李學(xué)鵬 勵(lì)建榮 于 平 朱軍莉 王彥波 傅玲琳

(浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,杭州 310035)

蛋白組學(xué)及其在食品科學(xué)研究中的應(yīng)用

李學(xué)鵬 勵(lì)建榮 于 平 朱軍莉 王彥波 傅玲琳

(浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,杭州 310035)

后基因組時(shí)代的主要研究任務(wù)之一即是蛋白組學(xué)研究,蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速,目前已有望成為用來(lái)解決生命科學(xué)領(lǐng)域中諸多問(wèn)題包括食品品質(zhì)與安全等食品科學(xué)問(wèn)題的有力工具。蛋白組學(xué)為食品科學(xué)相關(guān)研究提供了新的思路和技術(shù),在食品科學(xué)研究中已有廣泛的應(yīng)用。介紹了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù),即蛋白質(zhì)組分分離、蛋白質(zhì)組分鑒定、利用蛋白質(zhì)組信息學(xué)進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè),綜述了蛋白組學(xué)技術(shù)在食品科學(xué)研究中的進(jìn)展,并展望了其應(yīng)用前景。

蛋白組學(xué) 雙向電泳 質(zhì)譜 蛋白質(zhì)信息學(xué) 食品科學(xué) 應(yīng)用

人類基因組計(jì)劃完成之后,生命科學(xué)研究的重心已從解析生命的全套遺傳信息轉(zhuǎn)移到系統(tǒng)研究這些遺傳信息代表的生物學(xué)功能上來(lái),即蛋白質(zhì)的研究,從而產(chǎn)生了一門新的學(xué)科——蛋白組學(xué) (Pro2 teomics),使得生命科學(xué)研究進(jìn)入了以基因組學(xué) (Ge2 nomics)、蛋白組學(xué) (Proteomics)、代謝組學(xué) (Metabo2 nomics)等“組學(xué)”研究為標(biāo)志的后基因組時(shí)代。組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用也促進(jìn)了與食品科學(xué)相關(guān) DNA、RNA、蛋白質(zhì)和小分子代謝物的研究以及相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)的建立[1]。2001年的 Science雜志已把蛋白組學(xué)列為六大研究熱點(diǎn)之一,其“熱度”僅次于干細(xì)胞研究,名列第二。蛋白組學(xué)的受關(guān)注程度如今已令人刮目相看。蛋白質(zhì)組 (Proteome)是指由基因組表達(dá)產(chǎn)生的所有相應(yīng)的蛋白質(zhì)。與具有同源性和普遍性的基因組相比,蛋白質(zhì)組是對(duì)某一生物或細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的特征、數(shù)量和功能進(jìn)行系統(tǒng)性的研究,能提供全面的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)過(guò)程的信息,具有動(dòng)態(tài)性、時(shí)間性、空間性和特異性,更能在細(xì)胞和生命的整體水平上闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)和活動(dòng)規(guī)律。這就促使了蛋白質(zhì)組學(xué)研究相對(duì)于基因組學(xué)研究越來(lái)越受到人們的重視,目前已有望成為解決生命科學(xué)領(lǐng)域中諸多問(wèn)題的工具,其中也包括食品科學(xué)領(lǐng)域。

食品質(zhì)量與安全事關(guān)人民群眾身體健康和生命安全,已成為人們時(shí)刻關(guān)心的焦點(diǎn)問(wèn)題。消費(fèi)者期望食品生產(chǎn)者和經(jīng)營(yíng)者能夠提供優(yōu)質(zhì)、安全的食品,然而食品品質(zhì)是一個(gè)復(fù)雜的綜合問(wèn)題,食品原料的性質(zhì)、貯藏條件及加工過(guò)程中各種條件等諸多因素都會(huì)影響到食品的品質(zhì)與安全性。由于蛋白質(zhì)是多數(shù)食品的主要組成成分,因而蛋白質(zhì)組分析能夠提供參與決定食品品質(zhì)的各種生理機(jī)制過(guò)程中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能等方面的更多信息,因此蛋白組學(xué)為食品科學(xué)研究提供了嶄新的思路和技術(shù)。目前,蛋白質(zhì)組學(xué)在食品科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用還處于一個(gè)早期階段,但已有了許多新的發(fā)現(xiàn)[2-3],表現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。

就蛋白質(zhì)組學(xué)的主要研究技術(shù)及其發(fā)展作一綜述,并著重介紹蛋白組學(xué)在食品科學(xué)研究中的進(jìn)展和應(yīng)用前景。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)的概念與研究?jī)?nèi)容

1.1 蛋白組學(xué)概念

1994年,澳大利亞悉尼 Maquarie大學(xué)的 Marc W ilkins等[4]首先將蛋白質(zhì)組 (proteome)定義為“基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì),包括各種亞型及蛋白質(zhì)修飾”。這個(gè)概念的提出標(biāo)志著一個(gè)新的學(xué)科——蛋白組學(xué)的誕生,即以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象,應(yīng)用相關(guān)研究技術(shù),從整體水平上來(lái)認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)的存在及活動(dòng)方式 (表達(dá)、修飾、功能、相互作用等)的學(xué)科[5-6]。

1.2 蛋白組學(xué)研究?jī)?nèi)容

總體上看,蛋白質(zhì)組研究可分為兩個(gè)方面。一個(gè)是對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)模式 (或蛋白質(zhì)組組成)的研究,另一方面是對(duì)蛋白質(zhì)組功能模式 (目前主要集中在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系)的研究。目前蛋白組學(xué)研究的主要內(nèi)容包括:①蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)與功能的明確;②蛋白質(zhì)翻譯后的修飾特征;③蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析;④蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié);⑤蛋白質(zhì)的相互作用及其構(gòu)象研究;⑥蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)分析以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中的蛋白質(zhì)分離;⑦蛋白質(zhì)的表達(dá)分析;⑧生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與代謝途徑分析等[7-8]。

2 蛋白組學(xué)主要研究技術(shù)

蛋白組學(xué)研究的核心技術(shù)為:蛋白質(zhì)組分分離技術(shù),蛋白質(zhì)組分的鑒定技術(shù),利用蛋白質(zhì)信息學(xué)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能分析及預(yù)測(cè)。目前,主要有三種常用的蛋白組學(xué)技術(shù),即 2– DE分離經(jīng)膠上原位酶解后的質(zhì)譜鑒定技術(shù)、特異性酶解后多維色譜–質(zhì)譜聯(lián)用蛋白質(zhì)鑒定技術(shù) (MudPIT)和抗體芯片表面增強(qiáng)激光解析電離法檢測(cè)技術(shù) (SELD I– TOF–MS),方法的選擇取決于研究目的和可利用的儀器設(shè)備[9]。雖然發(fā)展了幾種途徑的蛋白質(zhì)表達(dá)分析技術(shù),2D– PAGE與 MS結(jié)合仍是目前最經(jīng)典也是應(yīng)用最廣泛的方法[10]。

2.1 雙向電泳質(zhì)譜 (2-DE-MS)技術(shù)

雙向電泳技術(shù)是一種用來(lái)從復(fù)雜的樣本中分離蛋白質(zhì)的電泳方法,其基本原理是,第一步是根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn) (PI)的不同來(lái)分離蛋白質(zhì),稱作等電聚焦 (IEF)。通過(guò)固定 pH梯度技術(shù) (IPG)可以實(shí)現(xiàn)非常精確的蛋白質(zhì)分離并具有高度的可重復(fù)性;第二步是根據(jù)蛋白質(zhì)分子量大小的差別,采用經(jīng)典的 SDS– PAGE電泳來(lái)達(dá)到蛋白質(zhì)分離的目的,在 2– DE分析中,蛋白質(zhì)根據(jù)它的分子質(zhì)量和所攜帶的電荷移到特定的位置,形成蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜,一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)就代表一種單個(gè)的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)點(diǎn)的飽和度顯示的是那個(gè)細(xì)胞所產(chǎn)生的實(shí)際蛋白質(zhì)數(shù)。2– DE在數(shù)小時(shí)內(nèi)可同時(shí)分離大量蛋白質(zhì),應(yīng)用大面積膠,一次可鑒定多達(dá) 10 000個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)[11];可通過(guò)蛋白質(zhì)點(diǎn)染色的強(qiáng)度對(duì)其進(jìn)行定量分析,也可提供蛋白質(zhì)翻譯后修飾信息,具有不同程度的糖基化或磷酸化修飾的蛋白質(zhì)亞型能較容易地進(jìn)行分離[12]。在過(guò)去40年中已經(jīng)測(cè)定了許多物種和組織的 2– DE膠圖譜 ,其中包括豬[13]、牛[14]、雞[15]和水產(chǎn)品[16]等 ,一些圖譜已經(jīng)被用于獲得與食品品質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記。

在過(guò)去 20年中,質(zhì)譜技術(shù) (MS)已經(jīng)從分析小的揮發(fā)性分子發(fā)展到一個(gè)很廣的應(yīng)用范圍,包括對(duì)蛋白質(zhì)和肽的分析。應(yīng)用質(zhì)譜分析可進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定和序列測(cè)定,其基本原理是樣品分子離子化后,根據(jù)不同離子之間的質(zhì)荷比的差異來(lái)分離并確定相對(duì)質(zhì)量。在離子化方法上,現(xiàn)多采用電噴霧離子化 (ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸離子化 (MALD I)的軟電離方法,樣品分子進(jìn)行電離時(shí)能保留整個(gè)分子的完整性,而不會(huì)形成碎片離子,又稱肽質(zhì)指紋圖譜 (Peptide-Mass Fingerprinting,PMF)技術(shù)。這些電離方法是基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALD I– TOF)和電噴霧電離–串聯(lián)質(zhì)譜 (ESI–MS/MS)技術(shù)的核心,將它們結(jié)合起來(lái)使用是蛋白質(zhì)組學(xué)中一個(gè)經(jīng)典的成就[17]。PMF是一種現(xiàn)在運(yùn)用最廣的用來(lái)鑒定2-DE分離出來(lái)的蛋白質(zhì)和肽的方法,已經(jīng)成功地應(yīng)用于鑒定包括全部的家養(yǎng)動(dòng)物在內(nèi)的許多生物的蛋白質(zhì)[18]。

2.2 多維色譜–質(zhì)譜聯(lián)用 (MudPIT)技術(shù)

MudPIT技術(shù)先由特異性的胰蛋白酶消化,產(chǎn)生的多肽由強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱和反相 HPLC分離后經(jīng)ESI–MS/MS分析。同位素親和標(biāo)簽可標(biāo)記對(duì)照組和處理組樣品的蛋白質(zhì),從而得到蛋白組的定量信息。而且用13C標(biāo)記多肽加入到蛋白質(zhì)消化混合物中,可用于樣品制備過(guò)程中肽回收率的測(cè)定。由于MudPIT法采用高速且高靈敏度的色譜分離法來(lái)代替耗時(shí)的 2-DE蛋白質(zhì)分離法,故其與經(jīng)典的 2– DE–MS法相比,具有快速、樣品需要量少和多肽分離的通用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),但MudPIT法不能提供蛋白質(zhì)異構(gòu)體和翻譯后修飾的相關(guān)信息[19]。

2.3 SELD I-TOF-MS技術(shù)

SELD I技術(shù)通過(guò)離子交換柱或 LC分離蛋白質(zhì),并通過(guò)芯片上抗體、底物等的親和力從蛋白質(zhì)混合物中直接獲得單個(gè)或多個(gè)目標(biāo)蛋白。故 SELD I技術(shù)能從復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品中富集蛋白質(zhì)亞群,所得蛋白經(jīng)激光解析離子化后進(jìn)一步質(zhì)譜鑒定。SELD I技術(shù)的樣品制備簡(jiǎn)便,減少了樣品的復(fù)雜性,特別適于轉(zhuǎn)錄因子等低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè),并能迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)的表征。然而該方法目前僅可應(yīng)用于分子質(zhì)量不大于 20 ku蛋白質(zhì)的分離鑒定,且分子質(zhì)量精確度低于經(jīng)典的 2-DE-MS法[20]。

2.4 蛋白質(zhì)信息學(xué)

生物信息學(xué) (Bioinfor matics)是通過(guò)對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲取、加工、存儲(chǔ)、檢索與分析來(lái)獲取所得數(shù)據(jù)的生物學(xué)信息。在獲得了編碼蛋白質(zhì)的 DNA序列后,其表達(dá)蛋白的功能研究成為下一步分析的主要目的。蛋白質(zhì)信息學(xué) (Protein Bioinfor matics)在蛋白質(zhì)組分析中起重要作用,一是通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知蛋白質(zhì)相比較來(lái)判斷未知蛋白質(zhì)的功能;二是預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu),并判斷蛋白質(zhì)有無(wú)發(fā)生修飾。蛋白質(zhì)組學(xué)中出現(xiàn)的大量復(fù)雜數(shù)據(jù)需要整合許多其他來(lái)源的數(shù)據(jù),包括表型以及結(jié)構(gòu)基因組和功能基因組數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)搜集和合并是蛋白質(zhì)組分析中一個(gè)主要的任務(wù),近年來(lái)出現(xiàn)了一些處理數(shù)據(jù)的先進(jìn)算法和軟件,并且還存在著許多開(kāi)放性資源和商業(yè)化的數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)[21-22]。

表 1 在網(wǎng)絡(luò)上一些可以免費(fèi)使用的蛋白質(zhì)鑒定工具

蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)被認(rèn)為是蛋白質(zhì)組學(xué)知識(shí)的儲(chǔ)存庫(kù),包含所有鑒定的蛋白質(zhì)信息,如蛋白質(zhì)的順序、核苷酸順序、雙向凝膠電泳、三維結(jié)構(gòu)、翻譯后的修飾、基因組及代謝數(shù)據(jù)庫(kù)等,一些開(kāi)放性的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)見(jiàn)表 1[21]。這些數(shù)據(jù)庫(kù)涵蓋了人類和經(jīng)典的模式生物如小鼠、大鼠和酵母。生物信息學(xué)的發(fā)展使蛋白質(zhì)的鑒定更方便、更快捷,而且隨著基因組學(xué)的深入研究,能夠?yàn)榈鞍踪|(zhì)組學(xué)研究提供更全面的數(shù)據(jù)庫(kù)[22]。

3 蛋白組學(xué)在食品科學(xué)研究中的應(yīng)用

3.1 蛋白組學(xué)在糧油科學(xué)研究中的應(yīng)用

影響農(nóng)作物品質(zhì)和產(chǎn)量的因素很多,近年來(lái)運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)與方法對(duì)其機(jī)理進(jìn)行研究和探討,對(duì)農(nóng)產(chǎn)品性狀的改良和產(chǎn)量的提高具有積極作用。Natarajan等[23]對(duì)野生型和栽培型大豆種子的蛋白譜進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)二者具有相似性,提高大豆蛋白中含硫氨基酸的濃度,可以顯著的改善大豆蛋白的品質(zhì)。在提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量方面,Bahrman等[24]通過(guò)比較蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究不同小麥品種間氮肥施用效果的差異,研究發(fā)現(xiàn)氮水平對(duì)小麥籽粒數(shù)量、干重和含氮量的影響是很顯著的,該研究對(duì)今后更好地采取提高產(chǎn)量的有效措施具有重要的意義。

蛋白組學(xué)能夠提供與小麥品質(zhì)及籽粒硬度相關(guān)的蛋白質(zhì)組成的相關(guān)信息,為小麥品質(zhì)的改良提供指導(dǎo),同時(shí)也可以預(yù)測(cè)面包的品質(zhì)[24]。谷物蛋白質(zhì)組學(xué)在小麥谷蛋白、醇溶蛋白等種子貯藏蛋白影響面團(tuán)黏彈性及烘焙品質(zhì)方面已有一些研究。Amiour等[25]采用 2– DE分離得到目的蛋白點(diǎn),采用MALD– TOF和 ESI– MS/MS對(duì)小麥籽粒進(jìn)行了蛋白組學(xué)研究,以增加對(duì)小麥籽粒中兩親性蛋白的生理功能的了解。Salt等[26]經(jīng)研究證明小麥生面團(tuán)中形成泡沫的可溶性蛋白對(duì)面團(tuán)中的氣泡具有穩(wěn)定性作用?？蒲腥藛T分別利用雙向電泳技術(shù)對(duì)小麥胚乳、面筋及灌漿期的小麥胚乳進(jìn)行了蛋白組分析,試闡明相關(guān)的生物化學(xué)特性,為提高面食產(chǎn)品的質(zhì)量奠定理論基礎(chǔ)[27-28]。何中虎等[29]對(duì)中國(guó)小麥品種品質(zhì)評(píng)價(jià)體系建立與分子改良技術(shù)的研究取得了重要進(jìn)展,特別是通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)了與面筋強(qiáng)度直接相關(guān)的水溶性蛋白WS-6,以及運(yùn)用改進(jìn)的SDS-PAGE方法明確了面包和面條對(duì)亞基組成的要求等研究成果,為進(jìn)一步推動(dòng)小麥品質(zhì)改良工作提供了新的理論依據(jù)。

3.2 蛋白組學(xué)在肉品學(xué)研究中的應(yīng)用

3.2.1 肌肉的生長(zhǎng)和發(fā)育

肌纖維分兩種類型:紅肌纖維和白肌纖維,這兩種類型在代謝水平上存在著結(jié)構(gòu)和功能的差異。纖維類型與肉質(zhì)性狀比如多汁性、風(fēng)味和嫩度之間的關(guān)系有很多爭(zhēng)議,尤其是纖維類型對(duì)肉嫩度的影響仍然不清楚[30]。利用能描述生長(zhǎng)表型和獨(dú)特的嫩度性狀的動(dòng)物模型(如牛的雙肌和羊的肥臀性狀)進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究,可以更好地了解生長(zhǎng)和肉質(zhì)性狀之間相關(guān)的分子機(jī)制[31-32]。Doherty等[33]闡述了蛋雞胸肌蛋白質(zhì)組的特性,揭示了生長(zhǎng)期幾種相關(guān)的蛋白質(zhì)在表達(dá)水平上均有極大的變化。Boule等[34]應(yīng)用蛋白質(zhì)組研究牛骨骼肌的過(guò)度生長(zhǎng)現(xiàn)象,表明肌肉生長(zhǎng)抑制素(Myostain)基因上有 11對(duì)堿基對(duì)缺失導(dǎo)致 13種肌肉蛋白質(zhì)發(fā)生了改變。包括收縮蛋白和代謝蛋白,這些蛋白質(zhì)絕大多數(shù)是來(lái)自有收縮性的器官組織,并能夠加快肌纖維的收縮功能。同時(shí),他們發(fā)現(xiàn)隨著肌肉收縮特征的改變,肌肉蛋白質(zhì)的代謝模式也發(fā)生了改變。Lametsch等[35]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)豬的補(bǔ)償性生長(zhǎng)可以改變其肌肉的蛋白質(zhì)組,這有助于進(jìn)一步了解補(bǔ)償性生長(zhǎng)與蛋白周轉(zhuǎn)變化、肉質(zhì)軟化之間的關(guān)系。盡管這些研究還未能得出肌肉生長(zhǎng)和肉品質(zhì)性狀最主要的聯(lián)系,但是蛋白質(zhì)組意義上的觀察將對(duì)理解骨骼肌的生長(zhǎng)規(guī)律起到重要有用,而且在將來(lái)的研究中可能為肌肉生長(zhǎng)和肉品質(zhì)性狀如何相互聯(lián)系提供信息。

3.2.2 屠宰后肌肉的代謝活動(dòng)

由于屠宰后肌肉早期的生化現(xiàn)象在很大程度上影響肉的品質(zhì),因此了解屠宰后肌肉的代謝活動(dòng)與肉品質(zhì)的關(guān)系是肉品學(xué)關(guān)注的一個(gè)主要的焦點(diǎn)。研究表明,與理化性質(zhì)相關(guān)的參數(shù)、組織化學(xué)性質(zhì)、溫度、基因型及其他諸多因素都會(huì)影響到屠宰后肌肉的代謝活動(dòng),然而對(duì)于屠宰后肌肉的代謝活動(dòng)與肉質(zhì)之間的關(guān)系卻知之甚少[36]。一般說(shuō)來(lái),使肉變得僵硬的因素會(huì)顯著影響嫩度,這些因素包括電刺激、壓力、冷卻速度和屠宰前的營(yíng)養(yǎng)狀況[37-38],因此建立能夠描述屠宰后肌肉蛋白質(zhì)組變化的動(dòng)物模型是一個(gè)挑戰(zhàn)性的工作[39]。

Lametsch等[40]首次利用蛋白質(zhì)組分析了屠宰后豬肌肉的變化情況。他們采集了剛屠宰至屠宰后48 h肌肉的蛋白質(zhì)組樣品,這些肌肉蛋白質(zhì)從 5～200 ku不等,pH值在 4～9之間,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組模式發(fā)生了 15種顯著的變化。此后,Lametsch等[41-42]通過(guò)研究最終確定了可作為肉品質(zhì)標(biāo)記的20多種蛋白質(zhì),包括結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì) (肌動(dòng)蛋白,肌球蛋白和肌鈣蛋白 T)和代謝酶,如肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶。在這些標(biāo)記蛋白中,人們發(fā)現(xiàn)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白重鏈 (MHC)與肌肉的剪切力之間存在極顯著的相關(guān),這表明屠宰后肌動(dòng)蛋白和MHC的降解會(huì)影響肉的質(zhì)量。Remignon[43]等直接對(duì)肌肉蛋白片段進(jìn)行分析,認(rèn)為蛋白質(zhì)的改變很可能是導(dǎo)致家禽 PSE肉綜合癥的直接原因,但目前對(duì)于具體是哪些蛋白質(zhì)發(fā)生了改變以及這些蛋白質(zhì)如何被修飾還知之甚少。Molette[44-45]等研究發(fā)現(xiàn)火雞 (BUT9)屠宰后胸肌糖酵解的速度比較快 (屠宰后每 20分鐘pH值比正常的多下降 0.5),從而使得肉品質(zhì)發(fā)生改變,如系水力下降,加工產(chǎn)量降低,嫩度降低。

3.2.3 鈣蛋白酶在保持肉嫩度中的作用

研究表明鈣激活中性蛋白酶在肉的嫩化中起到一個(gè)關(guān)鍵的作用,其限速因子是 calpastatin介導(dǎo)的對(duì)屠宰后鈣蛋白酶活性的抑制作用[46]。引起羊肥臀主要原因是由于 18號(hào)染色體的突變,導(dǎo)致鈣激活中性蛋白酶的活性增加強(qiáng)兩到三倍。肥臀羊死后肌肉結(jié)構(gòu)的變化與其他類型的羊相似,但發(fā)生的速度較慢,這就表明了鈣激活中性蛋白酶系統(tǒng)在肉嫩化中的重要作用[47]。Lametsch等[48]研究報(bào)道了具體的肌纖維蛋白由鈣激活中性蛋白酶介導(dǎo)的降解圖譜,肌動(dòng)蛋白、肌鈣蛋白和一些原肌球蛋白異構(gòu)體的特定降解圖譜也將被測(cè)定,這些肽的圖譜與肉嫩度之間的關(guān)系仍需要進(jìn)一步的分析。

3.3 蛋白組學(xué)在水產(chǎn)品貯藏加工研究中的應(yīng)用

魚貝類等水產(chǎn)品的基質(zhì)同畜禽肉一樣,無(wú)論從細(xì)胞水平還是從從組織水平都是由大量的蛋白質(zhì)組成。顯然,蛋白組學(xué)在水產(chǎn)品原料組成、貯藏加工過(guò)程中的品質(zhì)變化、蛋白質(zhì)之間及蛋白質(zhì)與其他成分之間的相互關(guān)系等方面的研究中同樣具有重要價(jià)值。

Kjaersgard等[49]在 11種不同冷凍儲(chǔ)存條件下對(duì)鱈魚肌肉蛋白質(zhì)圖譜進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)不同冷凍儲(chǔ)存溫度對(duì)蛋白質(zhì)圖譜無(wú)顯著影響,但是經(jīng)過(guò)不同的冷凍儲(chǔ)存時(shí)間 (3個(gè)月、6個(gè)月和 12個(gè)月),肌漿球蛋白輕鏈、磷酸丙糖異構(gòu)酶、醛縮酶 A、2–α肌動(dòng)蛋白片段等蛋白質(zhì)的濃度發(fā)生了顯著變化,從而導(dǎo)致魚肉質(zhì)地和味道特有的變化。Bos worth等[50]對(duì)受低氧溫脅迫的斑馬魚的魚肉進(jìn)行研究分析,發(fā)現(xiàn)低氧對(duì)6個(gè)低豐度蛋白產(chǎn)生影響,而不影響蛋白的表達(dá)模式。Martinez等[51]將雙向電泳技術(shù)用于魚種屬和魚肉組織的鑒定,研究了北極和熱帶品種死亡后的變化特征及某些添加劑在魚肉加工過(guò)程中的影響。

3.4 蛋白組學(xué)在乳品學(xué)研究中的應(yīng)用

3.4.1 在乳蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用

蛋白質(zhì)水解是影響乳制品質(zhì)地的關(guān)鍵因素,所產(chǎn)生的肽類一般是風(fēng)味物質(zhì)的前體,或具有獨(dú)特的生物學(xué)特性。2– DE可用于考察蛋白水解酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解作用。Kunji等[52]為了研究 L.lactis中β-酪蛋白水解途徑,將蛋白水解系統(tǒng)中編碼關(guān)鍵酶的幾個(gè)基因切除,結(jié)果表明細(xì)胞壁上有關(guān)的蛋白酶具有底物特異性,主要表現(xiàn)在β-酪蛋白的 C–末端,并且存在有能轉(zhuǎn)移至少 10個(gè)殘基的寡肽轉(zhuǎn)移系統(tǒng),只有少數(shù)的肽類能被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。Deutsch等[53]比較了瑞士奶酪中幾種嗜熱乳酸菌的細(xì)胞提取物的水解作用,包括 Lactobacillus helveticus、Lactobacil2 lus delbruecki subsp.lactis和Streptococcus ther m ophilus,其中 L.helveticus水解β-酪蛋白的能力最強(qiáng),但存在于水解產(chǎn)物中的磷酸肽幾乎不能被降解,用相同的底物對(duì)保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌以及 4種丙酸菌研究也能得到類似的結(jié)果。

3.4.2 在乳酸菌蛋白質(zhì)組中的應(yīng)用

3.4.2.1 乳酸菌的標(biāo)準(zhǔn)圖譜

Anglade等[54]報(bào)道了 L.lactis的第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)凝膠,得到了 450個(gè)銀染斑點(diǎn),鑒定了 15個(gè)蛋白質(zhì)。通過(guò) 2DE分離蛋白質(zhì),再由肽類質(zhì)譜圖及搜索數(shù)據(jù)庫(kù)而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的鑒定。由于基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中乳酸菌的信息還不完全,因而限制了蛋白質(zhì)的鑒定。Perrin等[55]對(duì)生長(zhǎng)于M17–乳糖培養(yǎng)基上的嗜熱鏈球菌進(jìn)行研究,用 2D– PAGE分離并通過(guò) N–末端測(cè)序來(lái)鑒定,建立了一種相當(dāng)精確的對(duì)斑點(diǎn)指數(shù)化的方法。在所用的分析條件下只檢測(cè)到了大約理論蛋白質(zhì)組的 17%。目前有很多工作致力于更精確地描述乳酸菌蛋白質(zhì)組。

3.4.2.2 乳酸菌蛋白質(zhì)的差異表達(dá)

乳酸菌中蛋白質(zhì)的差異表達(dá)研究最多的是 L.lactis,對(duì)它的差異研究主要是 2個(gè)菌株之間或不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的細(xì)胞所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組的比較。Guimont等[56]比較了在M17培養(yǎng)基或牛奶中生長(zhǎng)的不同 St.ther m ophilus菌株的蛋白質(zhì)組成,不同的菌株和培養(yǎng)基對(duì)蛋白質(zhì)組成的數(shù)量及性質(zhì)都有影響,牛奶基質(zhì)中酶的產(chǎn)量要比M17培養(yǎng)基低。

大多數(shù)有關(guān)乳酸菌的差異表達(dá)研究集中在脅迫反應(yīng)和適應(yīng)方面,這有助于更好地理解乳酸菌的適應(yīng)反應(yīng)及相關(guān)的交叉保護(hù)機(jī)制,將乳酸菌應(yīng)用于特定的工業(yè)過(guò)程。Rechinger等[57]采用 35S標(biāo)記的方法,結(jié)合 2– DE和 N–末端測(cè)序,以動(dòng)力學(xué)方式研究了保加利亞乳桿菌在合成培養(yǎng)基與牛奶中所表達(dá)的蛋白質(zhì)的差異,他們發(fā)現(xiàn)將細(xì)胞從MRS培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到牛奶中后不會(huì)誘導(dǎo)脅迫酶或糖酵解酶的大量合成。

3.5 蛋白組學(xué)在食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究中的應(yīng)用

3.5.1 食品蛋白質(zhì)組成和活性成分研究

食品蛋白質(zhì)測(cè)定的傳統(tǒng)方法不能得到純的蛋白和氨基酸序列等信息,而蛋白組分析則可輕易獲得這些重要信息。目前,食品蛋白組學(xué)研究主要集中在富含蛋白的大豆、乳品蛋白組成和活性成分的研究。Gianazza等[58]采用 2– DE– MS法發(fā)現(xiàn)不同蛋白質(zhì)組成的大豆對(duì)人體血漿脂蛋白等水平有影響,其中血漿 7S和 11S球蛋白變化顯著。Smolenski等[59]采用MudPIT和 2– DE–MS法表征牛奶蛋白組,分別發(fā)現(xiàn) 2903和 2770個(gè)多肽,說(shuō)明牛奶成分比先前報(bào)道的更為復(fù)雜,還鑒定了 15種與機(jī)體防御機(jī)能有關(guān)的蛋白。

3.5.2 營(yíng)養(yǎng)素在胃腸道的消化與吸收研究

食物營(yíng)養(yǎng)素的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和其它功能不僅與自身的成分有關(guān),還依賴于其在胃腸道中的消化和吸收,但目前對(duì)消化酶和上皮細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)體卻所致甚少。蛋白組分析表明,大鼠小腸存在一些小腸分子伴侶蛋白、細(xì)胞骨架可塑性蛋白和維生素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等以前未發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì),比如:胃腸調(diào)理素、α-細(xì)絲蛋白和 V D結(jié)合蛋白前體等[60]。Alpert等[61]在體外用內(nèi)毒素或病原菌處理小腸上皮細(xì)胞后,2–DE–MS法分析發(fā)現(xiàn)有 25種和 18種蛋白質(zhì)分別上調(diào)和下調(diào)表達(dá),這些蛋白可能與炎癥條件下?tīng)I(yíng)養(yǎng)素的消化和吸收不佳有關(guān)。

3.5.3 營(yíng)養(yǎng)素的代謝與代謝調(diào)控機(jī)制研究

蛋白組學(xué)技術(shù)為糖尿病、肥胖、衰老、心血管疾病等營(yíng)養(yǎng)代謝與調(diào)控異常疾病的機(jī)制研究提供了新的途徑,闡明了營(yíng)養(yǎng)素代謝和調(diào)控機(jī)制。Li等[62]采用 2–DE–MS法比較了青年人與老年人正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞蛋白質(zhì)組,發(fā)現(xiàn)代謝、能量產(chǎn)生、分子伴侶、抗氧化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)修復(fù)和細(xì)胞調(diào)亡相關(guān)蛋白質(zhì)出現(xiàn)差異表達(dá)。這些研究有助于理解人營(yíng)養(yǎng)吸收與代謝相關(guān)細(xì)胞衰老的分子機(jī)制。Bluher等[63]比較了脂肪敏感胰島素受體基因敲除小鼠的脂肪細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn) 27個(gè)脂質(zhì)和能量代謝通路的關(guān)鍵蛋白上調(diào)或下調(diào)表達(dá),其中轉(zhuǎn)酮醇酶、延伸因子– 2和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白– 78等與胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和脂肪細(xì)胞大小調(diào)控密切相關(guān),其中 14種蛋白質(zhì)可能由相應(yīng) mRNA表達(dá)量變化引起,13種可能由蛋白質(zhì)翻譯或周轉(zhuǎn)引起,這說(shuō)明胰島素可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾水平影響蛋白質(zhì)的表達(dá)模式。這些研究結(jié)果進(jìn)一步加深了人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的了解。

3.6 蛋白組學(xué)在食品安全與食品鑒偽中的應(yīng)用

各種食品安全突發(fā)事件,如食物過(guò)敏事件、沙門氏菌、李斯特菌污染事件、瘋牛病事件等已經(jīng)引起人們對(duì)食品安全的極大關(guān)注。其中,食物過(guò)敏是一個(gè)全世界關(guān)注的焦點(diǎn)問(wèn)題。隨著社會(huì)環(huán)境和生活方式的巨大變化,人類的飲食環(huán)境進(jìn)入多樣化時(shí)代,過(guò)敏性疾病的發(fā)病率隨之亦呈持續(xù)快速上升的趨勢(shì)。最近調(diào)查顯示,我國(guó) 15～24歲年齡段健康人群中,約有 6%的人曾患有食物過(guò)敏。成年人多對(duì)海鮮有過(guò)敏反應(yīng),大約有 7百萬(wàn)美國(guó)人對(duì)海產(chǎn)品過(guò)敏,占美國(guó)總?cè)丝诘?2.3%,其中 0.5%的成年人對(duì)蝦類產(chǎn)品過(guò)敏。海鮮過(guò)敏是由免疫球蛋白 IgE對(duì)海產(chǎn)品中一些特殊蛋白質(zhì) (如結(jié)構(gòu)蛋白:原肌球蛋白等)反應(yīng)引起的[64]。蛋白組學(xué)為食物過(guò)敏原的鑒定和表征提供了技術(shù)支持。Yu等[65]采用 2– DE– MALD I– TOF技術(shù)研究了斑節(jié)對(duì)蝦的致敏原,結(jié)果顯示該致敏原是一種具有精氨酸激酶的蛋白質(zhì),它能與蝦過(guò)敏性病人血清 IgE發(fā)生反應(yīng),從而引起蝦過(guò)敏性病人的皮膚過(guò)敏反應(yīng)。Koller等[66]采用 2– DE和 MS/MS及能夠檢測(cè)、鑒定超過(guò) 2 500種蛋白質(zhì)的多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)對(duì)水稻 (O ryza sativa)的葉、根和種子組織進(jìn)行了系統(tǒng)的蛋白組學(xué)研究,結(jié)果在種子樣品中鑒定出了幾種已經(jīng)表征過(guò)的過(guò)敏性蛋白,顯示了蛋白組學(xué)技術(shù)在食物過(guò)敏事件的監(jiān)督中具有很大的潛能。

近年來(lái),隨著我國(guó)市場(chǎng)食品品種的豐富,加工手段的多樣化,食品添加劑的廣泛使用,食品真實(shí)性、品質(zhì)鑒定等問(wèn)題也逐漸凸現(xiàn)。如何快速鑒別食品的真、偽、優(yōu)、劣和品質(zhì)成為食品市場(chǎng)管理的重點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著科技的發(fā)展,假冒偽劣的手段也在不斷提高,仿真度極高的劣質(zhì)產(chǎn)品給檢驗(yàn)工作帶來(lái)了巨大的困難。因此,食品鑒偽已成為食品安全領(lǐng)域的關(guān)注熱點(diǎn)。伴隨著DNA種質(zhì)鑒別等其他分子技術(shù)、同位素產(chǎn)地溯源技術(shù)等在食品鑒偽體系中的應(yīng)用和發(fā)展,蛋白組學(xué)也已被證明成為該領(lǐng)域的一個(gè)有力工具,尤其是在鑒別動(dòng)物的健康狀況,繁殖和屠宰處理時(shí)所受刺激和污染的水平等方面[54]。Martinez等[67]綜述了蛋白組學(xué)方法與其他一些方法在食品鑒偽中的應(yīng)用進(jìn)展,指出蛋白質(zhì)組與基因組不同,基因組僅提供靜態(tài)信息,蛋白質(zhì)組則對(duì)某一生物或細(xì)胞在特定生理或病理狀態(tài)下表達(dá)的所有蛋白質(zhì)的特征、數(shù)量和功能進(jìn)行系統(tǒng)性的研究,能提供更多更全面的信息,這些信息不僅包括種屬方面的信息,還包括食品的新鮮程度和組織方面等信息。盡管 DNA鑒別技術(shù)在近期仍然會(huì)是種屬鑒別的主要技術(shù),發(fā)展迅速的蛋白組學(xué)技術(shù)將在食品鑒偽領(lǐng)域逐漸發(fā)揮其其商業(yè)價(jià)值。在很多情況下,僅通過(guò)肉眼觀察 2– DE圖上蛋白質(zhì)組的差異,即可把種屬關(guān)系很近的兩種魚類區(qū)分開(kāi)來(lái)。

4 前景與展望

蛋白質(zhì)組學(xué)解決了在蛋白質(zhì)水平上大規(guī)模直接研究基因功能的問(wèn)題,是通過(guò)生化途徑研究蛋白質(zhì)功能的重大突破。蛋白組學(xué)能夠提供參與決定食品種屬、品質(zhì)、功能與安全性的各種生理機(jī)制過(guò)程中的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能等方面的更多信息,作為專門的技術(shù)體系已廣泛用于食品科學(xué)研究領(lǐng)域,為食品科學(xué)研究提供了嶄新的思路和技術(shù),并極大地拓展了食品科學(xué)的研究領(lǐng)域和促進(jìn)了食品科學(xué)的快速發(fā)展,將成為食品品質(zhì)研究的一個(gè)高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究平臺(tái)。當(dāng)然基因和蛋白質(zhì)不會(huì)單獨(dú)地發(fā)揮作用,而是聯(lián)合成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)來(lái)產(chǎn)生細(xì)胞功能、組織、器官以及有機(jī)體。食品品質(zhì)是由多種因素間復(fù)雜的相互作用決定的,蛋白質(zhì)組只是用于分析的有力工具而不是解決食品品質(zhì)問(wèn)題的最終方法,要建立食品品質(zhì)的生物學(xué)標(biāo)記并將其運(yùn)用于食品原料、貯藏與加工等工藝過(guò)程,還需要多門學(xué)科如生理學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物信息學(xué)的跨學(xué)科合作以及與動(dòng)物生產(chǎn)和食品加工業(yè)的密切協(xié)作。

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Proteomics and itsApplication in Food Science Research

Li Xuepeng Li Jianrong Yu Ping Zhu Junli Wang Yanbo Fu Linglin
(Food Safety KeyLab of Zhejiang Province,College of Food Science and Biotechnology,Zhejiang GongshangUniversity,Hangzhou 310035)

Proteomic study is one of the main research task in post-genomic era.W ith rapid progress,pro2 teomic technology is now often cited as a promising tool,which could resolve numerous problems in the field of life science,including food quality and safety.Providing new thoughts and techniques for research,proteomics has been widely used in the field of food science.In this paper,the core of proteomic technology,namely separation of pro2 teins,identification ofproteins,prediction ofprotein structure and function by protein bioinformatics,are introduced,present application of proteomic technology in food science research are reviewed,and the application foreground of proteonics is prospected.

proteomics,t wo-dimensional electrophoresis,mass spectrometry,protein bioinfor matics,food science,application

Q51

A

1003-0174(2010)02-0141-09

國(guó)家“863”重點(diǎn)項(xiàng)目(2007AA091806)

2009-03-16

李學(xué)鵬,男,1982年出生,博士,食品生物技術(shù)

勵(lì)建榮,男,1964年出生,教授,博士生導(dǎo)師,食品貯藏加工與安全控制、食品生物技術(shù)