楊 陽(yáng),金振曉,段維勛,畢生輝,楊建寶,盧佳佳,易定華

Notch信號(hào)是一條進(jìn)化中高度保守的反映細(xì)胞間通訊機(jī)制的通路,它對(duì)于許多器官發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞命運(yùn)的決定起著重要的作用,經(jīng)典的例子包括果蠅外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生、線(xiàn)蟲(chóng)的外陰發(fā)育和哺乳動(dòng)物的淋巴系統(tǒng)發(fā)育[1-2]。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示Notch信號(hào)途徑在成體心肌損傷保護(hù)中發(fā)揮作用[3]。本研究中,我們將檢測(cè)體外循環(huán)心臟手術(shù)過(guò)程中,心肌組織中 Notch信號(hào)途徑相關(guān)受體 Notch1胞內(nèi)區(qū)(NICD)和下游分子 Hes1的表達(dá)變化,尋找Notch信號(hào)途徑在人心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮作用的直接證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 2010年3月,20例在第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科接受體外循環(huán)心臟手術(shù)的患者納入本研究,所有患者術(shù)前未合并其它系統(tǒng)性疾病,術(shù)前 2周內(nèi)未服用激素類(lèi)藥物。其中男 10例,女 10例;年齡 3～64(26.5+19.2)歲,包括法洛四聯(lián)癥 4例,右室雙出口 3例,室間隔缺損 6例,房間隔缺損 1例,二尖瓣、主動(dòng)脈瓣雙瓣置換 3例,主動(dòng)脈瓣置換 1例,二尖瓣置換 2例。

1.2 右心房心肌組織獲取方法 所有患者采用芬太尼和七氟烷復(fù)合麻醉,手術(shù)均經(jīng)胸骨正中徑路,常規(guī)建立體外循環(huán),中度血液稀釋(Hct 0.20～0.25),中度低溫 28～32℃,升主動(dòng)脈阻閉后,間斷順行灌注冷血停搏液維持術(shù)中心臟停搏,平均體外循環(huán)時(shí)間(80.9±32.5)min,平均主動(dòng)脈阻斷時(shí)間(42.6±25.2)min。體外循環(huán)開(kāi)始前及心臟復(fù)跳后15min從右房切開(kāi)位置獲取右心房心肌樣本,并立即放入不含核糖核酸酶的塑料容器內(nèi),液氮儲(chǔ)存,待檢測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器 β-actin兔抗人多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司,北京),兔抗人 Notch1單克隆抗體(Abcom公司,美國(guó)),兔抗人 Hes1抗體(Santa Cruz公司,美國(guó)),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,北京),BCA-100蛋白質(zhì)定量測(cè)定試劑盒(Pierce公司,美國(guó)),組織裂解蛋白提取液(碧云天生物技術(shù)研究所,上海),蛋白酶抑制劑(Sigma公司,美國(guó)),預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì) Marker(Fermentas公司,美國(guó));電泳及濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移槽(Bio-Rad公司,美國(guó)),Western發(fā)光照相系統(tǒng)(UVP公司,美國(guó))。

1.4 Western blotting分析方法 將留取的心肌組織在裂解緩沖液中進(jìn)行研磨裂解 30min。12 000 r/min離心 15 min收集組織裂解物,蛋白濃度用 BCA法進(jìn)行測(cè)定。20μg總蛋白在 1×SDS緩沖液中煮 7 min,10%SDS-PAGE電泳,通過(guò)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。硝酸纖維素膜用含 5%脫脂奶粉的TBS-T于室溫封閉 1 h,然后分別加 Notch1、Hes1和 β-actin抗體于含 1%脫脂奶粉的 TBS-T進(jìn)行稀釋,接著加連接辣根過(guò)氧化物酶的二抗,用 ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影,最后用 UVP照相系統(tǒng)進(jìn)行照相和并用其附帶軟件蛋白進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,所有數(shù)據(jù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,計(jì)量資料采用配對(duì) t檢驗(yàn),P＜0.05有顯著性差異。

2 結(jié) 果

Western blotting檢測(cè) NICD和 Hes1基因的表達(dá)缺血再灌注后 20例患者心肌 NICD表達(dá)明顯減弱,缺血再灌注前后 NICD的 western blotting信號(hào)強(qiáng)度與 β-actin信號(hào)強(qiáng)度比值分別為:(4.28±0.45)和(1.55±0.36),P＜0.01,見(jiàn)圖1;缺血再灌注后19例患者心肌 Hes1表達(dá)減弱,1例患者 Hes1表達(dá)升高,但全組患者 Hes1表達(dá)顯著下降,Hes1信號(hào)強(qiáng)度與 β-actin信號(hào)強(qiáng)度比值分別為:(4.61±0.52)和(1.31±0.32),P＜0.01,見(jiàn)圖2。

圖1 缺血再灌注前后人心房肌組織中 NICD的表達(dá)

圖2 缺血再灌注前后人心房肌組織中 Hes1的表達(dá)

3 討 論

目前對(duì)抗缺血再灌注方法主要有內(nèi)源性(如缺血預(yù)處理等)和外源性(如藥物預(yù)處理等)兩種,這些方法都被證明是確實(shí)有效的。但是由于臨床患者特殊性(如安全性、倫理),這些心肌保護(hù)方法難以很好的在臨床應(yīng)用,因此眾多學(xué)者通過(guò)研究缺血再灌注的具體機(jī)制,嘗試找到心肌保護(hù)信號(hào)通路中的關(guān)鍵靶點(diǎn)并研究出作用靶點(diǎn)的方法,從而達(dá)到不影響患者健康的情況下保護(hù)心肌的目的。

研究證明,Notch信號(hào)通路在心血管系統(tǒng)的發(fā)生、發(fā)育、病理和生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。Gude等[3]的研究提示 Notch信號(hào)通路可能在心肌缺血損傷及心肌保護(hù)中發(fā)揮調(diào)控作用。Notch信號(hào)通路和 PI3K/Akt、NF-κB等信號(hào)通路通過(guò)復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)互相影響[5-7],而 PI3K/Akt、NF-κB等信號(hào)通路是心肌缺血再灌注過(guò)程中已知的具有保護(hù)作用的重要效應(yīng)因子[8-11],這提示 Notch信號(hào)通路可能通過(guò)這種多信號(hào)通路級(jí)聯(lián)效應(yīng)調(diào)控心肌缺血再灌注過(guò)程,但 Notch信號(hào)通路在人心肌缺血再灌注過(guò)程中的變化尚無(wú)相關(guān)研究。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè) Notch信號(hào)途徑相關(guān)受體 Notch1胞內(nèi)區(qū)(NICD)和下游分子 Hes1在圍體外循環(huán)期的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)人心肌組織缺血再灌注過(guò)程中 Notch途徑相關(guān)受體Notch1胞內(nèi)區(qū)和下游分子 Hes1表達(dá)均顯著下降,提示 Notch信號(hào)途徑可能在人心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮調(diào)控作用。一般意義的心肌保護(hù)多指心室肌,特別是左心室心肌的保護(hù),心房肌對(duì)缺血的耐受性和缺血后的反應(yīng)與心室肌有很大的差異,該研究限于條件選用心房肌標(biāo)本,因此結(jié)果的代表性和臨床意義就受到局限,下一步我們將先在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中重復(fù)相關(guān)檢測(cè),進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)論。

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