超聲波技術在波紋巴非蛤酶解反應中的應用

陳純馨，孫恢禮，吳嘉輝，陳 忻，陳智剛，陳曉剛

(1.佛山科學技術學院理學院，廣東 佛山 528000；2.中國科學院南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；3.安安美容保健品有限公司，廣東 佛山 528000)

超聲波技術在波紋巴非蛤酶解反應中的應用

陳純馨1，孫恢禮2，吳嘉輝1，陳 忻1，陳智剛3，陳曉剛1

(1.佛山科學技術學院理學院，廣東 佛山 528000；2.中國科學院南海海洋研究所，廣東 廣州 510301；3.安安美容保健品有限公司，廣東 佛山 528000)

將超聲波技術應用到波紋巴非蛤制備的酶解反應中，在單因素試驗的基礎上采用響應面分析法對試驗條件進行優(yōu)化。運用Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理，選擇對短肽產(chǎn)率顯著影響的4個因素：輻照時間、輻照溫度、超聲功率和固液比，進行四因素五水平的響應面分析試驗，確定在超聲波條件下波紋巴非蛤的酶解反應最佳工藝條件為輻照時間4h、輻照溫度55℃、超聲功率140W、固液比1:2(g/mL)。對模型預測結(jié)果進行驗證，得到短肽產(chǎn)率為樣品的5.15%，是無超聲波作用下的短肽產(chǎn)率的1.1倍。

超聲波技術；波紋巴非蛤；酶解；優(yōu)化；響應面分析法

各國科學家預言，21世紀將是海洋世紀，人類將進入大規(guī)模開發(fā)海洋的時代。海洋是地球上資源最豐富的領域，海洋生物活性物質(zhì)中肽類是數(shù)量最龐大的一類化合物，達數(shù)萬種之多，包括海洋肽類毒素與海洋生物活性肽等。現(xiàn)已證明，很多海洋肽類具有抗氧化衰老、抗腫瘤、抗艾滋病、抗真菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等生理活性[1]。我國有豐富的海洋蛋白質(zhì)資源，長期以來，大部分低值海產(chǎn)品(如貝殼類、小魚蝦類等)只是用于簡單加工成為飼料，由于加工技術不夠先進，產(chǎn)品使用價值不高，并造成大量營養(yǎng)成分流失，資源浪費嚴重，若采用生物技術進行蛋白質(zhì)的深加工，將有較高的社會效益和經(jīng)濟效益。

波紋巴非蛤(Paphia undulata)是重要的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類，屬于瓣鰓綱、簾蛤科、巴非蛤?qū)伲追Q“花甲”、“油蛤”。其肉味鮮美，營養(yǎng)豐富。陳忻等[2]研究結(jié)果顯示，以木瓜蛋白酶酶解波紋巴非蛤可制備具有較強生物活性的短肽。

超聲波是頻率高于20000Hz的聲振動。研究發(fā)現(xiàn)，它傳播直進性好，方向性強。超聲波作用的原理很復雜，一個普遍接受的觀點是：空化現(xiàn)象(cavitation)可能是化學效應的關鍵，即在液體介質(zhì)中微泡的形成和破裂及伴隨能量的釋放?？栈F(xiàn)象所產(chǎn)生的瞬間內(nèi)爆的強烈振動波，產(chǎn)生短暫的高能環(huán)境，這些能量可用來打開化學鍵，促使反應的進行[3-5]。輻照技術是近年來發(fā)展很快的一種非熱力加工新技術，利用電離輻射與物質(zhì)的相互作用所產(chǎn)生的物理、化學和生物效應，對物質(zhì)或食品進行加工處理，實現(xiàn)射線對食品分子的修飾以及降解食品中的有害物質(zhì)的新型食品加工技術[6]。于玲等[7]證明10kGy電子束輻照對蝦仁pH值、酸價、過氧化值、灰分等理化指標和蛋白質(zhì)、17種氨基酸、粗脂肪、微量元素等營養(yǎng)成分以及重金屬元素、感官指標均無影響。

國內(nèi)對波紋巴非蛤的酶解反應有不少的研究，但都局限于傳統(tǒng)的振蕩或攪拌方法進行酶解實驗。本實驗把超聲波技術應用到波紋巴非蛤的酶解反應中，并在單因素試驗的基礎上采用響應面分析法對試驗條件進行優(yōu)化，為在超聲波輔助下酶解波紋巴非蛤條件的選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

波紋巴非蛤，購于佛山山紫市場，由中國科學院南海海洋研究所孫恢禮研究員鑒定；木瓜蛋白酶(60萬U/g，食品級) 廣西南寧龐博生物工程有限公司；硫酸鉀(分析純) 天津市津沽工商實業(yè)公司；甲基紅(分析純) 北京化工廠；濃硫酸(化學純) 廣州東紅化工廠。

SHZ-82A型恒溫振蕩器 金壇市富華儀器有限公司；pHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠；85-2控溫磁力攪拌器 江蘇醫(yī)療儀器廠；KQ-200DB數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器公司。

1.2 酶解制備方法[2]

工藝流程：原料波紋巴非蛤→預處理→加水勻漿→調(diào)節(jié)pH值→保溫酶解→滅酶→冷卻→離心→加入鉬酸鈉和硫酸后過濾→波紋巴非蛤酶解清液

在該工藝流程基礎上，采用超聲波輔助方法進行酶解，并對工藝進行優(yōu)化。

1.2.1 原材料處理

將新鮮波紋巴非蛤泡于水中吐沙一定時間，去殼摘除內(nèi)臟，清洗，瀝水，絞碎后脫脂再分裝成若干份實驗用樣品，每份樣品10g，于－10℃下冷凍貯藏。

1.2.2 蛤肉酶解前的預處理

從冰箱中取出10g冷藏蛤肉若干份，加入一定比例的水勻漿，調(diào)節(jié)適宜pH值，于恒溫水浴鍋中加熱至預設定的酶解溫度。

1.2.3 超聲波輔助實驗方法

取等量的波紋巴非蛤，固定初始pH值為6.5，加酶量為原料波紋巴非蛤質(zhì)量的1.5%(下同)，以輻照時間、輻照溫度、超聲功率和固液比為變量，分別用超聲波輔助進行酶解實驗。

1.2.4 隆丁區(qū)分法提取短肽

采用蛋白質(zhì)隆丁區(qū)分方法(Lundin fraction)分離提取小分子肽[8]。

1.3 測定方法

酶解液中蛋白質(zhì)的測定采用半微量凱氏定氮法[9-10]，酶解清液中游離氨基酸的測定采用甲醛滴定法[11]，小分子肽的測定方法參考文獻[12-13]的方法，測得酶解液中小分子肽平均相對分子質(zhì)量為683.9。

1.4 響應面試驗設計[14-15]

應用響應面分析方法，以Y為響應值(短肽產(chǎn)率)，優(yōu)化波紋巴非蛤酶解反應中的4個因素：A(輻照時間)、B(輻照溫度)、C(超聲功率)和D(固液比)。實驗水平參數(shù)的設置參考單因素試驗結(jié)果。結(jié)果按照最小二乘法進行多元回歸，回歸所用的二次數(shù)學模型為：

式中：X1、X2、X3、X3分別對應A、B、C、D四個因素；Y為短肽產(chǎn)率/%；b0、bi、bii和bij分別為模型的常數(shù)項、一次項、二次項和交互項回歸系數(shù)。數(shù)據(jù)由Design-expert 7.1.3軟件(英國Statease公司)進行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 輻照時間對短肽產(chǎn)率的影響

取等量的波紋巴非蛤，按固液比1:3(g/mL)加入去離子水，分別用超聲波輔助，按2、3、4、5、6h的輻照時間進行酶解實驗。其他各參數(shù)分別為超聲功率200W、溫度55℃、pH6.5、加酶量1.5%，離心后取上清液進行分析，結(jié)果見圖1。

圖1 輻照時間對短肽產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment time on short-chain peptide yield

由圖1可知，當輻照時間在2～4h之間，短肽產(chǎn)率隨著輻照時間的增加而提高，而在3～4h范圍內(nèi)，短肽產(chǎn)率的變化不明顯；當在4～5h之間，隨著輻照時間增加，短肽產(chǎn)率反而減少。這是因為在處理時間較短的情況下，樣品受超聲波產(chǎn)生的空化作用隨時間延長而加強，這種作用不僅起到擊破波紋巴非蛤組織細胞使蛋白質(zhì)游離出來，而且能使蛋白質(zhì)空間結(jié)構發(fā)生變化，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性部位暴露出來，更好地與酶作用，從而提高了短肽產(chǎn)率。但處理時間過長，有可能破壞樣品蛋白質(zhì)的結(jié)構，反而降低肽的產(chǎn)率，因此，輻照時間應控制在3～4h之間為宜。

2.1.2 輻照溫度對短肽產(chǎn)率的影響

取等量的波紋巴非蛤，按固液比1:3(g/mL)加入去離子水，分別用超聲波輔助，按30、40、50、60、70℃的輻照時間進行酶解實驗。其他各參數(shù)分別為超聲功率200W、時間4h、pH6.5、加酶量1.5%，離心后取上清液進行分析，結(jié)果見圖2。

圖2 輻照溫度對短肽產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis temperature on short-chain peptide yield

由圖2可知，當輻照溫度在30～40℃之間，提高輻照溫度，短肽產(chǎn)率緩慢升高；當溫度在40～50℃時，隨著輻照溫度提高，短肽產(chǎn)率明顯增加；但當輻照溫度在60～70℃范圍時，短肽產(chǎn)率隨輻照溫度的提高反而降低；原因是超聲波作為一種能量形式，具有加熱作用和空化作用。對酶反應可產(chǎn)生促進或抑制雙重作用。當溫度較低時，與空化作用相比。加熱作用占主導，超聲場下的反應體系吸收超聲波能量，從而加速了酶促水解反應，表現(xiàn)為促進作用，短肽產(chǎn)率也在一定條件下提高。隨著溫度的升高，空化作用顯現(xiàn)，所產(chǎn)生的自由基進入酶活性中心，破壞酶分子構象。因此，當水浴溫度進一步升高時，一方面酶蛋白熱變性，另一方而可能是波紋巴非蛤的蛋白質(zhì)活性部分被破壞了，導致短肽產(chǎn)率快速下降。因此合適的輻照溫度在50～60℃之間。

2.1.3 超聲功率對短肽產(chǎn)率的影響

取等量的波紋巴非蛤，按固液比1:3(g/mL)加入去離子水，分別用超聲波輔助，按120、140、160、180、200W的超聲功率進行酶解實驗。其他各參數(shù)分別為時間4h、pH6.5、加酶量1.5%，離心后取上清液進行分析，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲功率對短肽產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on short-chain peptide yield

由圖3可知，超聲功率在120～140W之間，隨著超聲功率的提高，短肽產(chǎn)率逐漸增加；但當超聲功率在160～200W范圍內(nèi)，短肽產(chǎn)率顯著降低，說明超聲功率過高時不利于反應的進行；這是因為超聲波是一種縱波。波紋巴非蛤蛋白在適當功率的超聲波作用下，其空間結(jié)構會發(fā)生變化，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性部位能夠暴露出來，更好地與酶作用；同時超聲波產(chǎn)生的空化作用還可以改變酶的分子構象，增大酶的活性，加速反應過程中底物與酶接觸。超聲波的振蕩作用還可以使酶與底物碰撞的幾率增多，促進二者的結(jié)合，從而提高短肽產(chǎn)率。但當超聲波功率過大時，蛋白質(zhì)的活性部位和蛋白酶的分子構象會逐漸被破壞，導致短肽產(chǎn)率下降。因此超聲功率在120～160W之間能得到較大的短肽產(chǎn)率。

2.1.4 固液比對短肽產(chǎn)率的影響

取等量的波紋巴非蛤，按固液比分別為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5(g/mL)加入去離子水，分別用超聲波輔助進行酶解實驗，其他各參數(shù)分別為超聲功率200W、溫度55℃、pH6.5、加酶量1.5%的酶解條件進行，離心后取上清液進行分析，結(jié)果見圖4。

圖4 固液比對短肽產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of solid/liquid ratio on short-chain peptide yield

由圖4可知，當固液比在1:1～1:2(g/mL)范圍內(nèi)，短肽產(chǎn)率隨著液體量的增大而顯著增大；但當固液比在1:3～1:5(g/mL)之間，隨著固液比增大，短肽產(chǎn)率反而下降。隨著液體量的增加，反應體系中水的含量增大，水既作為反應物起作用，又能使含量高的波紋巴非蛤蛋白質(zhì)分子得到充分分散，既有利于超聲波的作用，又擴大了酶與底物的接觸面積，從而提高短肽產(chǎn)率；但隨著液體量的增大，體系中的水分含量過高，使酶的濃度大大下降，導致水解度降低。因此初始固液比為1:2(g/mL)時得到較高的短肽產(chǎn)率。

2.2 響應面優(yōu)化波紋巴非蛤酶解反應條件

2.2.1 中心組合試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗所得結(jié)果，選取輻照時間、輻照溫度、超聲功率和固液比4個因素作中心組合，短肽產(chǎn)率為檢驗標準作響應面分析，以探討最佳配方組成，響應面試驗因素水平見表1，結(jié)果如表2所示。

表1 響應面分析試驗因素及水平Table 1 Variables and levels in the response surface design

表2 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果Table 2 Box-Benheken experimental design arrangement and experimental results

2.2.2 各因素對短肽產(chǎn)率的影響

2.2.2.1 數(shù)學模型

根據(jù)試驗結(jié)果建立數(shù)學模型：

式中：Y為短肽產(chǎn)率/%；A為輻照時間/h；B為輻照溫度/℃；C為超聲功率/W；D為固液比(g/mL)。

2.2.2.2 模型的可信度分析的統(tǒng)計檢驗結(jié)果

從圖5可以看到，該模型的預測值與實際值基本在一直線上，這表明用該模型中的函數(shù)數(shù)值來逼近原始數(shù)據(jù)值，在均方誤差最小的準則下，數(shù)據(jù)擬合程度很好，因而模型的可信度較高。

表3 模型的可信度分析的統(tǒng)計檢驗結(jié)果Table 3 Statistical test for credibility of the developed regression model

由表3可知，該模型的R2=0.9773，R2Adj=0.9547，說明方程的因變量與全體自變量之間的回歸效果非常顯著，預測擬合度=0.869在合理的范圍之內(nèi)，信噪比=24.87119＞4表明該模型有足夠的信噪比，可用于實驗分析。

2.2.3 回歸模型的方差分析

對此模型進行方差分析，結(jié)果如表4所示。在α=0.01水平時，模型回歸極顯著(P＜0.0001)，且B、C、D、B2、C2為顯著性影響因素，固液比(D)、輻照溫度(B)和超聲功率(C)在實驗過程中起主要作用，而輻照時間(A)相對作用較小。對短肽產(chǎn)率的影響：固液比＞輻照溫度＞超聲功率＞輻照時間。從表4方差分析中得出回歸方程的一次項、二次項較為顯著，各因素之間交互作用影響和失擬項影響不顯著，說明各因素對響應值的影響不是簡單的一次線性關系，而是二次拋物面的關系。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression model

2.2.4 響應面及等高線分析

根據(jù)方程作響應面及等高線(圖6～11)，通過該組動態(tài)圖可評價各因素之間對短肽產(chǎn)率的影響作用，同時可確定各因素的最佳水平及組合。

圖6(a)為超聲功率140W，固液比1:2.5(g/mL)時，輻照時間和輻照溫度交互作用對短肽產(chǎn)率的影響。當輻照時間在3～4h范圍時，短肽產(chǎn)率隨體系溫度的增加呈現(xiàn)明顯先上升后下降的趨勢；當輻照溫度在50～60℃范圍時，短肽產(chǎn)率隨反應時間的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢。圖6(b)為輻照溫度55℃，固液比1:2.5(g/mL)時，輻照時間和超聲功率交互作用對短肽產(chǎn)率的影響。當輻照時間在3～4h范圍時，短肽產(chǎn)率隨超聲功率的提高，呈現(xiàn)先升后降的趨勢；當超聲功率在120～160W的范圍時，短肽產(chǎn)率隨輻照時間的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且當超聲功率接近140W時，對短肽產(chǎn)率的影響最為顯著。圖6(c)為輻照溫度55℃，超聲功率140W時，輻照時間和固液比交互作用對短肽產(chǎn)率的影響。當輻照時間在3～4h時，短肽產(chǎn)率隨固液比的減少呈現(xiàn)上升的趨勢。圖6(d)為輻照時間3.5h，固液比1:2.5(g/mL)時，輻照溫度和超聲功率交互作用對短肽產(chǎn)率的影響。當輻照溫度在50～60℃范圍時，短肽產(chǎn)率隨超聲功率的增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢；當超聲功率在120～160W的范圍時，短肽產(chǎn)率隨輻照溫度的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在接近120W時，輻照溫度對短肽產(chǎn)率的影響比接近160W時的影響要顯著。圖6(e)為輻照時間3.5h，超聲功率140W時，輻照溫度和固液比交互作用對短肽產(chǎn)率的影響。當輻照溫度在50～60℃范圍時，短肽產(chǎn)率隨固液比的減少而上升；當固液比在1:2～1:3(g/mL)時，短肽產(chǎn)率隨輻照溫度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。圖6(f)為輻照時間3.5h，輻照溫度55℃時，超聲功率和固液比交互作用對短肽產(chǎn)率的影響。當超聲功率在120～160W的范圍時，短肽產(chǎn)率隨固液比的減少而上升；當固液比在1:2～1:3(g/mL)時，短肽產(chǎn)率隨超聲功率的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

圖6 各因素對短肽產(chǎn)率的響應面圖及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots revealing the interactive effects of any two factors on short-chain peptide yield

2.2.5 配方的優(yōu)化組合及驗證

設定4因素的取值范圍：輻照時間3～4h、輻照溫度50～60℃、超聲功率120～160W、液固比1:2～1:3(g/mL)，并將短肽產(chǎn)率設定為最大值，軟件給出的最優(yōu)配方為輻照時間4h、輻照溫度55.65℃、超聲功率141.11W、固液比1:2(g/mL)，其理論短肽產(chǎn)率為樣品的5.16%，考慮到實際操作的可行性及簡化工藝，將酶解反應配方修正為輻照時間4h、輻照溫度55℃、超聲功率140W、固液比1:2(g/mL)，根據(jù)修正后的最優(yōu)配方進行實驗驗證，其短肽產(chǎn)率為樣品的5.15%，說明該模型與實驗值擬合較好。

2.3 有超聲波作用和無超聲波作用的短肽產(chǎn)率比較

前期的實驗研究結(jié)果，在無超聲波作用的短肽產(chǎn)率為樣品的4.67%[14]，而本實驗在超聲波作用下得到的短肽產(chǎn)率是樣品的5.15%，是無超聲波作用的短肽產(chǎn)率的1.1倍。

3 結(jié) 論

研究超聲波技術在波紋巴非蛤酶解反應中的應用，并在單因素試驗基礎上，運用響應面分析法研究輻照時間，輻照溫度，超聲功率和固液比對短肽產(chǎn)率的影響。通過單因素試驗得出超聲波作用下波紋巴非蛤酶解反應中4因素的合適范圍：輻照時間3～4h、輻照溫度50～60℃、超聲功率120～160W、固液比1:2(g/mL)。通過響應面分析表明，在各影響因素中固液比、輻照溫度、超聲功率起主要作用，而輻照時間在3～4h的范圍內(nèi)相對作用較小，4因素對短肽產(chǎn)率的影響作用是：固液比＞輻照溫度＞超聲功率＞輻照時間。通過采用響應面設計優(yōu)化超聲波作用下的波紋巴非蛤酶解反應條件，得出最優(yōu)條件為：輻照時間4h、輻照溫度55.65℃、超聲功率141.11W、固液比為1:2(g/mL)，其理論短肽產(chǎn)率為5.16%。實驗驗證反應條件為輻照時間4h、輻照溫度55℃、超聲功率140W、固液比為1:2(g/mL)，根據(jù)修正后的最優(yōu)配方進行實驗驗證，其短肽產(chǎn)率為5.15%，與理論的較優(yōu)條件基本一致。在超聲波作用下的短肽產(chǎn)率是無超聲波作用的短肽產(chǎn)率的1.1倍，因此，超聲波在一定條件促進了波紋巴非蛤酶解反應。

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Application of Ultrasonic Technology to the Enzymatic Hydrolysis ofPaphia undulataMuscle

CHEN Chun-xin1，SUN Hui-li2，WU Jia-hui1，CHEN Xin1，CHEN Zhi-gang3，CHEN Xiao-gang1
(1. School of Science, Foshan University, Foshan 528000, China；
2. South China Sea Institute of Oceanology, China Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China；3. Anan Beauty and Health Products Co. Ltd., Foshan 528000, China)

The present study was aimed at optimizing the ultrasonic-assisted enzymatic hydrolysis ofPaphia undulatamuscle for producing short-chain peptides using response surface analysis based on a series of single-factor investigations. By means of the principles of Box-Benheken central composite experimental design, a four-variable, five-level response surface analysis was designed to discuss the effects of ultrasonic treatment time and power, hydrolysis temperature and solid/liquid ratio on shortchain peptide production. The optimal levels of these four process conditions were determined as follows: ultrasonic treatment time, 4 h; hydrolysis temperature, 55 ℃; ultrasonic power, 140 W; and solid/liquid ratio, 1:2 (g/mL). The experimental value of peptide yield was 5.15%, 1.1-fold higher than that obtained without ultrasonic assistance.

ultrasonic technology；Paphia undulata；enzymolysis；optimization；response surface methodology

TS254.2；TS201.2

A

1002-6630(2010)20-0152-07

2010-06-25

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2008BAD94B08)；中國科學院知識創(chuàng)新工程重要方向項目(KZCX2-YW-209)；廣東省2009院省合作項目(00617381220824077)

陳純馨(1957—)，女，副教授，主要從事有機化學研究。E-mail：chchx163@163.com