黃秋葵多糖的提取、分離及其體外結合膽酸鹽能力的分析

任丹丹，陳 谷*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

黃秋葵多糖的提取、分離及其體外結合膽酸鹽能力的分析

任丹丹，陳 谷*

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

探討黃秋葵結合膽酸的有效組分的分離純化，通過水提醇沉提取黃秋葵粗多糖(raw polysaccharide，RPS)，經DEAE-纖維素陰離子交換層析柱分離得到3種多糖洗脫組分E1、E2和E3；對3種組分的體外結合膽酸能力進行分析。結果顯示：組分E1和E2有較高的膽酸結合能力，分別為參照藥物消膽胺的10.82%和10.60%，黃秋葵多糖體外結合膽酸作用較強。

黃秋葵；多糖；醇沉；陰離子交換層析；膽酸結合

Abstract：In order to investigate active components having the ability to bind bile acid from okra,Abelmoschus esculentus(L.)Moench, raw polysaccharide (RPS) was obtained from the fresh fruits of okra by water extraction and ethanol precipitation.RPS was further purified by DEAE anion exchange chromatography to obtain fractions E1, E2 and E3. Their bile acid-binding capacitiesin vitrowere determined. The results indicated that fractions E1 and E2 presented different bile acid binding capacities,which accounted for 10.82% and 10.60% of that of cholestyramine, respectively. These investigations provide some significant references for exploring and developing okra as health food or functional additives.

Key words：okra；polysaccharide；ethanol precipitation；anion exchange chromatography；bile acid binding capacity

2007年，中國衛(wèi)生部心血管病防治研究中心推出《中國成人血脂異常防治指南》，呼吁大家重視血脂問題，指出血脂異常已經成為我國居民的一個重要公共衛(wèi)生問題。血脂異常是導致冠心病、心肌梗死、心臟猝死等疾病的危險因素，它通過加速全身動脈粥樣硬化，對身體造成隱匿、逐進性、全身性和器質性的損害。然而，我國目前的血脂異常患者多是輕、中度血脂異常的中、低危人群，并不需要通過藥物降脂。因此，開發(fā)純天然具有降脂功效的保健品，變治病為防病，越來越受人們的關注。

血脂是血液中的脂肪類物質，包括膽固醇、甘油三酯、磷脂和非游離脂肪酸等的總稱。包括人類在內的哺乳動物可以將膽固醇轉化為膽酸，分泌至消化道。一旦膽酸被結合并排泄出體外，將阻斷膽酸的肝腸循環(huán)[1]。體內膽酸的減少，解除了膽酸對膽酸合成關鍵酶7α-羥化酶的反饋抑制，促使更多膽固醇生成膽酸，從而降低血清膽固醇，有利于緩解糖尿病和肥胖癥等血脂異常疾病，并降低罹患癌癥的風險[2-3]。

黃秋葵[Abelmoschus esculentus(L.) Moench]，又名補腎草、秋葵和羊角豆等，為錦葵科秋葵屬一年生草本植物?？晒┦秤玫哪酃糠殖錆M黏液，營養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素、多糖、黃酮類化合物等，是一種營養(yǎng)保健蔬菜[4-5]。美國人稱其為“植物偉哥”，日本人稱其為“綠色人參”，經常食用可增強人體體質，具有很高的開發(fā)價值和潛力。除此之外，實驗證明黃秋葵的嫩果具有抗疲勞[6-7]、治療皮膚癌[8]等功能。

1977年，Woolfe等[9]報道在動物實驗中黃秋葵黏液可降低小鼠的血漿膽固醇，但機理不明。2007年，Kahlon等[10]研究了黃秋葵等多種新鮮蔬菜體外結合膽酸的能力，指出與其他蔬菜，如甜菜、蘆筍、青豆等相比，黃秋葵具有較強的結合膽酸能力。同年Kahlon又報道蒸煮對黃秋葵的膽酸結合能力影響不大[11]。但是，具體黃秋葵的哪種組分能有效結合膽酸沒有進一步的研究。多糖的活性研究表明其具有顯著的結合膽酸、降低膽固醇的作用[12-14]。本實驗通過提取分離黃秋葵多糖，分析各個組分的膽酸結合能力，為進一步確定結合膽酸有效組分、開發(fā)利用黃秋葵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵購于廣州蔬菜批發(fā)市場。

DEAE-纖維素 上海試劑二廠；纖維素、消膽胺、膽酸、胰酶 Sigma公司；總膽酸TBA測定試劑盒Diazyme公司；透析袋(6～8kD) 北京普博欣生物科技有限公司；無水乙醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、苯酚(重蒸)、濃硫酸、氯化鈉等均為國產分析純試劑。

1.2 儀器與設備

EYELA真空旋轉蒸發(fā)器 上海愛朗儀器有限公司；冷凍干燥機 美國Thermo公司；臺式高速離心機 美國貝克曼公司；冷凍離心機 德國Eppendorf公司；QL-901型漩渦混合器 江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；HL-2B恒流泵、SBS-100數(shù)控計滴自動部份收集器上海滬西分析儀器廠有限公司；UV-2300紫外-可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；HYG-A全溫搖瓶柜 太倉市實驗設備廠；恒溫培養(yǎng)箱 上海索譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的分離純化

黃秋葵干粉的制備：稱取新鮮黃秋葵嫩果，蒸餾水清洗干凈。將其平均分為兩部分，一部分切成長約3cm小段，沸水蒸煮15min；另一部分不做處理。然后將兩部分同時進行－80℃預凍，冷凍干燥，磨成粉狀，密封，干燥保存。分別得到黃秋葵干粉和蒸煮干粉。

黃秋葵粗多糖(RPS)的提取[15]：采用水提醇沉法，取新鮮黃秋葵嫩果，蒸餾水清洗干凈，組織搗碎機搗碎，加蒸餾水浸泡過夜，離心去除沉淀。在上清液中加無水乙醇(乙醇的終體積分數(shù)為45%)，靜置過夜，離心取醇沉淀。將沉淀物真空抽濾去除殘留的乙醇。加少量蒸餾水至提取物完全復溶，用大量蒸餾水透析，真空濃縮，冷凍干燥，得黃秋葵粗多糖。

DEAE-纖維素的預處理：稱取30g DEAE-纖維素,蒸餾水浸泡過夜后抽濾；用0.5mol/L NaOH溶液浸泡30min，蒸餾水洗至中性；0.5mol/L HCl溶液浸泡30min，蒸餾水洗至中性；0.5mol/L NaOH溶液浸泡30min，蒸餾水洗至中性。抽真空脫氣，裝入層析柱(3.0cm×18cm)，用蒸餾水平衡過夜。

黃秋葵粗多糖的分離[16]：稱取0.13g黃秋葵粗多糖，溶于10mL去離子水中，上DEAE-纖維素層析柱，分別用去離子水、0.25mol/L PBS(pH6.0)、0.5mol/L PBS(pH6.0)、0.5mol/L NaOH溶液洗脫?？刂屏魉贋?mL/min，自動收集器10min/管收集。用苯酚-硫酸法快速檢測含糖管[17]：吸取洗脫液1mL/管于具塞試管中，每管加5g/100mL苯酚液0.5mL，邊振蕩邊加濃硫酸2.5mL，搖勻放置5min，沸水浴中加熱15min，迅速冷至室溫，于490nm波長處測定吸光度，檢測出含糖管，得洗脫曲線。收集同一洗脫峰的各含糖管，洗脫液經過透析，真空濃縮，冷凍干燥，得黃秋葵多糖各洗脫組分，分別為 E1、E2 和 E3。

1.3.2 體外膽酸結合實驗

根據(jù)人體機理，膽酸結合的過程主要是模擬人的胃腸環(huán)境，參考Kahlon等[10]的膽酸結合研究方法，并略加修改。基于人體胃腸膽酸成分[18-19]，按體積分數(shù)配膽酸混合物，主要包含75%甘氨膽汁酸和25%?；悄懼帷８拾蹦懼幔焊拾蹦懰?9mmol/L)、甘氨鵝脫氧膽酸(9mmol/L)、甘氨脫氧膽酸(9mmol/L)。牛磺膽汁酸：?；悄懰?3mmol/L)、?；蛆Z脫氧膽酸(3mmol/L)、?；敲撗跄懰?3mmol/L)。膽酸溶于0.1mol/L PBS(pH6.3)，母液濃度36mmol/L，－20℃保存，用前稀釋至0.72μmol/mL。

精確稱取各個樣品至2mL離心管，加0.2mL 0.01mol/L HCl溶液，37℃，溫育1h。用0.1mol/L NaOH溶液調節(jié) pH 至6.3，加0.8mL 膽酸(0.72μmol/mL)、1mL 胰酶(10mg/mL)，混勻，37℃，溫育1h。13000r/min離心18min，轉移上清至5mL離心管。用1mL PBS(0.1mol/L，pH6.3)沖洗2mL離心管及沉淀，離心，將兩次上清混合，－20℃保存，待測殘留膽酸濃度。每個樣品做3個平行。同時做空白樣(不加樣品，其他操作相同)。另外，取樣品不加膽酸，用0.8mL PBS(0.1mol/L，pH6.3)代替，其他操作相同以扣除樣品背景。各樣品的量：黃秋葵干粉20mg、黃秋葵蒸煮干粉20mg、黃秋葵粗多糖10mg、E110mg、E210mg、E310mg、消膽胺5mg、纖維素5mg。消膽胺是一種結合膽酸的藥物，纖維素不結合膽酸，分別設為陽性對照100%和陰性對照0%。

1.3.3 膽酸含量檢測

經膽酸結合后的樣品，使用Diazyme測量總膽酸的試劑盒檢測其中膽酸含量。膽酸和試劑盒試劑反應形成甲瓚(formazan)，在540nm波長處測的吸光度與膽酸濃度成正比例。樣品膽酸濃度由標準曲線來確定。標準曲線的制作：用0.1mol/L PBS(pH6.3)配制濃度分別為0、10、50、100、200μmol/L的膽酸溶液，用膽酸試劑盒測吸光度ΔA540nm；以ΔA540nm為縱坐標，膽酸濃度為橫坐標得膽酸標準曲線。試劑盒方法概述如下：將R1*加至R3*中，新鮮配制R3。取150μL R3至微量比色皿，加20μL膽酸結合后樣品，混勻，37℃，溫育4min。加30μL R2*，混勻，立即測其540nm波長處的吸光度(A1)。樣品放置37℃，溫育5min，再測其 540nm 波長處的吸光度(A2)。計算樣品的ΔA540nm=A2－A1。每個樣品做3次測量 (R1*、R2*、R3*均為試劑盒中試劑)。

2 結果與分析

2.1 多糖的分離純化

黃秋葵經水提醇沉，透析凍干得到粗多糖，產率約0.40%，呈黃色絮狀固體。由于多糖一般為中性或酸性帶負電荷，因此采用陰離子交換樹脂DEAE-纖維素層析柱分離純化黃秋葵粗多糖，分別用去離子水、0.25mol/L PBS(pH6.0)、0.5mol/L PBS(pH6.0)、0.5mol/L NaOH溶液洗脫。用苯酚-硫酸法快速檢測出含糖管，得到洗脫曲線，結果見圖1。收集各個洗脫峰的含糖管，經透析，冷凍干燥，得到3種不同的含糖組分，分別為E1、E2和E3。

圖1 黃秋葵粗多糖的DEAE-纖維素層析柱圖譜Fig.1 Elution profile of okra raw polysaccharide on DEAE-cellulose column

從圖1可知，洗脫峰平滑，不同洗脫液峰和峰之間的分離效果好，達到分離目的。去離子水洗脫部分未見含糖組分；0.25mol/L PBS洗脫在18～35管之間得到洗脫組分；0.5mol/L PBS洗脫在42～60管之間得到洗脫組分；0.5mol/L NaOH溶液洗脫在67～85管之間得到洗脫組分。收集各個洗脫液的含糖管，經透析凍干后得產物E1、E2和E3，其產率分別為11.6%、22.2%和36.2%。DEAE-纖維素在分級時，可脫除粗多糖的部分色素，得到的分級組分呈淺黃色，絮狀固體。

2.2 膽酸結合能力檢測

膽酸在人體肝臟中合成后被分泌到消化道內，如果膽酸在腸道未被結合，就會被回腸重吸收進入肝腸循環(huán)；如果膽酸被食物結合阻礙重吸收入血液，將促使更多的膽固醇轉化成膽酸，從而降低體內的膽固醇含量。在體外條件下，模擬人體胃腸環(huán)境進行膽酸結合實驗，用膽酸試劑盒制作標準曲線(圖2)，并檢測膽酸結合后剩余膽酸的量，來分析各組分的膽酸結合能力。

圖2 膽酸濃度的標準曲線Fig.2 Standard curve of bile acid

檢測黃秋葵干粉、蒸煮干粉和粗多糖的膽酸結合能力，結果見表1。在相同的干質量條件下，相對于消膽胺(設為100%)，黃秋葵干粉和蒸煮干粉的膽酸結合能力分別為：11.48%和10.38%。與纖維素相比，有極顯著的膽酸結合能力(P＜0.001)。蒸煮過后膽酸結合能力略有下降，但兩者差異不大，表明蒸煮處理對黃秋葵的膽酸結合能力影響不大，這與Kahlon等[11]的報道相一致。在相同干質量下，黃秋葵粗多糖的膽酸結合能力為14.13%，較黃秋葵干粉和蒸煮干粉有所提高，說明粗多糖中富集了結合膽酸的有效組分。

表1 黃秋葵干粉、蒸煮干粉和粗多糖的膽酸結合能力Table 1 in vitroBile acid binding capacities of lyophilized powder,steamed-lyophilized powder and RPS from okra

對黃秋葵粗多糖用DEAE-纖維素陰離子交換層析柱分級后得到的3種組分，E1、E2和E3的膽酸結合能力進行分析，結果見表2。在相同的干質量條件下，E3組分沒有結合膽酸的能力；而E1和E2組分均可結合膽酸，相對于消膽胺，結合能力分別為10.82%和10.60%，兩種組分膽酸結合能力基本相同。說明經陰離子交換層析分級分離，黃秋葵粗多糖中結合膽酸的有效組分落在E1和E2組分，而E3的糖組分不具結合膽酸的有效成分。

表2 E1、E2和E3的膽酸結合能力Table 2 in vitroBile acid binding capacities of RPS and fractions E1,E2 and E3

3 討 論

本實驗用水提醇沉法提取黃秋葵粗多糖，并將粗多糖經DEAE-纖維素分級分離，得到3種不同的含糖組分，依膽酸結合實驗，確定了膽酸結合能力較強的組分為E1和E2。

2004年，Lengsfeld等[16]報道，體外實驗中黃秋葵的含糖組分可以抑制幽門螺旋桿菌吸附人的胃黏膜，將水提醇沉得到的粗多糖經過DEAE-Sephacel層析分級分離，發(fā)現(xiàn)抗吸附的有效組分落在NaOH溶液的洗脫組分。參考0.25mol/L PBS、0.5mol/L PBS和0.5mol/L NaOH洗脫組分的成分和結構分析結果，推測，本實驗中E1、E2組分含大量的半乳糖醛酸，以及鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸等。而膽酸結合能力除了與糖成分相關外，更與多糖的復雜結構相關，具體的成分和結構有待進一步的分析。

在分離純化膽酸結合組分的過程中，粗多糖富集了有效組分，膽酸結合能力有提高(14.13±1.21)%，但是經DEAE-纖維素分級分離后，相同干質量下E1和E2組分的膽酸結合能力反而低于黃秋葵粗多糖(10.82±0.11)%、(10.60±1.55)%。純化過程中，E1、E2和E3含糖組分的得率分別為11.6%、22.2%和36.2%，損失了約30%的其他組分，估計大部分是洗脫在不含糖的各管洗脫收集液中。有報道，蛋白質可以結合膽酸[20-21]；黃秋葵粗多糖含數(shù)種分子質量介于25～37kD的糖蛋白，而經DEAE層析后蛋白組分基本去除[16]。故推測黃秋葵粗多糖含有結合膽酸的蛋白成分，但在DEAE分級分離中被除去，導致膽酸結合能力下降。也可能，粗多糖中較高的膽酸結合能力是源于糖蛋白與多糖形成復雜的三維結構，有利于結合膽酸，而在DEAE層析分離過程中被破壞。真實的情況有待進一步研究。另外，多糖之間的協(xié)同效應也可能是造成純化組分的膽酸結合能力有所下降的原因，進一步的實驗正在進行中。

在體外模擬人體胃腸環(huán)境結合膽酸，并用試劑盒檢測殘留膽酸的量，是從化學反應的角度描述黃秋葵的膽酸結合能力。結果顯示多糖提取組分有明顯的膽酸結合能力，但是否會促進體內膽固醇含量的降低還要經動物實驗來證明，然而動物實驗存在費用高、實驗周期長和社會道德等問題。在人體肝臟內膽固醇轉化為膽酸過程中有多種酶的參與，其中膽固醇7α-羥化酶(CYP7A1)被認為是該反應的關鍵酶，膽酸反饋抑制CYP7A1基因的轉錄表達[22]。因此，我們正在建立介于簡單的化學反應和復雜的動物模型之間的三維細胞培養(yǎng)模型，通過CYP7A1啟動子引導的綠色熒光蛋白報告基因表達情況來反映CYP7A1的表達量，實現(xiàn)快速高通量的篩選提高CYP7A1表達、促進膽固醇轉化的生物活性分子或健康食品。

[1] ANDERSON J W, SIESEL A E. Hypercholesterolemia effects of oat products[J]. Advances in Experimental Medicine and Biology, 1990,270:17-36.

[2] KOBAYASHI M, IKEGAMI H, FUJISAWA T, et al. Prevention and treatment of obesity, insulin resistance, and diabetes by bile acid-binding resin[J]. Diabetes, 2007, 56:239-247.

[3] COSTARELLI V, KEY T J, APPLEBY P N, et al. A prospective study of serum bile acid concentrations and colorectal cancer risk in postmenopausal women on the island of Guernsey[J]. British Journal of Cancer, 2002, 86(11):1741-1744.

[4] 覃世成. 藥食兼用保健蔬菜:黃秋葵[J]. 農業(yè)新技術, 2003, 4(4):195.

[5] SAVELLO P A, MARTINS F, HULL W. Nutrition composition of okra seed meals[J]. Journals of Agricultural and Food Chemistry, 1980, 28(6):1163-1166.

[6] 李建華, 陳珊. 黃秋葵水提液抗疲勞的藥效學觀察[J]. 中國運動醫(yī)藥學雜志, 2004, 23(2):196-197.

[7] 王君耀, 周峻, 湯谷平. 黃秋葵抗疲勞作用的研究[J]. 中國現(xiàn)代應用藥學雜志, 2003, 20(4):316-317.

[8] 張忠堤. 秋葵用濕潤暴露療法治療燒(燙)傷73例報告[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 1995, 11(增刊1):75-76.

[9] WOOLFE J A. The effect of okra mucilage (Hibiscus esculentusL.) on the plasma cholesterol level in rats[J]. Proceedings of the Nutrituion Society, 1977, 36(2):59A.

[10] KAHLON T S, CHAPMAN M H, SMITH G E.In vitrobinding of bile acids by okra, beets, asparagus, eggplant, turnips, green beans, carrots,and cauliflower[J]. Food Chemistry, 2007, 103:676-680.

[11] KAHLON T S, CHIU M C, CHAPMAN M H. Steam cooking significantly improvesin vitrobile acid binding of beets, eggplant, asparagus,carrots, green beans, and cauliflower[J]. Nutrition Research, 2007, 27:750-755.

[12] 衣艷君. 枸杞降血脂作用的實驗研究[J]. 首都師范大學學報, 2000,21(4):68-70.

[13] 季麗娜, 陳葆春, 劉洪德, 等. 北蟲草制品免疫功能、調節(jié)血脂和抗疲勞功能與營養(yǎng)的實驗研究[J]. 實用預防醫(yī)學, 2002, 9(2):178-179.

[14] 廖建民, 沈子龍, 張瑾. 海帶多糖中不同組分降血脂及抗腫瘤作用的研究[J]. 中國藥科大學學報, 2002, 33(1):55-57.

[15] 王文平, 郭汜遠, 李琳, 等. 野木瓜水溶性多糖的提取、分離及結構分析[J].華南理工大學學報, 2008, 36(7):128-132.

[16] LENGSFELD C, TITGEMEYER F, FALLER G, et al. Glycosylated compounds from okra inhibit ashesion of helicobacter pylori to human gastric mucosa[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004,52(6):1459-1503.

[17] 佘曉雷, 張可, 鄭旭霞. 蘆薈中多糖含量測定方法的探討[J]. 營養(yǎng)學報, 2003, 25(2):149-152.

[18] CAREY M C, SMALL D M. The characteristics of mixed micellar solutions with particular references to bile[J]. American Journal of Medcine,1970, 49:590-608.

[19] ROSSI S S, CONVERSE J L, HOFFMAN A F. High pressure liquid chromatography analysis of conjugated bile acids in human bile:simultaneous resolution of sulfated and unsulfated lithocholyl amidates and the common conjugated bile acids[J]. Journal of Lipid Research, 1987,28:589-595.

[20] EBERINI I, ROCCO A G, IENTILE A R, et al. Conformational and dynamics changes induced by bile acids binding to chicken liver bile acid binding protein[J]. Proteins, 2008, 71(4):1889-1898.

[21] KANDA T, NIOT I, FOUCAUD L, et al. Effect of bile on the intestinal bile-acid binding protein (I-BABP) expression.in vitroandin vivostudies[J]. FEBS Lett, 1996, 384(2):131-134.

[22] GILARDI F, MITRO N, GODIO C, et al. The pharmacological exploitation of cholesterol 7α-hydroxylase, the key enzyme in bile acid synthesis:from binding resins to chromatin remodeling to reduce plasma cholesterol[J]. Pharmacology and Therapeutics, 2007, 116:449-472.

Extraction, Purification and Bile Acid-binding Capacityin vitroof Polysaccharides from Okra

REN Dan-dan，CHEN Gu*
(College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Q53

A

1002-6630(2010)13-0110-04

2009-09-18

任丹丹(1987—)，女，碩士研究生，研究方向為糖類物質及其藥物的制備與生物利用。E-mail：rendandan619@163.com

*通信作者：陳谷(1973—)，女，副教授，博士，研究方向為糖類物質及其藥物的制備與生物利用。E-mail：chengu@scut.edu.cn