夏繼剛，牛翠娟，高穎，裴雪姣

北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100875

壬基酚長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚雄魚第二性征、精子活力的影響

夏繼剛，牛翠娟*，高穎，裴雪姣

北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物多樣性與生態(tài)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100875

研究了不同濃度下（0（對(duì)照）、0.1、1、10、100μg·L-1）壬基酚（NP）長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚（Brachydanio rerio）雄魚第二性征、精子活力的影響.結(jié)果表明，NP暴露對(duì)斑馬魚第二性征的影響顯著，可導(dǎo)致雄性個(gè)體出現(xiàn)泄殖乳突、腹部膨大等典型雌性化特征.100μg·L-1NP暴露導(dǎo)致76.9%的雄魚出現(xiàn)泄殖乳突.NP暴露對(duì)斑馬魚精子激活率的影響顯著，隨NP暴露濃度升高精子激活率下降，呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的劑量-效應(yīng)關(guān)系.NP暴露對(duì)斑馬魚精子壽命和精子劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間均有顯著影響.低劑量（0.1μg·L-1）和高劑量（100μg·L-1）NP暴露下精子壽命及其劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間顯著縮短，而中等劑量（10μg·L-1）NP對(duì)上述指標(biāo)影響不顯著（p＞0.05）.斑馬魚第二性征、精子活力可作為指示水體環(huán)境雌激素毒理學(xué)效應(yīng)的敏感指標(biāo).

壬基酚；第二性征；精子活力；斑馬魚

1 引言（Introduction）

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（Endocrine Disrupting Chemicals,EDCs）對(duì)水生生物生命活動(dòng)的影響以及對(duì)人類生殖健康的潛在威脅正日益引起人們的廣泛關(guān)注.壬基酚（Nonylphenol,NP）是一種非離子表面活性劑，廣泛應(yīng)用于造紙、紡織、橡膠塑料、洗滌劑和化妝品等生產(chǎn)中，與人們的日常生活關(guān)系十分密切.NP也是壬基酚聚氧乙烯醚（NPEO）的降解產(chǎn)物，在污水處理后的水體中廣泛存在（Ahel et al.,1994），愈來愈多的研究表明，NP具有雌激素活性，是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物（Jobling et al.,1996;Schwaiger et al.,2002;Chikae et al.,2003）.目前，大量有關(guān)NP內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道集中于NP誘導(dǎo)的雄魚睪丸退化、性激素水平的改變以及肝臟卵黃蛋白原生成等方面（Jobling et al.,1996;Schwaiger et al.,2002;Chikae et al.,2003;Kobayashi et al.,2005）.相對(duì)而言，有關(guān)NP對(duì)第二性征、精子活力等方面的研究報(bào)道較為少見（Hara et al.,2007）.

精子活力是評(píng)價(jià)精液質(zhì)量的重要指標(biāo)，良好的精子活力是進(jìn)行成功受精的基礎(chǔ)（Vladi? and Jarvi,1997;Kime et al.,1996）.有研究表明，魚類精子對(duì)水體環(huán)境污染非常敏感，精子活力可作為敏感而精確的生物標(biāo)志（biomarker），用于水體環(huán)境內(nèi)分泌干擾物污染評(píng)價(jià)（Hara et al.,2007;Hashimoto et al.,2009;Singh et al.,2008;Nice,2005）.研究表明，17α-乙炔基雌二醇（EE2）暴露3周，可導(dǎo)致青鳉（Oryzias latipes）精子運(yùn)動(dòng)速率和精子激活率升高（Hashimoto et al.,2009）；NP短期暴露可導(dǎo)致青鳉精子運(yùn)動(dòng)速率和精子激活率下降（Hara et al.,2007）；2周NP暴露對(duì)青鳉精子運(yùn)動(dòng)速率的影響不顯著（Kawana et al.,2003）；NP長(zhǎng)期暴露可導(dǎo)致具有活動(dòng)精子的牡蠣（Crassostrea gigas）數(shù)量顯著減少（Nice,2005）.除精子活力外，魚體第二性征也是水體環(huán)境內(nèi)分泌干擾物監(jiān)測(cè)敏感而可靠的生物標(biāo)志（Bjerselius et al.,2001;Larsen et al.,2008）.

斑馬魚（Brachydanio rerio）是一種小型熱帶魚，由于其世代周期短、產(chǎn)卵量大、易收集、易于大規(guī)模飼養(yǎng)等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）常規(guī)試驗(yàn)魚種，并作為模式生物被廣泛用于化學(xué)品的各種毒性測(cè)試，是研究?jī)?nèi)分泌干擾作用的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和水體污染監(jiān)測(cè)的理想指示生物（Kime and Nash,1999;Kime,1999）.然而，內(nèi)分泌干擾物對(duì)斑馬魚精子活力的影響尚不完全清楚，尚未見NP暴露對(duì)斑馬魚雄魚第二性征、精子活力影響的文獻(xiàn)報(bào)道.為進(jìn)一步探索NP的環(huán)境雌激素效應(yīng)，并篩選生物標(biāo)志物，本文研究了NP長(zhǎng)期暴露對(duì)斑馬魚雄魚第二性征、精子活力的影響.

2 材料與方法（Materials and methods）

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

斑馬魚種魚由北京大學(xué)斑馬魚中心提供，實(shí)驗(yàn)用魚為經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室多代培養(yǎng)的純種品系，飼養(yǎng)方法參照Westerfield（1995）.實(shí)驗(yàn)條件：實(shí)驗(yàn)用水為充分曝氣脫氯并經(jīng)活性炭過濾的自來水，水溫（25±1）℃，pH 7.8±0.03，光周期14L:10D，ρ＜1g·L－1，每日投喂2次冰凍紅蟲，投喂15min后，吸去殘餌.選取120d以上，健康狀況良好的斑馬魚進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，平均體重（0.406±0.003）g（n=90）.

壬基酚（NP,Sigma公司），以丙酮（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）為助溶劑，配制成10mg·mL－1的NP母液，并稀釋到相應(yīng)濃度，4℃避光保存，待用.對(duì)照組丙酮濃度為10μL·L－1，低于Hutchinson等（2006）所推薦的最大濃度.

2.2 暴露處理

暴露容器為24cm×18cm×20cm的方形玻璃缸.為避免產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，正式暴露試驗(yàn)前，使魚群處于試驗(yàn)環(huán)境條件下，馴養(yǎng)適應(yīng)2周.實(shí)驗(yàn)設(shè)5個(gè)濃度梯度：0、0.1、1、10、100μg·L－1.每個(gè)梯度隨機(jī)放入健康活潑的斑馬魚雄魚15尾，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行組.采用半靜態(tài)暴露裝置，每日換水50%，持續(xù)暴露70d.

2.3 第二性征

斑馬魚雌雄分別具有以下典型特征（Laale,1977;Larsen et al.,2008）：①體型：雌魚身體比雄魚粗壯，尤其是腹部膨大，體圓，各鰭均比雄魚短小，但不明顯；雄魚體細(xì)長(zhǎng)扁平，呈桿形，沒有明顯突出的腹部.雌魚的體高/體長(zhǎng)比要明顯高于雄魚.②體色：雌魚的藍(lán)色條紋偏藍(lán)而鮮艷，間以銀灰色條紋；雄魚藍(lán)色條紋偏黃，間以檸檬色條紋.③泄殖乳突（Urogenital papillae）：此為雌魚所具有的典型特征，雄魚無.暴露60d后，檢查各處理組魚的第二性征并拍照，有改變計(jì)為“1”，無改變計(jì)為“0”.

2.4 精子活力

參照文獻(xiàn)（劉鑒毅等，2007;Alavi et al.,2006），用激活率、劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間、總運(yùn)動(dòng)時(shí)間（精子壽命）等指標(biāo)來評(píng)價(jià)精子活力.激活率以顯微鏡下同一視野中的活動(dòng)精子百分比表示；劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間是指從精液與激活液混合開始，到約70%運(yùn)動(dòng)精子轉(zhuǎn)入緩慢運(yùn)動(dòng)為止的時(shí)間；總運(yùn)動(dòng)時(shí)間是指從精液與激活液混合開始，到視野中約90%的精子停止活動(dòng)或原地震顫為止的時(shí)間.

暴露70d后，顯微鏡下觀測(cè)精子活力.用移液槍吸取各濃度溶液10μL于干燥潔凈的載玻片上，調(diào)節(jié)好顯微鏡，用解剖針尖從性腺蘸取少許精液涂在載波片上，與溶液混勻，即刻于10×20倍顯微鏡下觀察精子活動(dòng)情況，并用秒表記錄各運(yùn)動(dòng)階段的時(shí)間.每尾魚重復(fù)2次.實(shí)驗(yàn)室溫（26±1）℃.由于寄生蟲感染也會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物生理過程的破壞，從而干擾藥物的作用效應(yīng)（Hinton et al.，1992），實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，在解剖鏡下解剖并檢查每條魚的疾病及寄生蟲感染情況.

2.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用軟件SPSS for Windows 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)后，用單因素方差分析（ANOVA）和LSD多重比較檢驗(yàn)差異顯著性；χ2-檢驗(yàn)對(duì)比率數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；線性回歸分析精子激活率與暴露濃度的關(guān)系.各組數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，p＜0.05為差異顯著，p＜0.01為差異極顯著.

3 結(jié)果（Results）

經(jīng)解剖檢查，未發(fā)現(xiàn)有明顯寄生蟲感染的動(dòng)物個(gè)體.對(duì)精子活力的觀察，100μg·L－1NP處理組樣本大小為n=11，其余各組n=15.

3.1 第二性征

NP暴露對(duì)斑馬魚雄魚第二性征的影響顯著，可導(dǎo)致雄性個(gè)體出現(xiàn)泄殖乳突（χ2=53.48;p＜0.01）、腹部膨大（χ2=44.67;p＜0.01）等典型雌性化特征（表1，圖1）.100μg·L－1的NP暴露導(dǎo)致76.92%的雄魚出現(xiàn)泄殖乳突（p＜0.01）；濃度高于10μg·L－1的NP暴露可以顯著改變雄性斑馬魚的體型，導(dǎo)致腹部膨大（p＜0.05）.

表1 NP暴露60d對(duì)斑馬魚雄魚第二性征的影響Table 1Secondary sexual characteristics of male zebrafish after being exposed to different NP concentrations for 60 days

3.2 精子活力

NP暴露對(duì)斑馬魚精子激活率的影響顯著（χ2=118.6；p＜0.01）.隨NP暴露濃度的升高，精子激活率逐漸下降，100μg·L－1NP暴露導(dǎo)致精子激活率極顯著下降（p＜0.01）（圖2）；NP暴露濃度與精子激活率呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)的劑量－效應(yīng)關(guān)系（圖3）.

NP暴露對(duì)斑馬魚精子劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響顯著（F=5.90;p＜0.01）.隨NP暴露濃度的提高，精子劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間表現(xiàn)為低劑量（0.1μg·L－1）下減少（p＜0.05），中高劑量（1、10μg·L－1）有所回升差異不顯著，高劑量（100μg·L－1）下極顯著減少（p＜0.01）（圖4）.

NP暴露對(duì)斑馬魚精子壽命的影響顯著（F=11.31;p＜0.01）.低劑量組（0.1μg·L－1）與高劑量組（100μg·L－1）精子壽命均極顯著縮短（p＜0.01），而中高劑量組（10μg·L-1）與對(duì)照組相比并無顯著性差異（p>0.05）（圖5）.

4 討論（Discussion）

4.1 第二性征

魚類的第二性征是由體內(nèi)雄激素和雌激素的平衡所調(diào)控的（Kime,1998）.內(nèi)分泌干擾物暴露可以導(dǎo)致魚類第二性征的改變（Bjerselius et al.,2001;Larsen et al.,2008;Brion et al.,2004;Toft and Baatrup,2001），17β-雌二醇水體暴露可導(dǎo)致全部雄性金魚失去追星（Tubercles）（Bjerselius et al.,2001）；Brion等（2004）的研究表明，25ng·L-117β-雌二醇暴露3周可誘導(dǎo)斑馬魚雄魚出現(xiàn)泄殖乳突，且隨著劑量的升高出現(xiàn)比例增大；Larsen等（2008）的研究表明，EE2對(duì)斑馬魚泄殖乳突的影響顯著，0.05ng·L-1EE2暴露就可導(dǎo)致出現(xiàn)泄殖乳突的比例顯著升高，同時(shí)，5.00ng·L-1高濃度EE2暴露可導(dǎo)致雄魚體圓、腹部膨大.長(zhǎng)期的內(nèi)分泌干擾物暴露可能通過作用于下丘腦-垂體-性腺軸，持續(xù)干擾促性腺激素的合成與分泌，進(jìn)而破壞動(dòng)物體內(nèi)雄激素和雌激素的平衡，最終導(dǎo)致第二性征的改變.本文的研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道相一致.斑馬魚第二性征可作為指示水體內(nèi)分泌干擾物的敏感指標(biāo)，用于環(huán)境監(jiān)測(cè).

4.2 精子活力

魚類精子是一類分化程度很高的細(xì)胞，由于精巢和精漿中存在抑制因子，精子在精巢中不活動(dòng)，一旦排入水中，精子便立即被激活而開始運(yùn)動(dòng)（Hara et al.,2007）.精子的運(yùn)動(dòng)是靠其尾部鞭毛的擺動(dòng)，外界環(huán)境因子對(duì)魚類精子活力的影響，主要是通過影響cAMP-ATP-Mg2+系統(tǒng)來影響鞭毛的活動(dòng)而實(shí)現(xiàn)（Hoar et al.,1978）.精子活力的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有精子激活的比例、精子激活后的運(yùn)動(dòng)時(shí)間、精子運(yùn)動(dòng)的激烈程度等（Alavi et al.,2006）.Hara等（2007）發(fā)現(xiàn)NP短期暴露導(dǎo)致青鳉精子激活率下降；Nice（2005）的研究結(jié)果表明，NP對(duì)牡蠣精子活力的影響具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，1μg·L-1和100μg·L-1NP暴露可分別導(dǎo)致具有活動(dòng)精子的牡蠣數(shù)從100%下降到30%和12.5%；Kinnberg等（1999）指出，NP可能通過破壞動(dòng)物體內(nèi)性激素水平的平衡影響到睪丸支持細(xì)胞（Sertoli cells）的正常功能，進(jìn)而影響精子質(zhì)量，Sertoli cells以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能為精子發(fā)生提供適宜的微環(huán)境，并為生精細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)支持，對(duì)生精細(xì)胞發(fā)育和活動(dòng)具有至關(guān)重要的調(diào)控作用.此外，精子激活率的降低也可能是由于內(nèi)分泌干擾物暴露導(dǎo)致精子畸形、缺少鞭毛或鞭毛運(yùn)動(dòng)受到抑制造成的（Rurangwaetal.,2002;McAllisterandKime,2003）.本研究中，NP暴露對(duì)斑馬魚精子激活率的影響顯著，隨NP暴露濃度升高，精子激活率逐漸下降，呈顯著負(fù)相關(guān)的劑量-效應(yīng)關(guān)系.研究結(jié)果與Nice（2005）和Hara等（2007）相一致.

精子運(yùn)動(dòng)的時(shí)間長(zhǎng)短以及劇烈程度具有十分重要的生物學(xué)意義，與哺乳類相比，魚類精子激活后運(yùn)動(dòng)時(shí)間很短，精子必須在有限時(shí)間里找到和進(jìn)入受精孔（Billard,1978）.本文實(shí)驗(yàn)中，NP暴露對(duì)斑馬魚精子壽命和精子劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間的影響均顯著，并表現(xiàn)為低劑量（0.1μg·L-1）和高劑量（100μg·L-1）下顯著縮短，而在中等劑量（10μg·L-1）暴露濃度下影響不顯著，提示NP暴露對(duì)精子活力的影響可能具有低劑量-效應(yīng)（Welshons et al.,2003）.NP對(duì)精子活力影響的作用機(jī)制在高劑量和低劑量下可能不同，低劑量下精子壽命和劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)間的縮短可能是由于內(nèi)分泌干擾物暴露促使精子運(yùn)動(dòng)速率增加，從而導(dǎo)致精子儲(chǔ)存能量的快速耗竭所造成的（Hashimoto et al.,2009），而高劑量下精子活力的下降可能是內(nèi)分泌干擾物暴露直接導(dǎo)致精子細(xì)胞線粒體呼吸作用受到抑制、能量代謝受阻、鞭毛運(yùn)動(dòng)受到抑制所致（Rurangwa et al.,2002;McAllister et al.,2003）.有關(guān)NP暴露對(duì)斑馬魚精子形態(tài)學(xué)、精子運(yùn)動(dòng)速率、精子能量代謝及精液成分的影響有待于進(jìn)一步研究.

Ahel M,Giger W,Schaffner C.1994.Behaviour of alkylphenol polyethoxylate surfactants in the aquatic environment—II.Occurrence and transformation in rivers［J］.Water Research,28（5）:1143-1152

Alavi S M H,Cosson J,Kazemi R.2006.Semen characteristics inAcipenserpersicusinrelationtosequentialstripping［J］.Journal of Applied Ichthyology,22（Suppl.1）:400-405

Billard R.1978.Changes in structure and fertilizing ability of marineandfreshwaterfishspermatozoadilutedinmediaof various salinities［J］.Aquaculture,14（3）:187-198

Bjerselius R,Lundstedt-Enkel K,Olsén H,Mayer I,Dimberg K.2001.Male goldfish reproductive behaviour and physiology are severely affected by exogenous exposure to 17β-estradiol［J］.Aquatic Toxicology,53（2）:139-152

Brion F,Tyler C R,Palazzi X,Laillet B,Porcher J M,Garric J,FlammarionP.2004.Impactsof17β-estradiol,including environmentallyrelevantconcentrations,onreproductionafter exposure during embryo-larval-,juvenile-and adult-life stages in zebrafish（Danio rerio）［J］.Aquatic Toxicology,68（3）:193-217

Chikae M,Ikeda R,HasanQ,Morita Y,Tamyia E.2003.Effect of alkylphenols on adult male medaka:Plasma vitellogenin goesuptothelevelofestrousfemale［J］.Environmental Toxicology and Pharmacology,15（1）:33-36

Hara Y,Strüssmann C A,Hashimoto S.2007.Assessment of short-term exposure to nonylphenol in Japanese medaka using sperm velocity and frequency of motile sperm［J］.Archives of Environmental Contamination and Toxicology,53（3）:406-410

Hashimoto S,Watanabe E,Ikeda M,Terao Y,Strüssmann C A,Inoue M,Hara A.2009.Effects of ethinylestradiol on medaka（Oryzias latipes）as measured by sperm motility and fertilization success［J］.ArchivesofEnvironmentalContaminationand Toxicology,56（2）:253-259

Hinton D E,Baumann P C,Gardner G R,Hawkins WE,HendricksJD,MurchelanoRA,OkihiroMS.1992.Histopathological biomarkers［A］.//Huggett R J,Kimerle R A,MehrlePM,BergmanHL.Biomarkers,Biochemical,Physiological,andHistopathologicalMarkersofAnthropogenic Stress［C］.Boca Raton,FL:Lewis Publishers,155-209

Hoar W S,Randall D J,Donaldson E M.1978.Fish Physiology［M］.New York:Academic Press,31-53

HutchinsonTH,ShillabeerN,WinterM J,PickfordDB.2006.Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms:a critical review［J］.Aquatic Toxicology,76（1）:69-92

Jobling S,Sumpter J P,Sheahan D,Osborne J A,MatthiessenP.1996.Inhibitionoftesticulargrowthinrainbowtrout（Oncorhynchus mykiss）exposed to estrogenic alkylphenolic chemicals［J］.Environmental Toxicology and Chemistry,15（2）:194-202

Kawana R,Strüssmann C A,Hashimoto S.2003.Effect of pnonylphenolonspermmotilityinJapanesemedaka（Oryzias latipes）［J］.Fish Physiology and Biochemistry,28（1-4）:213-214

Kime D E,Ebrahimi M,Nysten K,Roelants I,Rurangwa E,Moore H D M,Ollevier F.1996.Use of computer assisted sperm analysis（CASA）for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish;application to effects of heavy metals［J］.Aquatic Toxicology,36（3-4）:223-237

Kime D E,Nash J P.1999.Gamete viability as an indicator of reproductive endocrine disruption in fish［J］.Science of the Total Environment,233（1-3）:123-129

KimeDE.1999.Astrategyforassessingtheeffectsof xenobioticsonfishreproduction［J］.ScienceoftheTotal Environment,255（1-2）:3-11

Kime D H.1998.Endocrine Disruption in Fish［M］.Norwell,USA:Kluwer Academic Publishers

Kinnberg K,Korsgaard B,BjerregaardP,Jespersen A.1999.Effects of nonylphenol and 17β-estradiol on vitellogenin synthesis and testis morphology in male platyfish Xiphophorus maculates［J］.Journal of Experimental Biology,203（Pt.2）:171-181

Kobayashi K,Tamotsu S,Yasuda K,Oishi T.2005.Vitellogeninimmunohistochemistry in the liver and the testis of the Medaka,Oryzias latipes,exposed to 17β-estradiol and p-nonylphenol［J］.Zoological Science,22（4）:453-461

Laale H W.1977.The biology and use of zebrafish,Brachydanio rerio,in fisheries research［J］.Journal of Fish Biology,10（2）:121-173

Larsen M G,Hansen K B,Henriksen P G,Baatrup E.2008.Malezebrafish（Daniorerio）courtshipbehaviourresiststhe feminizing effects of 17α-ethinyloestradiol—morphological sexual characteristics do not［J］.Aquatic Toxicology,87（4）:234-244

Liu J Y,Gan F,Wei Q W,Du H,Zhu Y J.2007.Effects of different concentration of irons and monosaccharides on sperm motilityofChineseSturgeon（AcipenserSinensis）［J］.Acta Hydrobiologica Sinica,31（6）:849-854（in Chinese）

McAllisterBG,KimeDE.2003.Earlylifeexposureto environmental levels of the aromatase inhibitor tributyltin causes masculinisationandirreversiblespermdamageinzebrafish（Danio rerio）［J］.Aquatic Toxicology,65（3）:309-316

Nice H E.2005.Sperm motility in the Pacific oyster（Crassostrea gigas）is affected by nonylphenol［J］.Marine Pollution Bulletin,50（12）:1668-1674

Rurangwa E,Biegniewska A,Slominska E,Skorkowski E F,Ollevier F.2002.Effect of tributyltin on adenylate content and enzyme activities of teleost sperm:a biochemical approach to study the mechanisms of toxicant reduced spermatozoa motility［J］.Comparative Biochemistry and Physiology-Part C:Toxicology&Pharmacology,131（3）:335-344

Schwaiger J,Mallow U,Ferling H,Knoerr S,Braunbeck T H,Kalbfus W,Negele R D.2002.How estrogenic is nonylphenol？Atransgenerationalstudyusingrainbowtrout（Oncorhynchus mykiss）as a test organism［J］.Aquatic Toxicology,59（3-4）:177-189

Singh P B,Sahu V,Singh V,Nigam S K,Singh H K.2008.Spermmotilityinthefishesofpesticideexposedandfrom polluted rivers of Gomti and Ganga of north India［J］.Food and Chemical Toxicology,46（12）:3764-3769

Toft G,Baatrup E.2001.Sexual characteristics are altered by 4-tert-octylphenoland17β-estradiolintheadultmaleguppy（Poecilia reticulata）［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety,48（1）:76-84

Vladi? T,J?rvi T.1997.Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout-the effect of water temperature［J］.Journal of Fish Biology,50（5）:1088-1093

Welshons W V,Thayer K A,Judy B M,Taylor J A,Curran E M,vom Saal F S.2003.Large effects from small exposures I.Mechanismsforendocrine-disruptingchemicalswithestrogenic Activity［J］.Environmental Health Perspectives,111（8）:994-1006

WesterfieldM.1995.TheZebrafishBook:AGuideforthe Laboratory Use of Zebrafish（Danio rerio）［M］.Eugene:University of Oregon Press,9-25

中文參考文獻(xiàn)

劉鑒毅,甘芳,危起偉,杜浩,朱永久.2007.幾種不同濃度的離子及單糖對(duì)中華鱘精子活力的影響［J］.水生生物學(xué)報(bào),31（6）:849-854◆

Effects of Long-Term Exposure to Nonylphenol on Secondary Sexual Characteristics and Sperm Motility of Male Zebrafish（Brachydanio rerio）

XIA Ji-gang，NIU Cui-juan*，GAO Ying，PEI Xue-jiao

Ministry of Education Key Laboratory for Biodiversity Science and Ecological Engineering,College of Life Sciences,Beijing Normal University,Beijing 100875

The present work examined the effects of long-term exposed to different nonylphenol（NP）concentrations（0（control）,0.1,1,10,100μg·L-1）on secondary sexual characteristics and sperm motility of male zebrafish（Brachydanio rerio）.Results showed that male secondary sexual characteristics were significantly affected by NP exposure,showing visible urogenital papillae and bulgy abdomen,which belong to the female.76.9%males were feminised with development of urogenital papillae at 100μg·L-1NP.Sperm activation rate showed a negative correlation with NP concentration.NP exposure also showed marked influence on acute movement time and longevity of the zebrafish sperm.Both the above two parameters were clearly shorter at low-dose（0.1μg·L-1）and high-dose（100μg·L-1）treatment comparing with the control.However,it was similar with the control at medium-dose（10μg·L-1）.The results suggested that the secondary sexual characteristics and sperm motility of male zebrafish might be used as the sensitive indexes of aquatic environmental endocrine disrupting chemicals.

nonylphenol；secondary sexual characteristics；sperm motility；zebrafish

20 April 2009accepted2 June 2009

1673-5897（2010）1-044-06

X171.5

A

2009-04-20錄用日期：2009-06-02

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（No.40632009）

夏繼剛（1980—），男，博士；*通訊作者（Corresponding author），E-mail:cjniu@bnu.edu.cn

牛翠娟（1965—），女，1992年獲日本北海道大學(xué)博士學(xué)位，2000年起擔(dān)任北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師.2004年至2005年加拿大University of British Columbia訪問學(xué)者.長(zhǎng)期從事水生生物生理生態(tài)與生態(tài)毒理學(xué)研究.主持或參加國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目，國(guó)家重大基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（973）等20余項(xiàng)，發(fā)表論文近百篇.