巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷中的作用

趙小勇 程雪燕 田新 邵磊 石書偉 莫小華

·論著·

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子在大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷中的作用

趙小勇 程雪燕 田新 邵磊 石書偉 莫小華

目的檢測急性壞死性胰腺炎(severe acute pancreatitis, ANP)大鼠肺組織巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)mRAN表達(dá)及TNF-α含量，探討它們在ANP肺損傷中的作用機(jī)制。方法40只SD大鼠隨機(jī)分成對(duì)照組及ANP 3、6、12 h組。采用5%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g體重)膽胰管逆行注射方法制備ANP模型。取血檢測血清淀粉酶。取胰腺組織和肺組織行病理學(xué)檢查，并稱重計(jì)算其濕/干重比。采用RT-PCR法檢測肺組織MIF mRNA表達(dá)，放免法測定肺組織TNF-α含量。結(jié)果ANP 組血淀粉酶、胰腺和肺組織濕/干重比顯著升高，病理損傷隨時(shí)間延長逐漸加重。ANP 3、6、12 h組肺組織TNF-α含量分別為(0.69±0.07)ng/ml、(1.64±0.10)ng/ml和(0.92±0.11)ng/ml；MIF mRNA表達(dá)量分別為1.97±0.09、2.55±0.23、3.29±0.26，均顯著高于對(duì)照組的(0.19±0.06)ng/ml和1.21±0.34(P值均lt;0.01)。肺組織MIFmRNA表達(dá)與肺組織病理損傷、肺濕/干重比、TNF-α含量均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.637、r=0.684、r=0.858，P值均lt;0.01。肺組織TNF-α含量與肺損傷、肺濕/干重比均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.540和r=0.421，P值均lt;0.01。結(jié)論ANP大鼠肺組織MIFmRNA過表達(dá)，TNF-α含量顯著增加，它們共同參與肺損傷的發(fā)生。

胰腺炎，急性壞死性； 肺損傷； 巨噬細(xì)胞游走抑制因子； 腫瘤壞死因子α

約1/3的重癥急性胰腺炎(SAP)患者會(huì)發(fā)展到急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory dysfunction syndrome,ARDS)，約60%的患者在SAP發(fā)病的第一周因ALI/ARDS病死[1]。因此，探討SAP并發(fā)ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制對(duì)于降低SAP患者病死率有重要意義。

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子( macrophage migration inhibitory factor,MIF)廣泛分布于腦垂體、肺臟、肝臟、腎上腺、子宮等部位，其主要功能是抑制巨噬細(xì)胞游走，促進(jìn)其在炎癥局部浸潤，并分泌多種細(xì)胞因子。它也是糖皮質(zhì)激素抗炎作用的內(nèi)源性拮抗物[2]，在ALI/ARDS的發(fā)病過程中起重要作用[3]。因此，本實(shí)驗(yàn)檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織MIF基因表達(dá)，探討其在ANP并發(fā)ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

成年SD大鼠40只，體重250～300 g，清潔級(jí)，雌雄不限，購自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照(3 h)組,ANP 3、6、12 h組，每組10只。采用膽胰管逆行注射5%?；悄懰徕c(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重方法制備ANP模型。對(duì)照組僅翻動(dòng)胰腺后關(guān)腹。按各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取血，并取胰腺和肺組織。

二、觀察指標(biāo)及方法

1．血清淀粉酶：采用全自動(dòng)生化分析儀。

2．胰腺和肺組織濕/干重比：取胰腺體部和右肺下葉組織用電子稱稱其濕重，置于80℃烘箱烘烤24 h后稱其干重，計(jì)算胰腺、肺組織的濕/干重比。

3．胰腺和肺臟組織病理學(xué)檢查：取胰尾、右肺中葉組織，常規(guī)切片、HE染色。由病理科醫(yī)師閱片，并參考Schimidt等[4]標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胰腺進(jìn)行評(píng)分，參考 Osman等[5]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)肺組織評(píng)分。

4．肺組織TNF-α測定：取左肺新鮮組織，吸去血跡，稱重約400 mg,放入生理鹽水研磨制成勻漿，離心，取上清液于-20℃保存。采用TNF-α放射免疫試劑盒(天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司)檢測。

5．肺組織MIF mRNA檢測：取新鮮肺組織，在液氮中研磨成粉末，應(yīng)用RNA抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)抽取總RNA。應(yīng)用RT-PCR方法檢測MIF mRNA表達(dá)。MIF上游引物 5′-ATG-CCTATGTTCATCGTGAAC-3′，下游引物5′-GGC-TCAAGCGAAGGTGGAAC-3′，擴(kuò)增片斷341 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATG-3′，下游引物5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAG-3′，擴(kuò)增片斷349 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。先采用Revert AidTM First Strand CDNA Systhesis Kit(Fermentas公司)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)： 95℃ 3 min，94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s，33個(gè)循環(huán)，最后72℃ 7 min。產(chǎn)物經(jīng)電泳分離，圖像自動(dòng)捕獲系統(tǒng)掃描，以MIF與β-actin電泳帶灰度值之比作為mRNA表達(dá)的相對(duì)值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、血清淀粉酶活性變化

對(duì)照組血淀粉酶活性為(524.10±122.92)U/L，ANP 3、6、12 h組分別為(4365.20±884.37)U/L、(9019.70±7383.15)U/L和(11534.90±7165.35)U/L，較正常對(duì)照組顯著升高(Plt;0.01)。

二、腹水量、胰腺濕/干重比及病理組織學(xué)改變

ANP 3、6、12 h組大鼠腹水量為(6.44±2.35)ml、(8.96±3.63)ml和(13.19±9.21)ml，均顯著多于對(duì)照組的(0.51±1.10)ml(P值均lt;0.01)；胰腺濕/干重比為6.53±0.73、8.25±0.83、10.44±0.96，均顯著高于對(duì)照組的4.36±0.36(P值均lt;0.01)。

對(duì)照組胰腺肉眼無明顯變化，光鏡見胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常(圖1a)。ANP 3 h組胰腺腫脹明顯，出現(xiàn)點(diǎn)片狀紫褐色壞死區(qū)；光鏡見腺泡間質(zhì)水腫，小葉間隙增大，有點(diǎn)灶狀壞死區(qū)，有少量炎細(xì)胞浸潤(圖1b)。6 h組胰腺質(zhì)地變硬，可見散在分布的皂化斑;光鏡見腺泡破壞，壞死區(qū)擴(kuò)大，有凝固性、脂肪性壞死(圖1c)。12 h胰腺有大片壞死灶，大網(wǎng)膜、腸系膜、腹后壁、腸壁可見大量黃色皂化斑；光鏡見腺泡小葉結(jié)構(gòu)破壞，血管破裂出血，壞死區(qū)有大量中性單核巨噬細(xì)胞浸潤(圖1d)。對(duì)照組和ANP 3、6、12 h組的胰腺病理評(píng)分分別為0.15±0.34、2.75±1.27、6.35±1.23、8.95±2.24，ANP各時(shí)間點(diǎn)組均較對(duì)照組顯著增加(Plt;0.01)。

三、肺組織濕/干重比及病理改變

對(duì)照組和ANP 3、6、12 h組的肺組織濕/干重比分別為4.24±0.25、5.61±9.62、6.90±0.53、8.45±0.80，ANP各組均較對(duì)照組顯著增加(Plt;0.01)。對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁完整 ，肺間質(zhì)無滲出(圖2a)。ANP 3 h組肺臟體積稍增大；鏡下見肺間質(zhì)增寬，充血水腫，有少量炎性細(xì)胞浸潤(圖2b)。6 h后肺體積增大更為顯著；光鏡下間質(zhì)明顯增寬，炎性細(xì)胞浸潤明顯增多，肺泡腔出血(圖2c)。12 h后肺間隔增寬，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)大量滲出物，肺泡腔塌陷，局灶性實(shí)變等(圖2d)。對(duì)照組和ANP 3、6、12 h組的肺病理評(píng)分分別為0.25±0.35、3.65±0.47、3.80±1.01、4.60±1.84，ANP各組均較對(duì)照組顯著增加(Plt;0.01)。

四、肺組織MIF mRNA表達(dá)

對(duì)照組肺MIF mRNA低水平表達(dá)，表達(dá)量為1.21±0.34。ANP 3、6、12 h的MIF mRNA，表達(dá)量分別為1.97±0.09、2.55±0.23、3.29±0.26，均較對(duì)照組顯著增加(P值均lt;0.01，圖3)。

五、肺組織TNF-α含量

對(duì)照組和ANP 3、6、12 h組肺組織TNF-α含量分別為(0.19±0.06)ng/ml、(0.69±0.07)ng/ml、(1.64±0.10) ng/ml和(0.92±0.11 )ng/ml，ANP各組較對(duì)照組顯著增加(P值均lt;0.01)。

六、相關(guān)性分析

肺組織MIF mRNA表達(dá)與肺組織病理損傷、肺濕/干重比、TNF-α含量均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.637、r=0.684、r=0.858，P值均lt;0.01。肺組織TNF-α含量與肺損傷，肺濕/干重比均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.540和r=0.421，P值均lt;0.01。

討 論

大量研究顯示，在急性胰腺炎發(fā)病早期即存在炎性細(xì)胞因子過度釋放和失控的全身炎癥反應(yīng)。TNF-α是ANP發(fā)病后較早產(chǎn)生的細(xì)胞因子，其升高的程度與胰腺損傷程度直接相關(guān)聯(lián)[6]。它也是引起ALI的啟動(dòng)因子[7]。徐軍等[8]和Norman等[9]報(bào)道ANP大鼠肺TNF-α含量隨制模時(shí)間延長不斷升高。Winder等[10]用TNF-α拮抗劑治療可明顯減輕肺水腫。本實(shí)驗(yàn)提示,ANP組肺組織TNF-α水平明顯高于對(duì)照組，于6 h達(dá)到高峰，后略有下降,且肺組織TNF-α水平與肺的損傷程度呈正相關(guān)，提示肺組織TNF-α參與肺損傷的發(fā)生。

圖1 對(duì)照組(a)和ANP 3(b)、6(c)、12 h(d)組胰腺組織病理改變(HE ×100)

圖2 對(duì)照組(a)和ANP 3(b)、6(c)、12 h(d)組肺組織病理改變(HE ×100)

圖3 對(duì)照組(1，2)及ANP 3 h(3,4)、6 h(5，6)、12 h(7.8)組肺組織β-actin mRNA和MIF mRNA的表達(dá)

巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)作為一種炎性細(xì)胞因子，一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素和一種催化酶，在炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。MIF能抑制巨噬細(xì)胞游走，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎癥局部浸潤、增生、激活及分泌一些細(xì)胞因子。ANP時(shí)，炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子刺激肺臟巨噬細(xì)胞活化，釋放MIF，MIF可刺激單核巨噬細(xì)胞釋放各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致ALI/ARDS。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著胰腺病變的加重，肺組織出現(xiàn)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞浸潤，MIF mRNA表達(dá)增加，并與肺損傷程度呈正相關(guān)，提示MIF介導(dǎo)了巨噬細(xì)胞在肺組織的浸潤，同時(shí)巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生MIF，形成正反饋，加重肺的損傷，與Donnelly等[11]的結(jié)果一致。Bernhagen等[12]用TNF-α誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放MIF，觀察到MIF反過來刺激巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，使用抗MIF抗體則可降低腹膜炎鼠血漿TNF-α水平，提示TNF-α和MIF協(xié)同作用于前炎癥反應(yīng)環(huán)路，致病情加重，預(yù)后不良。本組肺組織MIFmRNA表達(dá)與TNF-α水平同步升高，呈顯著正相關(guān)，也表明它們共同促進(jìn)ALI發(fā)生。

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2009-03-06)

(本文編輯：呂芳萍)

RoleofintrapulmonaryexpressionofMIFmRNAinacutelunginjuryofratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHAOXiao-yong,CHENGXue-yan,TIANXin,SHAOLei,SHIShu-wei,MOXiao-hua.

DepartmentofPancreaticSurgery,PeoplesHospitalofJiaozuo,Jiaozuo454002,China

MOXiao-hua，Email:mxh580@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of MIF mRNA and TNF-α in the lung tissue of rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) and explore their mechanism of action in acute lung injury during the course of ANP.MethodsA total of 40 Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (n=10 in each group): the sham operation (SO) group, ANP 3h group, 6h group, 12h group. The model of ANP was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate (0.1 ml/100 g) into the biliary and pancreatic duct. The level of serum amylase was determined; pancreatic and lung tissues were harvested for pathological examination, and wet/dry weight ratios were estimated. Intrapulmonary expression of MIF mRNA was assayed by semi-quantitative RT-PCR. TNF-α in pulmonary homogenate was measured by immunoradiometric assay.ResultsSerum amylase, wet/dry weight ratios of pancreatic and lung tissues all significantly increased, and pathological injuries aggravated with time in ANP groups. Levels of TNF-α in ANP 3h, 6h, 12h group were (0.69±0.107) ng/ml, (1.64±0.10) ng/ml and (0.92±0.11)ng/ml, and expression of MIF mRNA were 1.97±0.09, 2.55±0.23, 3.29±0.26, which were significantly higher than those in control group [(0.19±0.06)ng/ml, 1.21±0.34,Plt;0.01]. Intrapulmonary expression of MIF mRNA was positively associated with lung pathological injuries, wet/dry weight ratio, and TNF-α(r=0.637,r=0.684,r=0.858,Plt;0.01). Intrapulmonary levels of TNF-α was positively associated with lung pathological injuries, wet/dry weight ratio (r=0.540,r=0.421,Plt;0.01).ConclusionsMIF mRNA was over-expressed and level of TNF-α was significantly increased in pulmonary tissue in rats with ANP, and this may be one of the mechanisms in the pathogenesis of lung injury in ANP.

Pancreatitis,acute necrotizing; Lung injury; Macrophage migration-inhibitory factors; Tumor necrosis factor-alpha

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.012

云南省教育廳科研基金資助項(xiàng)目(5Z0314C)

454002 焦作，河南省焦作市人民醫(yī)院胰腺外科(趙小勇、程雪燕、田新、邵磊、石書偉)；云南省昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腹部微創(chuàng)外科(莫小華)

莫小華,Email:mxh580@yahoo.com