胰腺冷凍有效性和安全性的實驗研究

邱大衛(wèi) 牛立志 穆鋒 彭祥 周亮 李海波 李蓉蓉 徐克成 倪嘉瓚 蔣靈芝 胡以則 郝卓芳

·論著·

胰腺冷凍有效性和安全性的實驗研究

邱大衛(wèi) 牛立志 穆鋒 彭祥 周亮 李海波 李蓉蓉 徐克成 倪嘉瓚 蔣靈芝 胡以則 郝卓芳

目的觀察胰腺冷凍前后其血液生化指標和組織變化，為胰腺癌冷凍療法的開展提供依據(jù)。方法將15只正常豬分為深度冷凍組(5頭)、淺度冷凍組(5頭)、不冷凍組(3頭)和正常組(2頭)。麻醉后開腹暴露豬胰腺，將氬氦冷凍治療系統(tǒng)探針插入胰腺，深、淺冷凍組分別采用100%和10%的氬氣輸出功率，冷凍溫度分別為-130～-140℃和-110～120℃，形成直徑15～20 mm的冰球，然后輸入氦氣，復溫至10～20℃，維持3 min，重復冷凍-復溫一個循環(huán)。不冷凍組僅插入探針，正常組僅開腹、關(guān)腹。檢測實驗前后血淀粉酶、IL-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)含量，第7天處死動物取胰腺行光鏡及電鏡觀察。結(jié)果胰腺的冷凍部位呈黑褐色壞死區(qū)，與未冷凍組織有明確界限；鏡下見冷凍中心區(qū)及側(cè)中心區(qū)有明顯組織壞死，超微結(jié)構(gòu)全部被破壞、消失，線粒體斷嵴脫顆粒，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒。13頭(86.7%)豬術(shù)后血淀粉酶增高，多數(shù)在第6天降至正常。5頭豬(33.3%)血IL-6輕度增高。各組血清CRP水平均無明顯改變。所有實驗動物均健康存活直到被處死。結(jié)論冷凍對實驗動物胰腺組織有明確的致死性消融作用，該療法安全性良好,無嚴重并發(fā)癥。

胰腺腫瘤; 冷凍療法; 動物實驗； 有效性; 安全性

胰腺癌是惡性程度極高的腫瘤，治療十分困難，預(yù)后惡劣[1]。冷凍消融術(shù)可作為胰腺癌治療的良好選擇[2-3]。然而，有關(guān)冷凍對胰腺組織影響的實驗性研究鮮有報道。為此我們選擇豬作為實驗動物，觀察胰腺冷凍前后的臨床、血液生化指標和胰腺組織的變化，從而為胰腺癌冷凍療法的開展提供依據(jù)。

材料與方法

一、實驗動物及冷凍治療系統(tǒng)

15頭有健康合格證書的西藏小型豬，由南方醫(yī)科大學動物實驗中心提供，體重27～32 kg。平均30 kg。

冷凍治療系統(tǒng)采用EndocareTM CryoSurgical System (CA, USA)，包括主機和冷凍探針。該系統(tǒng)是根據(jù)焦爾定律設(shè)計，其原理是高壓氣體經(jīng)過狹窄的噴嘴進入探針尖端，壓力突然下降，不同的氣體在局部產(chǎn)生不同的溫度變化。氬氣引起溫度降低可達-160℃，氦氣可使溫度升高至67℃。

二、實驗分組及冷凍方法

15頭豬分為4組。深度冷凍組，5頭豬。用速眠新Ⅱ誘導后，以Isoflurane維持全身麻醉，開腹分離胰腺，直視下將直徑2 mm的冷凍探針插入胰體。以100%的氬氣輸出功率激活探針，針尖溫度顯示為-130～-140℃，待局部形成15～20 mm直徑的冰球(約5 min)后停輸氬氣，改輸氦氣復溫至10～20℃，維持3 min，重復以上冷凍-復溫一個循環(huán)。冰球形成后超聲圖像上見到以探針為中心向外逐漸擴大的強回光團，其后有大片無回聲區(qū)聲影，表示冷凍成功(圖 1)。于冷凍區(qū)中心置一縫線作為標記。拔針后針孔貼以粘有凝血酶的明膠海綿，關(guān)腹。淺度冷凍組，5頭豬。除以10%的氬氣輸出功率激活探針，針尖溫度顯示為-110～-120℃外，余同深度冷凍組。不冷凍組，3頭豬。僅將探針插入胰腺體，不予冷凍，維持10 min后，拔針,關(guān)腹。正常組，2頭豬。僅開腹，關(guān)腹。

三、觀察項目

1．行為表現(xiàn)：觀察15頭豬進食、活動等表現(xiàn)。

2．血淀粉酶、IL-6、C反應(yīng)蛋白(CRP)測定：于實驗前當日及實驗后1、2、3、4、5、6、7 d采血，分離血清。采用蘇木氏法測定淀粉酶水平；采用固相ELISA法測定血IL-6及CRP含量。

3．胰腺病理檢查和電鏡觀察：實驗后7 d放血處死實驗豬，觀察胰腺及其周圍組織形態(tài)。深、淺冷凍組在冰球中心區(qū)、冰球與正常胰腺組織交界(冷凍邊緣)區(qū)及以上兩部位的中點(側(cè)中心區(qū))各取2塊組織標本，分別以10%甲醛和2.5%戊二醛固定，送光鏡和電鏡觀察。不冷凍組取離探針不同距離的胰腺組織、正常組取不同部位的胰腺標本行光鏡及電鏡觀察。

圖1胰腺冷凍前(左圖)、后(右圖)超聲波監(jiān)測。圓圈系冷凍靶點

結(jié) 果

一、行為表現(xiàn)

15頭豬在實驗期間進食與活動均無異常，未見出血傾向。

二、血淀粉酶、IL-6、CRP含量變化

15頭豬中13頭(86.7%)血淀粉酶增高。兩冷凍組多于實驗后第1天增高，第2～3天達高峰，然后下降，至第6天降至正常(圖2)。不冷凍組中1頭在實驗后第5天淀粉酶輕度增高，第7天尚未恢復正常。正常組2頭豬于術(shù)后第1天淀粉酶增高，一頭于第4天降至正常，另1頭第7天仍高水平。

深度冷凍組2頭分別于術(shù)后第1天、第7天，不冷凍組1頭于術(shù)后第1天及正常組2頭于術(shù)后第6天血IL-6輕度增高。不冷凍組的1頭于次日降至正常，余4頭在第7天仍維持在輕度增高水平。深度冷凍組平均IL-6水平最低，與正常對照組相似，淺度冷凍組和不冷凍組的IL-6水平較高(圖3)。各組血清CRP水平在實驗前后均無明顯改變。

圖2 實驗前后血清淀粉酶水平測定

圖3 實驗豬血清IL-6在實驗前后改變

三、胰腺組織病理學改變

深度、淺度冷凍組胰腺的冷凍部位與未冷凍組織有明確界限，冷凍中心區(qū)及側(cè)中心胰腺均有明顯壞死，其他部位無充血、水腫、出血等異常(圖4)。深度冷凍組中1頭在貼近胰腺冷凍區(qū)的結(jié)腸壁處有約2 cm×2 cm×3 cm的壞死區(qū),與周圍組織廣泛粘連，并有少許腹腔滲液。不冷凍組除于插針處隱約可見損傷痕跡外，全胰腺無明顯異常。

圖4 冷凍后第7天的胰腺

深度及淺度冷凍組中半數(shù)標本在壞死區(qū)有炎性細胞浸潤(圖5)。壞死及炎性征象以中心區(qū)病變較重，由中心向側(cè)中心區(qū)及邊緣區(qū)依次減輕。8頭豬在邊緣區(qū)出現(xiàn)肉芽組織增生；4頭在側(cè)中心區(qū)、2頭在中心區(qū)出現(xiàn)肉芽組織增生。此外，深度冷凍組中3頭及淺度冷凍組1頭豬有胰導管增生；深度冷凍組中1頭在邊緣區(qū)有血管炎性改變。深度冷凍組與淺度冷凍組的組織壞死程度無顯著差別。不冷凍組和正常組胰腺未見明顯異常。

四、胰腺組織超微結(jié)構(gòu)的變化

深度冷凍組及淺度冷凍組冷凍中心區(qū)的細胞全部壞死，所有超微結(jié)構(gòu)全部被破壞、消失；側(cè)中心區(qū)細胞大多數(shù)壞死，有極少數(shù)殘存的細胞核，核膜破裂，細胞器殘存，線粒體斷嵴脫顆粒，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；邊緣區(qū)多數(shù)細胞的細胞膜破裂，可見殘存的細胞核，細胞器豐富，有較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和分泌顆粒(圖5)。深度與淺度冷凍組的細胞器破壞程度無顯著差別。不冷凍組胰腺組織超微結(jié)構(gòu)正常。

圖5正常胰腺(a、e)及冷凍后第7天冷凍中心區(qū)(b、f)、側(cè)中心區(qū)(c、g)、邊緣區(qū)(d、h)的病理改變(HE ×10或 ×20)及超微結(jié)構(gòu)改變(×40000)

討 論

胰腺癌是全世界腫瘤相關(guān)性病死的主要原因之一，根治性切除是目前有效的治療手段。但能接受根治性手術(shù)的病例不超過10%～20%，即使行腫瘤切除，手術(shù)病死率也高達3%[4-5]。Kovach等[6]在1995年至1999年間給10例不能手術(shù)切除胰腺癌行術(shù)中治療冷凍，術(shù)后疼痛改善，無一例發(fā)生胰腺炎、胰瘺和其他并發(fā)癥。Korpan[7]采用冷凍治療胰腺癌患者均呈現(xiàn)良好反應(yīng)，無治療相關(guān)性并發(fā)癥或病死。徐克成等[3，8]自2001年起應(yīng)用超聲或CT引導下經(jīng)皮冷凍治療局部進展性胰腺癌49例，術(shù)后6例(12.2%)發(fā)生急性胰腺炎，3例(6.1%)腹腔出血，術(shù)后1、3年生存率分別為63.1%和9.5%，中位生存期16.2個月，最長一例迄今已生存52個月。

但是，應(yīng)用冷凍治療胰腺癌尚處于“嬰兒”階段，需要從實驗和臨床進一步觀察其有效性和安全性。Korpan[7]用20 mm直徑的盤狀探頭直接對狗胰腺進行冷凍，最低溫度為-180℃，持續(xù)9 min，作單個冷凍-復溫輪回。結(jié)果顯示冷凍后胰腺組織立即在探頭周圍形成冰球，界限清楚，直徑12 mm；幾小時后，冷凍區(qū)腫脹，邊緣發(fā)紅，發(fā)生無菌性壞死和血栓形成；4周后，冷凍區(qū)出現(xiàn)疏松結(jié)締組織，伴大量血管形成；9～12周后，局部出現(xiàn)緊密結(jié)締組織。本實驗冷凍溫度為-130～-140℃和-110～-120℃，冷凍時間僅5 min，結(jié)果顯示兩種溫度對胰腺組織損傷程度無顯著差別，提示冷凍治療胰腺癌可采用低功率、短時間和相對較高溫度，這樣既可保證有效的冷凍消融，又能減少對胰腺過度的創(chuàng)傷。

胰腺含有豐富的消化酶，胰腺損傷會引起急性胰腺炎、壞死和胰漏，導致嚴重后果。胰腺組織冷凍是否會引發(fā)嚴重并發(fā)癥，這是臨床上最為關(guān)注的問題。本實驗檢測了實驗前后血淀粉酶、IL-6及CRP水平，86.7%的豬在實驗后有不同程度的淀粉酶增高, 多數(shù)在6 d后降至正常。深度冷凍組IL-6最低，與正常對照組相似，淺度冷凍組和不冷凍組較高；全部4組的血清CRP水平在實驗期間均無明顯改變；臨床觀察所有實驗豬均無異樣；第7天開腹時，兩冷凍組胰腺均無急性胰腺炎和胰漏的表現(xiàn)，說明胰腺冷凍是安全的。

為了達到對靶組織完全消融，臨床上對肝癌實施治療時，常將冷凍范圍超過腫瘤邊緣至少1 cm，即有“1 cm安全邊緣”之稱[9-11]。但由于胰腺體積小，冷凍時可能難以保證“1 cm安全邊緣”。因此對胰腺癌的冷凍是否需超過腫瘤1 cm值得進一步研究。

如同任何手術(shù)一樣，胰腺冷凍治療的安全性也與手術(shù)操作有密切關(guān)系。本實驗深度冷凍組有一頭豬在貼近胰腺冷凍區(qū)的結(jié)腸壁有局限性壞死區(qū)，顯然與冷凍過深有關(guān)。因此，在進行冷凍治療胰腺癌時，特別是在經(jīng)皮冷凍時，精確定位和恰當冷凍十分重要。

[1] Ducreux M,Boige V,Malka D.Treatment of advanced pancreatic cancer.Semin Oncol,2007,34:S25-S30.

[2] Korpan NN.Cryosurgery in the 21st Century∥Korpan NN.Wien-NewYork:Springer,2001：3-8.

[3] 徐克成, 胡以則，牛立志,等.胰腺癌∥徐克成,牛立志.腫瘤冷凍治療學.上海:上?？萍冀逃霭嫔?2007：218-225.

[4] Limongelli P,Khorsandi SE,Pai M,et al.Management of delayed postoperative hemorrhage after pancreaticoduodenectomy:a meta-analysis.Arch Surg,2008,143:1001-1007.

[5] Vin Y,Sima CS,Getrajdman GI, et al. Management and outcomes of postpancreatectomy fistula,leak,and abscess: results of 908 patients resected at a single institution between 2000 and 2005.J Am Coll Surg,2008,207:490-498.

[6] Kovach SJ,Hendrickson RJ,Cappadona CR,et al.Cryoablation of unresectable pancreatic cancer.Surgery,2002,131:463-464.

[7] Korpan NN.Pancreas cryosurgery∥Korpan NN.Basics of Cryosurgery.Wein NewYork:Springer-Verlag，2001:151-154.

[8] Xu KC,Niu LZ,Hu YZ,et al.A pilot study on combination of cryosurgery and (125)iodine seed implantation for treatment of locally advanced pancreatic cancer. World J Gastroenterol,2008,14:1603-1611.

[9] Popken F,Seifert JK,Dutkowski P,et al. Comparison of iceball diameter and temperature distribution achieved with 3-mm accuprobe cryoprobes in porcine and human liver tissue and human colorectal liver metastases in vitro.Cryobiology,2000,40:302-310.

[10] Mala T,Samset E,Aurdal L,et al.Magnetic resonance imaging estimated three dimensional temperature distribution in liver cryolesion:a study of cryolesion characteristics assumed necessary for tumor ablation.Cryobiology,2001,43:268-275.

[11] Seifert JK,Gerharz CD,Mattes F,et al.A Pig model of hepatic cryotherapy. In Vivo temperature distribution during freezing and histopathological changes.Cryobiology,2003,47:214-226.

2009-08-06)

(本文編輯：呂芳萍)

Efficacyandsafetyofpancreasfreezing

QIUDa-wei,NIULi-zhi,MUFeng,PENGXiang,ZHOULiang,LIHai-bo,LIRong-rong,XUKe-cheng,NIJia-zan,JIANGLing-zhi,HUYi-ze，HAOZhuo-fang.

DepartmentofOncology,FudaCancerHospitalofGuangzhou,Guangzhou510300,China

XUKe-cheng,Email:xukc@vip.163.com

ObjectiveTo observe the blood biochemical and histological changes before and after pancreas freezing, to provide evidence for cryosurgery for pancreatic cancer.MethodsFifteen healthy pigs were divided into deep frozen group (n=5), shallow frozen group (n=5), non-frozen group (n=3) and normal group (n=2). After anesthesia and laparotomy, a probe of the Argon-Helium Surgical System was inserted into the pancreas, 100% and 10% argon output power were used in deep and shallow frozen group, respectively; and the temperature were -130～-140℃ and -110～-120℃, respectively; which results in an ice-ball with 15～20 mm in diameter. Then helium gas was inputted to increase the temperature to 10～ 20℃ for three minutes; then the whole process was repeated. A probe was inserted into the pancreas in the non-frozen group only and only laparotomy was performed in non-grozen group normal group and normal group. Serum amylase, IL-6, CRP levels before and after the experiment was determined; the pigs were sacrificed at day 7 and the pancreas was harvested for light microscope and electron microscope examination.ResultsThe frozen pancreatic tissue became pitchy necrosis zone, and it could be distinguished from non-frozen tissue; there were obvious tissue necrosis in the center and para-center of frozen area, and the ultra-structure were destroyed and disappeared, mitochondria degranulation and rough endoplasmic reticulum degranulation were observed. Serum amylase was elevated in 13(86.7%) pigs and most returned to normal at 6th day. Serum IL-6 was slightly elevated in 5 (33.3%) pigs. There was no significant difference among all the groups in term of serum CRP. All the pigs were alive until the time of sacrifice.ConclusionsCryosurgery has affirmative fatal ablative effects on pancreatic tissue, and it is safe with no serious complications.

Pancreas neoplasms; Cryotherapy; Animal experimentation; Efficacy; Safety

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.017

510300 廣州，廣州復大腫瘤醫(yī)院腫瘤科(邱大衛(wèi)、牛立志、穆鋒、彭祥、周亮、李海波、李蓉蓉、徐克成)；深圳大學生命科學學院(倪嘉瓚、蔣靈芝)；廣州醫(yī)學院第二醫(yī)院(胡以則、郝卓芳)

徐克成，Email:xukc@vip.163.com