劉亞楠，雷留成，宋漢敏，王海波

(河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州450003)

冬凌草為唇形科植物碎米椏Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara 的干燥地上部分，別名冰凌草、碎米椏。冬凌草具有清熱解毒、活血止痛之功效，用于咽喉腫痛、扁桃體炎、蛇蟲咬傷，亦可用于腫瘤的輔助治療。冬凌草主產(chǎn)于太行山區(qū)的河南省及山西省、河北省，濟(jì)源冬凌草為國家地理標(biāo)志產(chǎn)品;四川、貴州、廣西、陜西、甘肅、江西、湖南等省亦產(chǎn)。文獻(xiàn)報(bào)道，冬凌草主要有效成分為含貝殼杉烷類二萜化合物，還有部分三萜類、黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油類成分等［1］，有效成分主要為二萜化合物，如冬凌草甲素、乙素等［2－3］。本實(shí)驗(yàn)建立了冬凌草中冬凌草甲素的RP-HPLC 法測定方法，為冬凌草的進(jìn)一步利用和開發(fā)提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters 2690 型高效液相色譜儀、Waters 996 型二極管陣列檢測器及Empower 數(shù)據(jù)處理軟件，均為美國Waters 公司產(chǎn)品;KQ－300 型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品;XR205SM－DR 型十萬分之一電子天平，瑞士Precisa 公司產(chǎn)品。18 個(gè)不同來源的藥材(包括采集品和商品)經(jīng)雷留成副主任藥師鑒定為冬凌草Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara 的地上部分;冬凌草甲素對照品，供含量測定用，由中國藥品生物制品檢定所提供，批號111721－200501;甲醇(HPLC grade)，Merck 公司產(chǎn)品;水為市售樂百氏純水，并經(jīng)0.45 μm 水系濾膜過濾。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱Agilent ZORBAX SB－C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相甲醇—水(52∶48)，檢測波長239 nm，柱溫35 ℃，流速1 mL/min，見圖1。

圖1 冬凌草甲素HPLC 色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的冬凌草甲素對照品適量，加甲醇制成每1 毫升中含62 μg 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末(過4 號篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，放置30 min，超聲處理(功率300 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品溶液(62 mg/L)分別進(jìn)樣2，7，10，15，20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，冬凌草甲素進(jìn)樣量在124～1 240 ng 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，計(jì)算回歸方程為:Y=1.332 37X－1.947 09(r=0.999 997)。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取62.0 mg/L 的供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積并計(jì)算平均值，RSD 為0.54% 。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8 h 進(jìn)樣，測定峰面積并計(jì)算平均值，RSD 為1.7%。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同批藥材6 份，按供試品溶液制備，進(jìn)樣10 μL，測定含量并計(jì)算平均值，RSD 為2.5%。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的冬凌草樣品粉末6 份，每份0. 5 g，分別加入冬凌草甲素對照品溶液(0.027 20 g/L)50 mL，按供試品溶液制備，進(jìn)樣10 μL，測定含量。結(jié)果見表1。

表1 冬凌草甲素加樣回收試驗(yàn)

2.9 含量測定

分別取不同來源的18 批藥材1.0 g，精密稱定，按上述供試品溶液的制備方法，進(jìn)樣10 μL，分別進(jìn)行含量測定，冬凌草甲素(C20H28O6)的含量按干燥品計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 18 批冬凌草藥材中冬凌草甲素含量測定

3 小 結(jié)

有關(guān)提取方法的選擇，筆者分別采用甲醇加熱回流2 h、甲醇超聲提取40 min、乙醚索氏提取5 h、石油醚索氏提取除雜后丙酮超聲處理40 min、乙醚冷浸過夜5 種方式提取同批樣品，然后用HPLC 法測定冬凌草甲素含量，結(jié)果表明甲醇超聲提取的方法效果最好。有關(guān)提取時(shí)間的選擇，筆者以甲醇為溶劑，以同樣的溶劑量分別超聲提取20，30，40 min來測定同批樣品，結(jié)果冬凌草甲素含量較為接近，故以提取30 min 最為適宜。有關(guān)提取溶劑用量的選擇，筆者以甲醇為溶劑，超聲提取同批樣品30 min，溶劑用量分別為25，50，100 mL，結(jié)果以50 mL 甲醇洗脫能較完全地提取出冬凌草甲素且節(jié)省溶劑。

綜上所述，本研究所建立的冬凌草甲素含量測定方法簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，為冬凌草藥材的質(zhì)量控制提供了試驗(yàn)依據(jù)。