冀鵬 王志娟 郭翠 王鳳陽

1河北師范大學(xué)體育學(xué)院（石家莊 050016） 2邯鄲職業(yè)技術(shù)學(xué)院體育系（邯鄲 056001）

3中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心（石家莊 050021）

4河北女子職業(yè)技術(shù)學(xué)院（石家莊 050093）

惡性腫瘤是威脅人類生命和健康的主要疾病之一。我們前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]研究表明，聯(lián)合使用維生素C、E和適量運(yùn)動(dòng)可以延長荷瘤小鼠的生存期，這可能與提高自身免疫細(xì)胞因子IL-2和TNF-α水平有關(guān)，并且提示在三者聯(lián)合抗腫瘤的作用中，適量運(yùn)動(dòng)的作用相對(duì)更重要。但由于動(dòng)物的數(shù)量限制，需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究即是在得到最佳配方[中等運(yùn)動(dòng)量運(yùn)動(dòng)+VC（500mg/kg/d）+VE（50mg/kg/d）]的基礎(chǔ)上進(jìn)行追加實(shí)驗(yàn)，觀察三者的聯(lián)合作用對(duì)腫瘤小鼠生存期及免疫器官和腫瘤的影響，驗(yàn)證最佳配方的可信度及可能原因。

1 材料與方法

1.1 材料

瘤株S180由河北醫(yī)科大學(xué)第四腫瘤醫(yī)院科研所提供。

抗壞血酸（VC），天津市標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司，分析純，含量不少于99.7%；VE國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，含量97.0～102.0%。

雌性 Balb/c小鼠 64只，鼠齡 13周，體重 20±2g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，合格證編號(hào):701109，許可證號(hào):SCXK（冀）2003-1-003。清潔級(jí)，分籠飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤細(xì)胞制備及模型建立[2]

腫瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備:取-150℃超低溫冰箱保存的S180細(xì)胞復(fù)蘇，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞濃度為5～6×105個(gè)/ml，小鼠下腹部碘伏消毒后，腹腔注射0.5ml細(xì)胞懸液，7天后脫臼處死，取腹水，用生理鹽水稀釋，將培養(yǎng)好的腹水瘤細(xì)胞S180用生理鹽水1500r/min離心5min洗2次，用生理鹽水稀釋10倍取0.1ml，光學(xué)顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，準(zhǔn)備批量接種于Balb/c小鼠。

實(shí)體瘤小鼠的制備:右腋外側(cè)用碘伏消毒，用1ml注射器皮下接種，每只0.2ml腫瘤細(xì)胞稀釋液相當(dāng)于20萬單位腫瘤細(xì)胞。第7天，64只小鼠皮下均有實(shí)體瘤出現(xiàn)，直徑約0.5cm，接種成功率100%，實(shí)體瘤模型建立成功。

1.2.2 運(yùn)動(dòng)方案

無負(fù)重游泳，游泳容器為塑料桶，內(nèi)壁光滑，直徑40cm，高50cm，水深30cm，超過小鼠身長的2倍，水面直徑 35cm，水溫 31±1℃。中等運(yùn)動(dòng)量游泳時(shí)間[1，2]見表1。

表1 荷瘤小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間

1.2.3 分組

64只荷瘤小鼠隨機(jī)分為4組，每組16只:對(duì)照組（Ⅰ）:0.1ml生理鹽水+0.1ml花生油/d；VC+VE組（Ⅱ）:VC500mg/kg/d+VE50mg/kg/d；運(yùn)動(dòng)組（Ⅲ）:0.1ml生理鹽水+0.1ml花生油/d+中等運(yùn)動(dòng)量運(yùn)動(dòng)；最佳配方組（Ⅳ）:VC500mg/kg/d+VE50mg/kg/d+中等運(yùn)動(dòng)量運(yùn)動(dòng)。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)步驟

接種腫瘤細(xì)胞后第5天全部小鼠游泳30min，第6、7天僅令Ⅲ組和Ⅳ組小鼠繼續(xù)適應(yīng)游泳30min。第8天上午（8∶00～10∶00）各組經(jīng)口灌胃不同溶液，下午（3∶00～5∶00）運(yùn)動(dòng)。6天為一周期:5天給藥、運(yùn)動(dòng)，1天休息（休息時(shí)間不給藥也不運(yùn)動(dòng)）。持續(xù)7周，即干預(yù)至第49天停止，每組觀察8只小鼠生存期。在第43天每組隨機(jī)稱量8只小鼠體重，采用頸椎脫臼法處死小鼠，快速打開胸腔和腹腔，剝離腫瘤，用卡尺測量腫瘤最長徑、最寬徑，并取胸腺和脾臟等用電子天平稱重，按下列公式計(jì)算:瘤體比=瘤質(zhì)量/體質(zhì)量，腫瘤體積按公式:V=L×W×W/2（L為腫瘤最長徑，W為與L垂直的最寬徑），胸腺指數(shù)（mg/g）=1000×胸腺質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g），脾臟指數(shù)（mg/g）=1000×脾質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g），抑瘤率（%）=[（對(duì)照組平均腫瘤質(zhì)量（g）－各實(shí)驗(yàn)組平均腫瘤質(zhì)量（g）]/對(duì)照組平均腫瘤質(zhì)量（g）×100%，生命延長率 =（實(shí)驗(yàn)組平均生存期－對(duì)照組平均生存期）/對(duì)照組平均生存期×100%。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

各組數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，同一指標(biāo)不同組間進(jìn)行方差分析，P<0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)前后體重、瘤重、瘤體比、腫瘤體積和抑瘤率

實(shí)驗(yàn)前各組小鼠體重?zé)o顯著性差異，均在20g左右。第43天取材，測量結(jié)果表明Ⅰ組小鼠體重、瘤重、瘤體比和腫瘤體積最大，分別為 27.99±3.4g、10.21±3.53g、0.36±0.09 和 14.06±5.45cm3；其它各組體重、瘤重、瘤體比和腫瘤體積均低于Ⅰ組，順序?yàn)棰?Ⅱ>Ⅲ>Ⅳ，Ⅳ組平均體重、瘤重、瘤體比和腫瘤體積最小，分別為21.31±1.17g、3.20±1.20g、0.15±0.05 和 5.20±2.05cm3，與Ⅰ、Ⅱ組比較，具有極顯著性差異（P<0.01）。Ⅲ組體重、瘤重、瘤體比次之，與Ⅰ組比較有極顯著性差異（P<0.01），腫瘤體積與Ⅰ組比較具有顯著性差異（P<0.05）。抑瘤率排序?yàn)棰颍?1.1%）<Ⅲ（58.1%）<Ⅳ（68.7%），見表2。

表2 荷瘤小鼠體重、瘤重、瘤體比、腫瘤體積和抑瘤率的比較

2.2 免疫器官指數(shù)

Ⅳ組胸腺指數(shù)（1.51±0.43）最高，與Ⅰ組相比具有極顯著性差異（P<0.01），與Ⅱ組相比具有顯著性差異（P<0.05）；脾臟指數(shù)組間無顯著性差異（P>0.05），見表3。

表3 荷瘤小鼠胸腺和脾臟指數(shù)比較（mg/g）

2.3 荷瘤小鼠生存期

Ⅳ組生存期最長，為50.19±11.25天，與其它3組相比具有顯著性差異（P<0.05），荷瘤小鼠生命延長率排序?yàn)棰螅?.6%）<Ⅱ（5.9%）<Ⅳ（23.3%），見表4。

表4 荷瘤小鼠生存期和生命延長率比較

3 討論

恰當(dāng)?shù)捏w育鍛煉對(duì)于癌癥病人是最好的輔助治療之一。運(yùn)動(dòng)能即刻改善情緒，調(diào)節(jié)心理狀態(tài)，保持一定的運(yùn)動(dòng)能力和改善組織功能逐漸喪失的惡性循環(huán)。體育活動(dòng)還能刺激食欲，增進(jìn)身體功能，緩和臨床過程，維持生命質(zhì)量和延長壽命[3]。近年來的研究顯示，大劑量的VC在治療或作為輔助藥聯(lián)合其他抗癌藥物治療惡性腫瘤方面具有很大潛能，體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)它對(duì)多種腫瘤有明顯的抑制作用[4]。維生素E是具有廣泛生理功能的重要脂溶性維生素，除了促進(jìn)生殖及維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼肌和心血管系統(tǒng)的功能外，其對(duì)潛在的腫瘤預(yù)防和治療作用受到眾多學(xué)者的關(guān)注[5]，并且VE是維持人體和動(dòng)物健康所必需的營養(yǎng)維生素，是天然的抗氧化劑和免疫調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)細(xì)胞免疫和提高吞噬細(xì)胞的功能，飲食維生素E可增強(qiáng)和調(diào)節(jié)免疫功能，抑制營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致的胸腺萎縮[6]。為此，應(yīng)用三者聯(lián)合的最佳配方進(jìn)行追加實(shí)驗(yàn)具有驗(yàn)證性的實(shí)踐意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，荷瘤小鼠體重的增加主要是腫瘤組織的過度生長所致，腫瘤體積增大勢必影響小鼠的活動(dòng)能力和生存狀況，聯(lián)合補(bǔ)充維生素C（500mg/kg/d）、E（50mg/kg/d）并參加中等運(yùn)動(dòng)量的運(yùn)動(dòng)和三者聯(lián)合作用對(duì)延緩腫瘤生長的效果是遞進(jìn)式的，抑制腫瘤生長的作用逐漸加強(qiáng)，并且能夠延長荷瘤小鼠的生存期，增加其活動(dòng)的范圍和能力，提高生存質(zhì)量。這也說明運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)自身免疫需要一定時(shí)間和營養(yǎng)物質(zhì)作為基礎(chǔ)才能發(fā)揮抗腫瘤作用。

荷瘤小鼠的機(jī)體免疫功能會(huì)被全面調(diào)動(dòng)，機(jī)體的免疫系統(tǒng)對(duì)外來抗原物質(zhì)產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)。但是腫瘤的不斷生長能抑制機(jī)體多種免疫功能，腫瘤產(chǎn)生的某種活性因子可導(dǎo)致胸腺縮小[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Ⅳ組胸腺指數(shù)明顯高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組。胸腺是T淋巴細(xì)胞分化成熟的場所，T淋巴細(xì)胞又是重要的抗腫瘤效應(yīng)細(xì)胞，胸腺增生意味著維生素C、E和適量運(yùn)動(dòng)可以通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞分化成熟增強(qiáng)抗腫瘤效果，即可能是通過增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能激發(fā)免疫系統(tǒng)參與抗腫瘤作用。這與文獻(xiàn)[8]報(bào)道的抗癌藥物能提高荷瘤小鼠胸腺指數(shù)，同時(shí)提高細(xì)胞因子IL-2和TNF-α水平相近。Ⅲ組比Ⅱ組有增加趨勢，驗(yàn)證了文獻(xiàn)[1]中三者聯(lián)合抗腫瘤的作用中，適量運(yùn)動(dòng)的作用相對(duì)更重要。脾臟作為機(jī)體最大的免疫器官，脾指數(shù)組間無顯著差異，但有減小趨勢，推測可能與運(yùn)動(dòng)時(shí)大量血液流向骨骼肌，可能會(huì)影響腫瘤的血供，從而減弱脾臟的儲(chǔ)血能力有關(guān)。

4 小結(jié)

本研究驗(yàn)證了正交試驗(yàn)得出的最佳配方的客觀性，以及適量運(yùn)動(dòng)聯(lián)合補(bǔ)充維生素C、E可在一定程度上抑制腫瘤生長的作用，延長荷瘤小鼠生存期的研究結(jié)論。荷瘤小鼠胸腺指數(shù)顯著性變化及脾指數(shù)組間減小趨勢，提示延長荷瘤小鼠生存期的機(jī)理之一可能是通過增強(qiáng)機(jī)體自身免疫系統(tǒng)功能實(shí)現(xiàn)的。

[1]冀鵬，王鳳陽，賈強(qiáng)，等.維生素C、E與適量游泳對(duì)S180腫瘤模型小鼠生存期及血清TNF-α、IL-2的影響.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2008，2（27）:216-218.

[2]冀鵬.初探S180腫瘤小鼠游泳力竭時(shí)間及生存規(guī)律.邯鄲職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，2（21）:54-55.

[3]岳珍.運(yùn)動(dòng)預(yù)防癌癥研究進(jìn)展.中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，1996，15（2）:118-120.

[4]李媛，李晶晶，胡本容，等.維生素C治療腫瘤的研究進(jìn)展. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，4（25）:323-325.

[5]高寧，葉建鋒.維生素E的抗腫瘤作用.國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊，1999，1（26）:29-32.

[6]盧亞萍，杜杰.維生素E對(duì)動(dòng)物免疫的調(diào)控作用.飼料工業(yè)，2006，27（8）:59-61.

[7]卞紅磊.芝麻素對(duì)S180荷瘤小鼠免疫功能及對(duì)增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)的影響.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（18）:3411-3413.

[8]肖順漢，劉明華，鐘琳，等.克癌新對(duì)荷瘤小鼠IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α水平的影響.中藥藥理與臨床，2008，24（2）:82-84.