo)，進(jìn)行色素提取率的計(jì)算。對(duì)亞臨界水萃取液冷卻抽濾，乙酸乙酯萃取分離，萃取后的脂相使用紫外-可見分光光度計(jì)在丹參酮Ⅱ-A最大吸收波長處測定OD值，計(jì)算色素提取率[12]。

1.3.4 丹參酮Ⅱ-A提取量的測定方法

精密稱取干燥至恒質(zhì)量的丹參酮Ⅱ-A標(biāo)準(zhǔn)品2mg，置于10mL容量瓶中，加入適量乙酸乙酯溶液并定容至刻度，準(zhǔn)確吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別置于10mL容量瓶中，加乙酸乙酯至刻度，得質(zhì)量濃度為10、20、30、40、50μg/mL的溶液，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參酮Ⅱ-A標(biāo)準(zhǔn)曲線

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行掃描得丹參酮Ⅱ-A的最大吸收波長為449.5nm。在449.5nm條件下測定OD值，以O(shè)D值與丹參酮Ⅱ-A溶液質(zhì)量濃度進(jìn)行線形回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.0108X－0.0104，r2=0.9998，式中：Y為OD值，X為丹參酮Ⅱ-A質(zhì)量濃度/(μg/mL)，線性關(guān)系良好。線性范圍為10～50μg/mL。依據(jù)此曲線得出樣品中丹參酮Ⅱ-A的質(zhì)量濃度，并計(jì)算提取率。

2.2 亞臨界水萃取丹參紅色素的研究

2.2.1 溫度對(duì)丹參紅色素提取率的影響

圖1 溫度對(duì)丹參紅色素提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如圖1所示，丹參紅色素的提取率隨著萃取溫度的升高而增加，由120℃時(shí)的0.035%增加到180℃時(shí)的0.166%，提取率相對(duì)增加了4倍，且當(dāng)溫度超過140℃時(shí)有顯著影響(P＜0.05)。這主要是因?yàn)檩腿囟仁怯绊憗喤R界水萃取技術(shù)的最主要因素，對(duì)萃取的速度、效率、選擇性都有很大的影響[13]。改變亞臨界水的萃取溫度，水的極性也隨之發(fā)生了改變，進(jìn)而選擇性的萃取被提物中的極性或非極性的目標(biāo)成分。升高溫度可以打破分子間的偶極引力、破壞被提物的中心結(jié)構(gòu)，進(jìn)而破壞被提物與目標(biāo)成分間的相互作用力；同時(shí)升高溫度還可以降低流體黏度，使流體更易滲入被提物中，提高提取率。當(dāng)溫度超過180℃后，藥材嚴(yán)重碳化，有明顯的焦糊味，萃取液顏色由棕紅色變?yōu)楹诤稚?/p>

素提取率雖有所增加，但增加趨勢不明顯。這可能是因?yàn)楫?dāng)溫度超過180℃以后，反應(yīng)釜內(nèi)壓強(qiáng)有所增加，提取率升高。但由于壓力對(duì)亞臨界水萃取效率影響不大，只要適當(dāng)?shù)膲毫κ顾３忠簯B(tài)即可實(shí)現(xiàn)亞臨界水萃取[14-15]。本實(shí)驗(yàn)的壓力可達(dá)2MPa，故不考慮壓力作為萃取因素對(duì)提取率的影響。提取率增加不明顯也可能是因?yàn)槭艿⑼€(wěn)定性的限制，溫度過高易分解[16]。因此選擇萃取溫度180℃。

2.2.2 萃取時(shí)間對(duì)丹參紅色素提取率的影響

圖2 萃取時(shí)間對(duì)丹參紅色素提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如圖2所示，時(shí)間對(duì)色素提取率影響顯著(P＜0.05)。隨著萃取時(shí)間由5min增加到的15min時(shí)，提取率由0.090%增加到0.168%，提取率大約相對(duì)增加了88%；而當(dāng)萃取時(shí)間由15min增加到25min時(shí)，提取率呈現(xiàn)了減小的趨勢。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是萃取時(shí)間在亞臨界水萃取中影響也較大。萃取時(shí)間的選擇在很大程度上取決于萃取溫度以及目標(biāo)成分與被提物基質(zhì)間的天然性質(zhì)。亞臨界水的萃取時(shí)間隨溫度的升高而減少，在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)即可萃取完全。當(dāng)提取時(shí)間過長時(shí)，目標(biāo)成分受熱穩(wěn)定性的限制，在亞臨界狀態(tài)下易分解，提取率下降。同時(shí)這種現(xiàn)象可能是與組分之間存在“溶解互助”效應(yīng)[17]有關(guān)：藥材成分復(fù)雜，其中性質(zhì)相近的組分之間可互為提取劑。提取時(shí)間過長，由于其中某些組分的分解而失去相互提攜的優(yōu)勢。用盡量短的時(shí)間，更有利于整個(gè)萃取效率的提高。因此丹參紅色素的萃取時(shí)間選擇為15min。

2.2.3 物料粒徑對(duì)丹參紅色素提取率的影響

如圖3所示，物料粒徑對(duì)丹參紅色素提取率有顯著影響(P＜0.05)。當(dāng)物料粒徑不超過60～80目時(shí)，隨著物料粒徑的減小，丹參紅色素的提取率呈現(xiàn)增大的趨勢，由起初的0.104%增加到了0.161%提取率大約相對(duì)增加了60%。這主要是由于在液固萃取過程中，丹參粒徑的減小，使其表面積增加，液固界面面積增加，有利于溶劑滲透到被提物中，使得目標(biāo)成分被有效萃取，顯著提高了色素提取率[18]。但當(dāng)物料粒徑超過60～80目時(shí)，提取率呈現(xiàn)了減小的趨勢。樣品顆粒過細(xì)，在較高的溫度下焦糊現(xiàn)象明顯，甚至出現(xiàn)了結(jié)塊現(xiàn)象，不利于目標(biāo)成分的提取，而且在實(shí)驗(yàn)中不易操作處理。故物料粒徑選擇為60～80目。

圖3 物料粒徑對(duì)丹參紅色素提取率的影響Fig.3 Effect of particle size on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

2.2.4 液固比對(duì)丹參紅色素提取率的影響

圖4 液固比對(duì)丹參紅色素提取率的影響Fig.4 Effect of liquid-material ratio on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如圖4所示，當(dāng)液固比由10:1(mL/g)增加到20:1(mL/g)時(shí)，丹參紅色素提取率由0.107%增加到了0.168%，提取率相對(duì)增加了55.45%，液固比對(duì)色素提取率影響顯著(P＜0.05)；當(dāng)液固比高于20:1(mL/g)時(shí)，色素提取率雖有所增加，但增加趨勢不明顯，影響不顯著。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是亞臨界水萃取是在一定的溫度和壓力下進(jìn)行的，萃取罐中水溶液體積的大小不僅會(huì)影響到罐中萃取壓力的大小，也同時(shí)會(huì)影響樣品在萃取液中的分散程度。隨著液固比增加，更多的萃取溶劑滲透到物料中，目標(biāo)成分與溶劑接觸面積增大，使得目標(biāo)成分更有效地被萃取，進(jìn)而提高對(duì)目標(biāo)成分的提取率。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)是在固定質(zhì)量的條件下，通過改變液體體積改變液固比。隨著液體體積增加，反應(yīng)釜內(nèi)壓力增加，提取率也隨之增加。但當(dāng)液固比超過20:1(mL/g)后，提取率增加趨勢不明顯。因此根據(jù)試驗(yàn)條件選擇液固比為20:1(mL/g)，即選擇溶劑-蒸餾水的體積與物料丹參粉末的質(zhì)量的比為20:1(mL/g)進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.5 提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)[10,19]對(duì)丹參紅色素提取率的影響

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)丹參紅色素提取率的影響Fig.5 Effect of ethanol concentration on extraction rate of red pigment fromSalvia miltiorrhiza

如圖5所示，當(dāng)向萃取溶劑中加入0～20%乙醇時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)丹參紅色素的提取率影響顯著(P＜0.05)。未加乙醇時(shí)，丹參紅色素的提取率為0.193%；隨著萃取溶劑中乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到20%時(shí)，色素提取率增加到了0.334%，與未添加乙醇相比，提取率約增加了74%。這主要是因?yàn)楫?dāng)向水中加入提取劑以后，大大加強(qiáng)了被分離組分在亞臨界水中的溶解度，使該溶質(zhì)的分離因子大大提高，增加溶質(zhì)溶解度對(duì)溫度的敏感程度。因此加入提取劑的亞臨界水對(duì)植物原料中天然存在的目標(biāo)成分的溶解能力增加，目標(biāo)成分的提取率明顯增加。與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑浸提相比，有機(jī)溶劑的消耗大大降低了。

2.2.6 丹參紅色素提取條件的優(yōu)化

表1 L9(34)試驗(yàn)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Design and results of orthogonal experiments

在以上單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，不添加乙醇，以萃取溫度、萃取時(shí)間、物料粒徑、液固比為因素，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，以確定最佳的亞臨界水萃取工藝。試驗(yàn)方案及結(jié)果見表1。

正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)丹參紅色素的提取率影響的主次順序?yàn)闇囟龋疚锪狭剑疽汗瘫龋緯r(shí)間。提取丹參紅色素的最佳工藝組合為A3B1C1D3，即溫度200℃、時(shí)間10min、物料粒徑40～60目、液固比25:1(mL/g)。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在此最佳條件下丹參紅色素的提取率為0.244%。

在上述正交試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，稱取物料粒徑為40～60目的丹參粉末適量，按照25:1(mL/g)的液固比向萃取溶劑中加入15%的乙醇，在200℃條件下萃取10min。此條件下所得粗提色素提取率為0.319%，相對(duì)純水作為萃取溶劑，其提取率約增加了31%。

3 結(jié) 論

丹參紅色素的最優(yōu)亞臨界水萃取條件為萃取溫度200℃、液固比25:1(mL/g)、物料粒徑40～60目、提取劑乙醇體積分?jǐn)?shù)15%、萃取時(shí)間10min，此條件下所得丹參紅色素提取率為0.319%。但是相對(duì)于丹參中丹參酮的含量，該色素提取率偏低，這可能是因?yàn)榈⒓t色素是由多種丹參酮組成的，僅以丹參酮Ⅱ-A提取量作為色素提取率的考察指標(biāo)過于單一，應(yīng)考慮多種丹參酮提取量。同時(shí)影響亞臨界水萃取的因素主要包括萃取溫度、壓強(qiáng)、時(shí)間、料液比、物料粒徑以及提取劑種類和濃度等。本實(shí)驗(yàn)僅是在萃取溫度、萃取時(shí)間、物料粒徑、固液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)5個(gè)因素條件下進(jìn)行研究，其他影響亞臨界水萃取技術(shù)的因素以及所提色素的穩(wěn)定性和藥用價(jià)值還有待進(jìn)一步研究。

[1] 郭濟(jì)賢. 丹參的研究與臨床應(yīng)用[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社,1992.

[2] 徐任生. 丹參:生物學(xué)及其應(yīng)用[M]. 北京:科學(xué)出版社, 1990.

[3] 張安鏞. 丹參的化學(xué)成分及制劑研究[J]. 中草藥通訊, 1978(7):33-36.

[4] 謝鳴. 中藥現(xiàn)代化研究及應(yīng)用(第二卷)[M]. 北京:學(xué)苑出版社, 1997:1093.

[5] LIU Aihua, LIN Yanhua, YANG Min, et al. Development of the fingerprints for the quality of the roots ofSalvia miltiorrhizaand its related preparations by HPLC-DAD and LC-MSn[J]. J Chromatogr B, 2007,846(1/2):32-41.

[6] HAWTHORNE S B, TREMBLEY S, MONIOT C L. Static subcritical water extraction with simultaneous solid-phase extraction for determining polycyclic aromatic hydrocarbons on environmental solids[J]. J Chromatogr A, 2000, 886:237-244.

[7] HARTONEN K, INKALA K, KANGAS M, et al. Extraction of polychlorinated biphenyls with water under subcritical conditions[J]. J Chromatogr A, 1997, 785:219-226.

[8] HAWTHORNE S B, GRABANSKI C B, HAGEMAN K J , et al.Simple method for estimating polychlorinated bi-pheny concentrations on soils and sediments using subcritical water on coupled with solidphase microextraction[J]. J Chromatogr A, 1998, 814(1):151-160.

[9] PHELPS C L, SMART N G, WAI C M. Past, present, and possible future applications of supercritical fluid extraction technology[J]. J Chem Educ, 1996, 73(12):1163-1168.

[10] ONG E S, CHEONG J S H, GOH D. Pressurized hot water extraction of bioactive or marker compounds in botanical sand medicinal plant materials[J]. J Chromatography A, 2006, 1112(1/2):92-102.

[11] 徐志宏, 錢廣生, 李章萬. 丹參中脂溶性成分的亞臨界水提取方法研究[J]. 分析化學(xué), 2003, 31(11):1307-1310.

[12] 王海棠, 王忠東, 陳海濤, 等. 丹參紅色素的研究(Ⅰ):化學(xué)成分及提取工藝[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(5):86-91.

[13] KRONHOLM J, HARTONEN K, RIEKKOLA M L. Analytical extractions with water at elevated temperatures and pressures[J]. Trends in Analytical Chemistry, 2007, 26(5):396-412.

[14] YANG Yu, BOWADT S, HAWTHORNE S B, et al. Subcritical water extraction of polychlorinated biphenyls from soil and sediment[J]. Anal Chem, 1995, 67(24):4571-4576.

[15] MILLER D J, HAWTHORNE S B. Solubility of liquid organics of environmental interest in subcritical (hot/liquid)water from 298K to 473K[J]. J Chem Eng Data, 2000, 45:78-81.

[16] ONG E S, LEN S M. Evaluation of pressurized liquid extraction and pressurized hot water extraction for tanshinone I and IIA inSalvia miltiorrhizausing LC and LC-ESI-MS[J]. J Chromatographic Science,2004, 42(4):211-216.

[17] 徐志宏. 亞臨界水提取技術(shù)及亞臨界水色譜技術(shù)在中藥提取及分析中的應(yīng)用[D]. 成都:四川大學(xué), 2004:59-61.

[18] GUO Juan, XING Xiaoyang, KONG Linghui, et al. Extraction of essential oil from driedZanthoxylum bungeanumMaxim by subcritical water[J]. J Chemistry Bioengineering, 2009, 26(2):18-21.

[19] CURREN M S, KING J W. Ethanol-modified subcritical water extraction combined with solid-phase microextraction for determining atrazine in beefkidney[J]. J Agricultural Food Chemistry, 2001, 49:2175-2180.

Optimal Extraction Processing of Red Pigment inSalvia miltiorrhizaby Subcritical Water

ZHANG Li-ying1，YU Guo-ping1,*，YU Chun-miao2
(1. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；2. College of Pharmacy, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China)

TS202.3

A

1002-6630(2010)22-0110-05

2010-06-28

黑龍江省中醫(yī)藥、中西醫(yī)結(jié)合重點(diǎn)科研項(xiàng)目(ZHY08-Z03)

張麗影(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品精深加工。E-mail：xiaoyingzi_2004@163.com

*通信作者：于國萍(1963—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：yuguopingneau@hotmail.com