楊曉靜，陳灝，閆海，*，秦波

1.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085

2.北京科技大學(xué)應(yīng)用科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)技術(shù)系，北京100083

納米二氧化鈦和單壁碳納米管對普通小球藻生長的抑制效應(yīng)

楊曉靜2，陳灝1，閆海2，*，秦波2

1.中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心環(huán)境水質(zhì)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100085

2.北京科技大學(xué)應(yīng)用科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)技術(shù)系，北京100083

納米材料獨(dú)特的理化性質(zhì)使其得到了廣泛的應(yīng)用，但其可能帶來的生物安全性問題引起了社會各界的廣泛關(guān)注.采用污染物藻類毒性測試的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法，研究了納米二氧化鈦（nano-TiO2）和單壁碳納米管（SWCNTs）對普通小球藻（Chlorella vulgaris）生長的抑制效應(yīng).結(jié)果表明，在0.01～500mg·L-1濃度范圍內(nèi)，nano-TiO2對普通小球藻的生長沒有明顯的抑制現(xiàn)象，而SWCNTs卻對普通小球藻的生長存在明顯的抑制效應(yīng)，其96h半效應(yīng)濃度（96h-EC50）為261.5mg·L-1.光學(xué)和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與nano-TiO2相比，SWCNTs能夠發(fā)生凝聚并吸附大量的普通小球藻細(xì)胞，因此嚴(yán)重抑制了普通小球藻的正常生長.

普通小球藻；納米二氧化鈦；單壁碳納米管；毒性效應(yīng)

1 引言（Introduction）

20世紀(jì)80年代以來，納米技術(shù)和納米材料迅速發(fā)展，應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，由此帶來的生物安全性已經(jīng)成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn).納米材料是指幾何尺寸達(dá)到100nm以下水平，并具有特殊性能的納米效應(yīng)材料（白春禮，2001）.由于納米材料獨(dú)特的理化性質(zhì)和強(qiáng)度高、電磁學(xué)性能好等優(yōu)點(diǎn)，在電子、磁學(xué)、光學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化妝品、能源、傳感器和催化等領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用（鄒莉，2004）.納米材料可以通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境及生物體內(nèi)，構(gòu)成對環(huán)境和人體健康潛在的影響和風(fēng)險，因此納米材料的生物學(xué)效應(yīng)和環(huán)境安全問題不可忽視，與之相關(guān)的毒理學(xué)研究十分重要（朱小山等，2008）.

近年來，國內(nèi)外已對單壁碳納米管（SWCNTs）、納米二氧化鈦（nano-TiO2）等納米材料的毒性效應(yīng)進(jìn)行了深入研究（Nel et al.,2006;Smart et al.,2006;Hurt et al.,2006;汪冰等，2005;諸穎和李文新，2008）.研究表明，SWCNTs不僅可導(dǎo)致大鼠肺組織損傷和肉芽腫的形成（Lam et al.,2004;Warheit et al.,2004），而且可引起小鼠肝臟組織蛋白質(zhì)的氧化損傷和大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷（趙明明等，2008;林治卿等，2006）.nano-TiO2可導(dǎo)致小鼠肺部組織的纖維化并有可能誘發(fā)肺癌（朱融融等，2006），沉積在肺部的nano-TiO2顆粒在體液和血液的帶動下，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)運(yùn)至心臟、肝臟和腎臟等器官，引起相應(yīng)的毒性癥狀（王江雪等，2008）.

微細(xì)藻類作為水生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級生產(chǎn)者，可以通過光合作用固定二氧化碳合成有機(jī)物，對整個水生態(tài)系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定具有至關(guān)重要的作用.在微細(xì)藻類中，小球藻在淡水、海水中均有分布，是人類最早篩選分離出的微細(xì)藻類.小球藻具有生態(tài)分布廣和生長周期短等特點(diǎn)，可以作為典型的實(shí)驗(yàn)藻種來直接觀察細(xì)胞水平上的中毒癥狀，是較理想的水環(huán)境生態(tài)毒理學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)生物（謝艷等，2008）.

作為一種新型污染物，納米材料可進(jìn)入各種受納水體，對水生生態(tài)系統(tǒng)各級生物產(chǎn)生影響.目前有關(guān)納米材料對哺乳動物、魚類等高端生物的毒性已有大量研究（Lam et al.,2004;玉曉微等，2009），但對作為水生初級生產(chǎn)力的微細(xì)藻類的毒性效應(yīng)研究報道極少，因此本文初步研究了SWCNTs和nano-TiO2這兩種重要的納米材料對普通小球藻生長的毒性效應(yīng)，這對于評價納米材料的生態(tài)風(fēng)險及安全性具有重要的意義.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

普通小球藻（Chlorella vulgaris Beij）購自中科院武漢水生生物研究所.nano-TiO2為銳鈦型（粒度為20～30nm），由北京賽特瑞試劑公司提供；SWCNTs（直徑＜2nm，長度0.5～50μm），由深圳市納米港有限公司提供.

2.2 培養(yǎng)條件

采用水生4號培養(yǎng)基（周永欣和章宗涉，1989），初始pH值調(diào)為7.0.將小球藻藻種接種到培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代培養(yǎng)3次待進(jìn)入對數(shù)生長期時進(jìn)行實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)所用容器為100mL三角瓶，培養(yǎng)量為30mL，每組設(shè)3個平行樣.小球藻培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為4000Lux，光暗比12h∶12h.每天搖瓶2次.實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基和器皿等均經(jīng)過121℃、20min高溫高壓滅菌，然后在潔凈工作臺內(nèi)經(jīng)過20min的紫外線殺菌后使用.實(shí)驗(yàn)開始后每天定時取樣，在光學(xué)顯微鏡放大400倍下通過血球計數(shù)板計數(shù)藻細(xì)胞濃度.

2.3 毒性實(shí)驗(yàn)

納米材料各濃度組采用水生4號培養(yǎng)基配制，接種前超聲波充分振蕩.

采用有毒化學(xué)品對藻類毒性測試的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法，確定納米材料抑制普通小球藻生長的96h半效應(yīng)濃度（96h－EC50）（周永欣和章宗涉，1989）.nano－TiO2實(shí)驗(yàn)：初始藻密度1.9×106個·mL-1；濃度系列：0、0.01、1、50、100、500mg·L－1；培養(yǎng)時間96h.SWCNTs實(shí)驗(yàn)：初始藻密度2.1×106個·mL－1；初步實(shí)驗(yàn)納米材料初始濃度配制呈幾何級數(shù)增加，根據(jù)96h實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用直線內(nèi)插法初步計算出納米材料抑制普通小球藻生長的96h－EC50.正式實(shí)驗(yàn)納米材料的濃度以初步實(shí)驗(yàn)確定的96h－EC50為中心，各向兩邊以等差數(shù)列的形式延伸2個濃度，共1組對照（0mg·L－1）和5組濃度（150、200、250、300、350mg·L－1）進(jìn)行；培養(yǎng)時間96h.每天定時取樣，在光學(xué)顯微鏡放大400倍下通過血球計數(shù)板計數(shù)藻細(xì)胞濃度.以藻細(xì)胞濃度為指標(biāo)，采用機(jī)率單位法得到納米材料的劑量反應(yīng)方程，通過此方程計算出96h－EC50，并對計算出的96h－EC50進(jìn)行X2檢驗(yàn).

2.4 電鏡實(shí)驗(yàn)

取培養(yǎng)96h的各實(shí)驗(yàn)組藻液5mL，8000rpm離心10min，棄上清，加入2.5%戊二醛固定2h，8000rpm離心5min，棄上清.用磷酸鹽緩沖液清洗3遍，每次8000rpm離心5min棄上清，然后加入5mL無菌水，充分混勻，在錫紙上滴加10μL樣品，自然晾干.真空干燥箱內(nèi)40℃干燥6h.干燥好的樣品用導(dǎo)電膠粘附在電鏡樣品臺上噴碳，在SEM掃描電鏡上進(jìn)行觀察.

3 結(jié)果與分析（Results and analysis）

3.1 nano-TiO2對普通小球藻生長的影響

不同nano-TiO2濃度下，普通小球藻生長至96h的藻細(xì)胞濃度如圖1所示.由圖1可見，在0.01～500mg·L－1濃度范圍內(nèi)，nano-TiO2對普通小球藻的生長沒有產(chǎn)生明顯的有規(guī)律性的抑制效應(yīng)，藻細(xì)胞濃度均維持在1.7×106個·mL－1左右.

3.2 SWCNTs對普通小球藻生長的影響

初步實(shí)驗(yàn)采用直線內(nèi)插法得到SWCNTs抑制普通小球藻生長的96h-EC50約為250mg·L－1，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了SWCNTs對普通小球藻生長的抑制效應(yīng)，結(jié)果如圖2所示.由圖可見，隨SWCNTs濃度的升高，普通小球藻藻密度顯著降低（p＜0.05）.當(dāng)濃度為300mg·L－1時，普通小球藻的生長受到明顯的抑制.

根據(jù)圖2計算得到的SWCNTs濃度對數(shù)（x）、細(xì)胞濃度、抑制率和機(jī)率單位（y）等指標(biāo)見表1，將SWCNTs濃度對數(shù)（x）與機(jī)率單位（y）進(jìn)行一元線性回歸，得到如下劑量反應(yīng)方程：y=2.7733x－1.7042，R2=0.9909.當(dāng)機(jī)率單位為5時，通過上述方程計算得到SWCNTs抑制普通小球藻生長的96h-EC50為261.5mg·L－1.

表1 單壁碳納米管抑制普通小球藻生長的實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1Result of inhibition effect of SWCNTs on the growth of Chlorella vulgaris

為了驗(yàn)證計算所得到的96h-EC50的可靠性，對上述劑量反應(yīng)方程進(jìn)行X2檢驗(yàn)，結(jié)果見表2．查X2表，當(dāng)自由度為3時，=7．82，而X2計算值為0．59，＞X2，故上述劑量反應(yīng)方程符合精度要求，計算得到的96h-EC50真實(shí)可靠．

3.3 納米材料抑制普通小球藻生長的顯微觀察

為了進(jìn)一步研究納米材料抑制普通小球藻生長的過程和機(jī)理，我們分別在光學(xué)和電子顯微鏡下對納米材料和普通小球藻相互作用的現(xiàn)象進(jìn)行了觀察.在光學(xué)顯微鏡放大400倍下，普通小球藻細(xì)胞呈圓形分散分布（圖3a），SWCNTs會發(fā)生一定的凝聚形成較大的顆粒（圖3b）.當(dāng)SWCNTs與普通小球藻同時存在時，發(fā)現(xiàn)在團(tuán)聚的SWCNTs周圍吸附了大量的普通小球藻細(xì)胞，形成了更大的顆粒物（圖3c）.而nano-TiO2基本呈現(xiàn)分散分布且不發(fā)生團(tuán)聚（圖3d），當(dāng)與普通小球藻同時存在時，二者也基本呈現(xiàn)分散分布狀態(tài)，沒有形成大顆粒的凝聚現(xiàn)象（圖3e）.

表2 劑量反應(yīng)方程的X2檢驗(yàn)Table 2The X2test of the linear dose-response equations

電鏡觀察結(jié)果與光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果基本一致.普通小球藻細(xì)胞呈圓形分散分布（圖4a），SWCNTs發(fā)生凝聚形成較大的顆粒（圖4b），當(dāng)SWCNTs與普通小球藻共存時，在團(tuán)聚的SWCNTs顆粒周圍吸附了大量的普通小球藻細(xì)胞，形成了更大的顆粒物（圖4c）.而nano-TiO2與普通小球藻同時存在時，雖然普通小球藻周圍也存在一些nano-TiO2（圖4d），但基本呈現(xiàn)分散分布，沒有形成由上述兩種物質(zhì)組成的較大顆粒（圖4c）.因此SWCNTs吸附大量的普通小球藻細(xì)胞形成較大的顆粒，影響了普通小球藻的光合作用及代謝可能是SWCNTs對普通小球藻生長抑制程度遠(yuǎn)高于nano-TiO2的主要原因.

4 討論（Discussion）

通常認(rèn)為納米材料的毒性與納米顆粒的粒徑和比表面積有關(guān)，粒徑越小，比表面積越大，與細(xì)胞接觸的區(qū)域越多，更有利于納米顆粒的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，更容易引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變，納米材料毒性效應(yīng)也就越大（Teeguarden et al.,2007）.SWCNTs有較大的比表面積，由于其具有獨(dú)特的表面化學(xué)和電輸運(yùn)特性，可能引發(fā)電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷、功能紊亂甚至壞死（Lam et al.,2006）.SWCNTs會引起巨噬細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞器縮小、細(xì)胞質(zhì)中小泡縮小變形等現(xiàn)象，并可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)（孟幻等，2006）.另外，SWCNTs表面帶有大量具有強(qiáng)氧化還原性質(zhì)的電子簇，可能會與細(xì)胞表面的載體通道、各種受體結(jié)合，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致羰基含量增多；進(jìn)入細(xì)胞的SWCNTs也可能與酶結(jié)合使酶失活，還有可能通過二次氧化或還原產(chǎn)生大量的有害自由基從而改變組織內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞內(nèi)有序結(jié)構(gòu)和正常的代謝功能（馮晶等，2006）.

nano-TiO2具有很強(qiáng)的吸附能力和良好的光學(xué)催化特性，因?yàn)榧{米顆粒大小與生物分子相差不大，其被生物體攝取后很容易進(jìn)入到細(xì)胞中，因此造成毒性效應(yīng).Lu等（2003）用nano-TiO2培養(yǎng)大腸桿菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細(xì)胞壁被降解，出現(xiàn)細(xì)胞膜損傷，細(xì)胞的通透性受到破壞，引起細(xì)胞內(nèi)容物外流，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡.目前，對nano-TiO2的生物毒性作用機(jī)制尚未完全了解，但其具有的光學(xué)催化特性、活性氧簇ROS的產(chǎn)生及體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)的增強(qiáng)可能是其最主要的致毒作用機(jī)制（Nel et al.,2006）.當(dāng)用波長小于400nm的紫外線照射nano-TiO2時，在水溶液環(huán)境下，nano-TiO2顆粒表面會產(chǎn)生具有強(qiáng)氧化能力的自由基-·OH和O2·-，而羥基自由基可以與DNA發(fā)生反應(yīng)生成8-羥基鳥苷，導(dǎo)致DNA的解旋和氧化損傷，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長（朱融融等，2005）.

雖然納米材料對微生物和動物細(xì)胞毒性及機(jī)理方面已有大量研究報道，但對生態(tài)系統(tǒng)初級生產(chǎn)力微細(xì)藻類的毒性研究方面卻報道很少.本研究通過采用有毒化學(xué)品對藻類毒性測試的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法，比較了nano-TiO2和SWCNTs對普通小球藻生長的抑制效應(yīng)，結(jié)果表明在500mg·L-1范圍內(nèi)nano-TiO2對普通小球藻生長的抑制效應(yīng)不明顯（圖1），而SWCNTs卻可顯著抑制普通小球藻的生長，其96h-EC50為261.5mg·L-1（圖2），SWCNTs對普通小球藻生長的抑制毒性效應(yīng)遠(yuǎn)大于nano-TiO2.進(jìn)一步通過光學(xué)和電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，nano-TiO2在水體中基本呈現(xiàn)分散分布且不發(fā)生團(tuán)聚，當(dāng)與普通小球藻同時存在時，雖然在小球藻細(xì)胞周圍也吸附少量的nano-TiO2，但仍然沒有形成大顆粒的凝聚現(xiàn)象（圖3和圖4），因此對普通小球藻的光合作用及代謝影響較小.與之相反，SWCNTs在水體中會發(fā)生凝聚現(xiàn)象形成較大的顆粒，在與普通小球藻共存時，會吸附大量的小球藻進(jìn)而形成更大的顆粒（圖3和圖4），因此阻礙了普通小球藻吸收光和代謝的效率，進(jìn)而嚴(yán)重抑制了普通小球藻的生長.研究表明，活性氧ROS的生成和氧化應(yīng)激反應(yīng)也是碳納米管細(xì)胞毒性的重要方式（Nel et al.,2006;Lam et al.,2006），在SWCNTs對小球藻生長抑制過程中ROS和氧化應(yīng)激是否起作用值得進(jìn)一步研究.

大量研究表明，納米材料的小尺寸效應(yīng)和其誘導(dǎo)產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)是其細(xì)胞毒性產(chǎn)生的主要原因（Nel et al.,2006），本研究結(jié)果顯示，在一定環(huán)境條件下所形成的顆粒大小及對細(xì)胞的吸附作用可能也是影響其細(xì)胞毒性效應(yīng)的原因之一.

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Effects of Nano-TiO2and Single-Walled Carbon Nanotubes on the Growth of Chlorella vulgaris

YANG Xiao-jing2，CHEN Hao1，YAN Hai2，*，QIN Bo2

1.State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry,Research Center for Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100085
2.Department of Biological Science and Technology,University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083

Nanomaterials have been widely used in many fields because of its unique physical and chemical properties.The safety of nanomaterials on organisms is paid increasing attention by people.In this paper,a standard method of algal bioassay for evaluating the toxicity of toxic chemicals was used and the inhibitory effects of nano-TiO2and single-walled carbon nanotubes（SWCNTs）on the growth of Chlorella vulgaris were investigated,respectively.Results showed that the growth of Chlorella vulgaris could not be apparently affected by initial nano-TiO2concentrations from 0.01mg·L-1to 500mg·L-1.However SWCNTs could inhibit the growth of Chlorella vulgaris significantly and its 96h-EC50was calculated as 261.5mg·L-1based on the experimental data.Compared with nano-TiO2,SWCNTs agglomerated and adsorbed a greater amount of the cells of Chlorella vulgaris,which may be responsible for its higher inhibitory effect on the growth of Chlorella vulgaris.

Chlorella vulgaris；nano-TiO2；single-walled carbon nanotubes；toxicity

29 April 2009accepted24 May 2009

1673-5897（2010）1-038-06

X171.5

A

2009-04-29錄用日期：2009-05-24

國家自然科學(xué)重點(diǎn)基金（No.20537020）；北京科技大學(xué)冶金工程研究院基礎(chǔ)理論研究基金；北京科技大學(xué)多學(xué)科交叉項(xiàng)目

楊曉靜（1983—），女，碩士研究生；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:haiyan@sas.ustb.edu.cn

閆海（1962—），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，北京科技大學(xué)應(yīng)用科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系主任，主要研究方向?yàn)槲⒓?xì)藻類和微生物的環(huán)境生物技術(shù).