張煥容，楊發(fā)龍

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都 610041）

E型肝炎病毒（HepatitisEvirus，HEV）是世界范圍內(nèi)最常見的經(jīng)糞-口途徑感染的病毒之一。該病毒最早于1983年由MikhailS.Balayan分離鑒定[1]。1988年DanielW.Bradley及其同事描述了HEV的分子特征[2]。該病毒屬于肝炎病毒屬，無囊膜，二十面體，直徑約32~34nm。病毒基因組由單股正鏈RNA組成，長(zhǎng)約7200 bp，包含三個(gè)開放式閱讀框（ORF）。已經(jīng)分離鑒定的HEV分為四種基因型，不同基因型在全世界范圍內(nèi)呈不同的地區(qū)分布。發(fā)生在亞洲和非洲的E型肝炎主要由基因1型HEV引起，1987年墨西哥暴發(fā)的E型肝炎由基因2型HEV引起，世界范圍內(nèi)偶然發(fā)生的E型肝炎主要由基因3型和基因4型HEV引起[3-4]，越來越多的證據(jù)表明，基因3型和基因4型hHEV（humanHEV）基因組非常接近[5-10]，有些與豬感染的HEV是一致的[11-12]。HEV是一種人獸共患病，豬可能還有其他動(dòng)物是病毒的儲(chǔ)存庫[13]?？绶N傳播是HEV流行的主要原因之一，特別是在偶爾暴發(fā)的病例中[3]。

E型肝炎（HE）和A型肝炎（HA）臨床癥狀極為相似，均表現(xiàn)為嚴(yán)重感染，典型的癥狀有流感樣、嘔吐、腹瀉、發(fā)熱、頭痛和關(guān)節(jié)痛并伴有轉(zhuǎn)氨酶升高和黃疸，黃疸癥狀可持續(xù)幾周。因?yàn)橥ㄟ^糞便和經(jīng)口感染，污染的食品和飲水是最常見的傳染源。在偶爾暴發(fā)的地方性流行中，往往是由于食用生的或者未煮熟的海鮮或豬肉引起。東南亞和中亞、中東、非洲和中美洲是最主要的地方性流行區(qū)域。人與人之間的接觸傳播、污染的食品和血液制品，以及豬、家禽和其他動(dòng)物作為人獸共患的HEV的儲(chǔ)存宿主是大家所關(guān)注的。

MengXJ等分離鑒定了豬的HEV并采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增基因片段，并對(duì)擴(kuò)增的片段進(jìn)行測(cè)序，分析了美國(guó)不同地區(qū)來源的豬 HEV（sHEV）[14]。HEV 急性感染可采用電子顯微鏡檢查糞便樣品中的病毒粒子或者是采用RT-PCR方法擴(kuò)增病毒特異性基因片段來加以診斷，但這些方法需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和較高的檢測(cè)技術(shù)，只能在極少數(shù)的實(shí)驗(yàn)室才能完成。擴(kuò)增片段的基因序列分析也顯示HEV基因序列有許多變異，RT-PCR方法的敏感性因此就會(huì)受到引物特異性的限制。血清學(xué)檢測(cè)方法是最常用的診斷HEV感染的方法，根據(jù)IgM抗體水平可以診斷急性HEV感染，檢測(cè)IgG抗體水平可以診斷HEV感染后期或感染后恢復(fù)。在人HEV（hHEV）感染的診斷中，血清學(xué)方法已得到了廣泛的應(yīng)用，特別是免疫酶技術(shù)，國(guó)內(nèi)外均有多個(gè)公司生產(chǎn)的采用全病毒抗原、亞單位抗原或基因工程重組抗原包被的免疫酶試劑盒。本試驗(yàn)采用德國(guó)Mikrogen公司生產(chǎn)的兩種免疫酶試劑盒：recomWellHEVIgG（swine）（recomWellR） 和 recomLineHEV IgG（swine）（recomLineR），檢測(cè)實(shí)驗(yàn)感染hHEV基因3型和基因4型的無菌豬感染后不同天數(shù)（DPI）的抗hHEVIgG水平和消長(zhǎng)規(guī)律，同時(shí)檢測(cè)對(duì)照豬和多頭未感染普通豬不同觀察日齡的抗HEVIgG，比較兩種免疫酶檢測(cè)方法檢測(cè)結(jié)果的符合程度和各自的優(yōu)缺點(diǎn)，為臨床合理選擇使用該試劑盒檢測(cè)sHEVIgG提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

RecomWellHEVIgG（swine）ELISA 檢測(cè)試劑盒（recomWellR）、RecomLineHEVIgG （swine） test strips檢測(cè)試劑條（recomLineR）：購自德國(guó)Mikrogen公司。

血清樣本：A1-A9、B1-B9 分別是基因3型hHEV人工感染2頭無菌豬（A、B）后 0、7、14、21、28、35、42、49和 56d的血清樣品；C1-C9、D1-D9分別是基因4型hHEV人工感染2頭無菌豬（C、D） 后 0、7、14、21、28、35、42、49 和 56d 的 血 清 樣 品 ；E1-E9、F1-F9分別為PBS液接種兩頭無菌豬血清樣品，G1-G3、H1-H6、I1-I4和J1-J5為未感染普通豬血清樣品。所有樣本均由美國(guó)愛荷華州立大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)診斷與動(dòng)物生產(chǎn)系Opriessnig實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

豬抗HEVIgG抗體檢測(cè)按recomWellR和recomLineR檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行。血清樣品作1:100稀釋，反應(yīng)后將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，在450nm波長(zhǎng)下讀取recomWellRELISA檢測(cè)樣品的光密度值（OD），以650nm波長(zhǎng)作為參考波長(zhǎng)。recomLineR檢測(cè)結(jié)果置兩層吸水紙間先吸干水分，避光干燥約2h，然后將試紙條粘貼于評(píng)分記錄表上，通過肉眼觀察并按試劑盒判斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。統(tǒng)計(jì)兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果并進(jìn)行比較。recomLineR試紙條圖1。

結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：recomWellRELISA檢測(cè)應(yīng)同時(shí)設(shè)兩個(gè)臨界點(diǎn)對(duì)照、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照各一個(gè)，臨界點(diǎn)對(duì)照OD值（Ecutoff）、陰性對(duì)照OD值（ENeg）和陽性對(duì)照 OD 值（Epos）應(yīng)符合以下條件，兩個(gè)Ecutoff的差異應(yīng)小于20%，然后取平均Ecutoff，ENeg ≤0.15，Ecutoff-ENeg ≥0.050，Epos-ENeg≥0.300，只有在上述條件成立的前提下，才能對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。recomLineR每一試紙條上反應(yīng)控制條帶（最頂端的第一條帶）應(yīng)出現(xiàn)深紫色條帶，抗體種類控制條帶（第二和第三條帶，分別為IgG和IgM）中與酶接合物一致的條帶應(yīng)出現(xiàn)清晰的顏色反應(yīng)，而另一條不出現(xiàn)或僅出現(xiàn)極弱的非特異性條帶；臨界點(diǎn)對(duì)照條帶（第四條帶）應(yīng)出現(xiàn)弱的條帶，但明顯而清晰。只有在上述條件成立的前提下，才能對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。根據(jù)試劑盒說明書上對(duì)各檢測(cè)條帶出現(xiàn)顏色反應(yīng)深淺的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)可以得到每一條帶確定的分值，計(jì)算各條帶相加的總分值，再根據(jù)分值范圍確定檢測(cè)結(jié)果的陰陽性。具體標(biāo)準(zhǔn)如表1、2和3所列。

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2 結(jié)果

2.1 豬抗HEVIgGrecomWellR ELISA檢測(cè)結(jié)果

recomWellRELISA檢測(cè)hHEV基因3型，4型和PBS液接種無菌豬不同時(shí)間所采血清樣品54份，以及未感染普通豬血清樣品18份，檢測(cè)結(jié)果見表4。

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從表4可知，陰、陽性以及臨界點(diǎn)對(duì)照均成立，兩頭hHEV基因3型人工感染無菌豬A和B，于接種感染后第21d開始出現(xiàn)豬抗hHEVIgG陽性，一直到56DPI都為陽性；兩頭hHEV基因4型人工感染無菌豬C和D中，C于21DPI開始出現(xiàn)豬抗hHEVIgG陽性，一直到56DPI都為陽性；而D從35DPI開始出現(xiàn)豬抗hHEVIgG陽性，到56DPI仍為陽性；兩頭PBS液接種無菌豬E和F在觀察期內(nèi)與hHEV接種豬同時(shí)所采集的所有樣品均為陰性；4頭普通豬的18份血清樣品中只有1份為陽性，該頭豬正常飼養(yǎng)條件下于觀察采樣的第35天出現(xiàn)了抗HEVIgG。

2.2 豬抗HEVIgGrecomLineR免疫試紙條檢測(cè)結(jié)果

RecomLineR免疫試紙條檢測(cè)樣品同recomWellRELISA檢測(cè)樣品，根據(jù)試劑盒的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，各樣品的檢測(cè)分值見下表5。

免疫試紙條上對(duì)照均成立，兩頭hHEV基因3型人工感染無菌豬A和B中，其中14DPI開始出現(xiàn)豬抗hHEVIgG陽性，一直到56DPI都為陽性；B從 21DPI開始出現(xiàn)豬抗hHEVIgG陽性，一直到56DPI都為陽性；兩頭hHEV基因4型人工感染無菌豬C和D中，其中C從21DPI開始出現(xiàn)豬抗hHEVIgG陽性，一直到56DPI都為陽性；而D從35DPI開始出現(xiàn)豬抗hHEVIgG陽性，到56 DPI仍為陽性；兩頭PBS液接種對(duì)照無菌豬在觀察期內(nèi)與hHEV接種豬同時(shí)采集的所有樣品recomLineR免疫試紙條檢測(cè)均為陰性；來自四頭普通豬的血清樣品18份中，1份recomLineR免疫試紙條檢測(cè)陽性。

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2.3 兩種檢測(cè)方法比較

兩種檢測(cè)方法檢測(cè)的72份樣品中，recomWellRELISA法檢出陽性樣品23份，陽性檢出率為32.0%（23/72），recomLineR免疫試紙條法檢出陽性樣品24份，陽性檢出率為33.30%（24/72），陽性檢出率兩者差異不顯著（P>0.05）；在 recomWellRELISA法檢出的23份陽性樣品中，recomLineR免疫試紙條法檢測(cè)均為陽性，兩者陽性檢出符合率為100%（23/23）；recomWellRELISA 法的漏檢率約 4.1%（1/24）。

3 分析與討論

HEV包括三個(gè) ORF[2]，其中ORF2和ORF3高度保守的結(jié)構(gòu)域適合作為特異敏感的包被抗原[15]，基因1型和基因3型ORF2和ORF3部分抗原基因分別克隆重組后經(jīng)大腸桿菌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物高度純化后包被96孔酶標(biāo)板制成recomWellHEVIgG ELISA酶標(biāo)板，酶結(jié)合物為抗豬IgG酶標(biāo)抗體，其基于間接ELISA法檢測(cè)豬抗HEV抗體。RecomLineHEV IgG免疫試紙條法是將重組的高度純化的HEV基因1型和3型的 ORF2 N端和C端、ORF2M以及ORF3表達(dá)產(chǎn)物按一定的排列順序線性點(diǎn)在硝酸纖維素膜上，然后將包被的硝酸纖維素膜切成細(xì)條制成。利用它來檢測(cè)抗HEV特異性抗體時(shí)，試紙條和稀釋的血清樣品一起孵育，這樣抗體就會(huì)和試紙條上的抗原結(jié)合，沒有結(jié)合的抗體通過洗滌步驟去除，試紙條再和辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗豬IgG孵育，試紙條上特異性結(jié)合的抗體和酶標(biāo)抗體特異性結(jié)合，通過酶催化底物的顯色反應(yīng)檢測(cè)抗HEV特異性抗體的存在。在免疫酶試紙條頂端，還包括4條順序排列的對(duì)照條帶，第一條為反應(yīng)控制條帶，對(duì)每一個(gè)待檢樣品它都會(huì)出現(xiàn)顯色反應(yīng)，第二條和第三條為酶結(jié)合抗體種類控制條帶，如果酶結(jié)合抗體為IgG，則IgG控制條帶會(huì)出現(xiàn)顏色反應(yīng)，如果酶結(jié)合抗體為IgM，則IgM控制條帶會(huì)出現(xiàn)顏色反應(yīng)，第四條為臨界值控制條帶，用其控制顯色反應(yīng)程度以評(píng)估待檢抗體究竟是陽性、陰性或者是可疑。

文獻(xiàn)報(bào)道，基因3型和基因4型hHEV基因組非常接近[5-10]，感染豬的主要是基因3型和基因4型HEV[11-12]，人偶然暴發(fā)的HE主要由基因3型和基因4HEV引起，而基因1型是常見的引起人HE地方性流行的病因。如結(jié)果所示，兩種酶免疫法能同時(shí)檢測(cè)針對(duì)基因3型和基因4型hHEV感染無菌豬抗hHEVIgG抗體。因?yàn)閮煞N試劑盒的包被抗原均為基因1型和3型的混合抗原，本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)1、3和4基因型HEV抗原之間存在明顯的交叉，這與HEV只有一個(gè)血清型相符，因此，可以采用基因1型和基因3型或者基因1型和基因4型重組抗原包被酶標(biāo)板或試紙條用于檢測(cè)人和豬的HEV感染，只是在檢測(cè)人和豬的抗HEV IgG或IgM抗體時(shí)，分別采用不同的酶結(jié)合第二抗體即可。這兩種試劑盒可廣泛應(yīng)用于豬群HEV感染血清或血漿抗體檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，recomLineR免疫試紙條法不需要特殊昂貴的檢測(cè)設(shè)備如酶標(biāo)儀等，操作步驟也更簡(jiǎn)便，因此更適合基層單位使用。

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