盧 穎 周 橋 仲 芳 郝 旭 李 聰 王偉銘 陳 楠

腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的重要因素,在腎臟病進(jìn)展過程中發(fā)揮著非常重要的作用[1,2]。研究表明,包括 IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白 1(MCP-1)在內(nèi)的趨化因子與腎間質(zhì)炎癥損傷有關(guān)[3-5]。在腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)過程中,腎小管上皮細(xì)胞既是受損傷細(xì)胞,同時(shí)也是分泌 IL-8和 MCP-1的主要細(xì)胞之一。 15-脫氧-Δ12,14-前列腺素 J2(15d-PGJ2)是過氧化物酶體增殖物激活受體 γ(peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)的天然激動(dòng)劑。近年來研究發(fā)現(xiàn),PPARγ激動(dòng)劑可減輕腎間質(zhì)炎癥反應(yīng),延緩腎間質(zhì)纖維化過程,而這一作用是否與抑制腎小管上皮細(xì)胞分泌趨化因子有關(guān)及相關(guān)分子機(jī)制未見報(bào)道。故本研究旨在觀察15d-PGJ2對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞趨化因子表達(dá)的影響,并探討其可能的機(jī)制。

材料與方法

材料

細(xì)胞 人近端腎小管上皮細(xì)胞系 HK-2(購自ATCC)。

試劑 Keratinocyte-SFM細(xì)胞培養(yǎng)液、Trizol提取液 、Opti-MEM(美國 GIBCO),15d-PGJ2(美國 Biomol),LPS(美國 Sigma),Human MCP-1、IL-8 ELISA試劑盒(美國 Biosource),EndoFree Plasmid Maxi Kit(10)(德國 QIAGEN),Rabbit polyclonal to p-IκB(sc-101713)(美國 Santa cruz),Goat anti-rabbit IgG(HPR標(biāo)記)、Goat anti-rabbit(羅丹明標(biāo)記)(美國 KPL),RT相關(guān)試劑(美國 Promega)、SYBR GREEN Mix試劑盒(日本TOYOBO公司 ),lipofectamineTM2000、pcDNAγ6.2-GW/EmGFPmiPPARγ/Control質(zhì)粒(美國 Invitrogen)。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

方法

細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞培養(yǎng)于 Keratinocyte-SFM細(xì)胞培養(yǎng)液中,置 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞分為(1)對(duì)照組(CON):不加任何刺激;(2)LPS組:LPS(1 μg/ml)刺激細(xì) 胞;(3)15d-PGJ2組:單純15d-PGJ2(5μM)作用于細(xì)胞;(4)15d-PGJ2+LPS組:15d-PGJ2(5μM)預(yù)處理 2h后加 LPS刺激。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 由 invitrogen公司合成四個(gè)干擾質(zhì)粒 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-miPPARγ編 號(hào) 為:mi043-1-3,mi043-2-1,mi043-3-3,mi043-4-2和一個(gè)陰性對(duì)照 micontrol。轉(zhuǎn)染前 1d,將 HK-2細(xì)胞接種于六孔板中,第二天細(xì)胞長至 60%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟如下:無菌 EP管中加入 Opti-MEM 250μl/管;每 EP管中加入質(zhì)粒 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-miPPARγ或 micontrol 2 μg,混勻;5 μl脂質(zhì)體加入 245μl Opti-MEM中,混勻,室溫放置5 min;250μl質(zhì)粒和 250μl脂質(zhì)體溶液緩慢混勻,室溫放置 20 min;吸棄六孔板內(nèi)培養(yǎng)液,Opti-MEM洗一遍,再加入 1.5 ml Opti-MEM;六孔板內(nèi)加入質(zhì)粒脂質(zhì)體復(fù)合物,緩慢搖勻;置于 37℃培養(yǎng)箱 6h后換普通培養(yǎng)液。上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。

Real-time QPCR 熒光染料法檢測(cè) MCP-1及IL-8的 mRNA轉(zhuǎn)錄水平:MCP-1上游 5′-CAGCCAGATGC AATCA ATGC-3′,下游 5′-G TGGTCCATGGAATCCTGAA-3′;IL-8 上游 5′-G AATTGAA TGG GTT TGCTA G A-3′;下游 5′-CACTGT GAGGTA A GATGGTGG-3′;GAPDH上游 5′-CAGGGC TGCTTTTAACTC TGG TAA-3′;下游 5′-GGGTGGAATCATATTGG AACATGT-3′。Real-time PCR擴(kuò)增按 TOKOBO SYBR GREEN Mix試劑盒說明書操作。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性 10 min,1個(gè)循環(huán);94℃變性 15s,62℃退火并延伸 30s,共 44個(gè)循環(huán) 72℃終末延伸 30s。每次實(shí)驗(yàn)設(shè)三復(fù)孔,獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

ELISA LPS刺激 20h后,采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中 IL-8水平?？谷薎L-8單抗包被酶標(biāo)板,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 IL-8與單抗結(jié)合。洗去未結(jié)合物,加入生物素化的抗人IL-8抗體,形成免疫復(fù)合物連接在板上,辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈親和素(streptavidin)與生物素結(jié)合。若反應(yīng)孔中有 IL-8,顯色劑呈現(xiàn)藍(lán)色,加中止液后變成黃色,在 450 nm處測(cè)吸光度值,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣品中 IL-8濃度。相同方法檢測(cè) MCP-1濃度。

免疫蛋白印跡 采用 Pierce公司的核蛋白抽提試劑盒提取 HK-2細(xì)胞的核蛋白,用 RIPA細(xì)胞蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白,并用 BCA法進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)樣品 30μg蛋白樣品經(jīng) 10%SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉 2h。加 p-IκB(1∶800)、β-actin(1∶5 000)抗體 4℃孵育過夜。以HRP標(biāo)記的 IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育 2h,洗膜后,加入發(fā)光底物顯色,LAS-4000成像儀自動(dòng)曝光顯影。計(jì)算機(jī)凝膠成像分析系統(tǒng)測(cè)定目的條帶與內(nèi)參照的吸光度值。

間接免疫熒光 LPS刺激 30 min后,吸凈培養(yǎng)液,預(yù)溫 PBS洗 5 min,3次;4%多聚甲醛 4℃固定0.5h;PBS洗 5 min,3次;0.2%TritonX-100室溫穿透細(xì)胞 5 min;PBS洗 5 min,3次;1%BSA室溫封閉1h;以 1∶50一抗,4℃孵育過夜;PBS洗 5 min,3次;以 1∶100比例加抗兔熒光二抗,37℃避光孵育 2h;PBS洗 5 min,3次;95%甘油封片,熒光顯微鏡觀察。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析,多樣本均數(shù)兩兩比較采用 q檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)由 SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié) 果

15d-PGJ2對(duì) LPS誘導(dǎo) HK-2細(xì)胞分泌 IL-8和MCP-1的影響 在 HK-2細(xì)胞中,與 CON組相比,單純 LPS刺激 4h使 IL-8、MCP-1mRNA分別升高(5.67 ±1.83)和(5.24 ±1.33)倍;若用 15d-PGJ2預(yù)處理 2h后再加 LPS刺激,與單純 LPS刺激 4h相比,IL-8、MCP-1mRNA分別下降 74.23%、79.42%。單純 LPS刺激 20h使培養(yǎng)上清中 IL-8、MCP-1分別升高 (1.62±0.12)和(2.25±0.40)倍,若用 15d-PGJ2預(yù)處理 2h再加 LPS刺激,與單純 LPS刺激 20h相比,培養(yǎng)上清中 IL-8、MCP-1可分別下降69.03%、49.44%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而單獨(dú)15d-PGJ2處理也可使上清中 IL-8、MCP-1的基礎(chǔ)表達(dá)分別下降 31.03%,55.07%(圖1)。

圖1 15d-PGJ2對(duì) LPS誘導(dǎo) HK-2細(xì)胞分泌 IL-8和 MCP-1的影響

不同 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-miPPARγ對(duì) PPARγ的沉默效率 在 HK-2細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染四個(gè)干擾質(zhì)粒 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-1-3,mi043-2-1,mi043-3-3,mi043-4-2和陰性對(duì)照micontrol質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染 36h時(shí)細(xì)胞中 PPARγ的 mRNA表達(dá)水平分別是未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞的 32.11%,22.17%,27.5%,35.86%,103.8%(圖 2a);轉(zhuǎn)染 60h后胞核中PPARγ的蛋白表達(dá)水平分別是未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞的43.62%,27.74%,35.62%,51.86%,100%,可見pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1質(zhì)粒對(duì) PPARγ沉默效率最高(圖 2b),在 mRNA和蛋白分別可達(dá)77.83%,72.26%,而 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol對(duì) PPARγ表達(dá)無明顯影響。

PPARγ對(duì) 15d-PGJ2抑制 LPS誘導(dǎo) IL-8和 MCP-1表達(dá)的影響 在 HK-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol質(zhì)粒 48h時(shí),單純 LPS刺激使IL-8、MCP-1mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加;若 15d-PGJ2預(yù)處理 2h后再加 LPS刺激,與單純 LPS刺激相比,細(xì)胞中 IL-8及 MCP-1mRNA分別下降 72.21%、68.37%;培養(yǎng)上清中IL-8及MCP-1分別下降 66.33%和 49.08%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在轉(zhuǎn)染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1質(zhì)粒的 HK-2細(xì)胞中,預(yù)先加入 15d-PGJ2處理 2h亦能顯著抑制 LPS所致的 IL-8、MCP-1表達(dá)的增加,與 LPS組相比,細(xì)胞中 IL-8、MCP-1mRNA分別下降了 59.21%、44.08%;培養(yǎng)上清中 IL-8、MCP-1分別下降了 47.11%、39.4%(均 P＜0.05)(圖3),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在 HK-2-pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1細(xì)胞中,PPARγ蛋白僅表達(dá) 27.74%,但 15d-PGJ2預(yù)處理2h仍然可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)趨化因子表達(dá),對(duì)IL-8和 MCP-1抑制作用分別是同組轉(zhuǎn)染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol細(xì)胞的 82.06%、65.47%(mRNA水平),71.39%、79.01%(蛋白水平)。

圖2 不同干擾質(zhì)粒對(duì) PPARγ沉默效率

PPARγ及 15d-PGJ2對(duì) LPS誘導(dǎo) NF-κB核易位的影響 免疫熒光檢測(cè)顯示,在轉(zhuǎn)染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol細(xì)胞中,細(xì)胞中 NF-κB表達(dá)量很少(圖 4a1),LPS刺激 30 min時(shí) NF-κB在胞核內(nèi)濃集(圖 4a2),15d-PGJ2預(yù)處理 2h可明顯抑制 LPS誘導(dǎo)的 NF-κB核易位 (圖4a4)。在轉(zhuǎn)染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1細(xì)胞中,雖然 PPARγ被沉默,但與 LPS組相比,15d-PGJ2預(yù)處理 2h仍能顯著抑制NF-κB核易位 (圖4b)。在 轉(zhuǎn) 染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol/043-2-1細(xì)胞中,與 CON組比較,單獨(dú)15d-PGJ2組細(xì)胞中 NF-κB表達(dá)顯著增加 ,但主要分布在胞質(zhì),胞核中很少(圖 4a3,4b3)。

15d-PGJ2對(duì) LPS誘導(dǎo)的 IκBα磷酸化的影響與 CON組比較,LPS組 IκBα磷酸化水平明顯升高(P＜0.05);在轉(zhuǎn)染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的 HK-2細(xì)胞中,與 LPS組相比,15d-PGJ2+LPS組胞質(zhì)中 p-IκBα顯著減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在轉(zhuǎn)染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1細(xì)胞中,15d-PGJ2預(yù)處理仍然可抑制 LPS誘導(dǎo)的 IκBα磷酸化,與同組轉(zhuǎn)染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒細(xì)胞相比無明顯差異(圖5)。

圖3 PPARγ對(duì) 15d-PGJ 2抑制 LPS誘導(dǎo) IL-8和 MCP-1表達(dá)的影響

圖4 PPARγ及 15d-PGJ 2對(duì) LPS誘導(dǎo) NF-κB核易位的影響

討 論

PPARγ是一類配體依賴性核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一,15d-PGJ2是其天然配基,最初的研究發(fā)現(xiàn)其在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化和胰島素敏感性方面發(fā)揮重要作用。近年來,在糖尿病腎病[6,7]和非糖尿病腎病動(dòng)物模型[8,9]中均發(fā)現(xiàn) PPARγ激動(dòng)劑可減輕腎間質(zhì)炎癥反應(yīng),延緩腎間質(zhì)纖維化過程,然而PPARγ激動(dòng)劑抑制腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)的具體分子機(jī)制尚未完全探明。有研究者發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠和5/6腎切除大鼠模型中,腎間質(zhì)中趨化因子 IL-8和MCP-1表達(dá)顯著增加[10-12]。Lehrke和 Lazar[13]認(rèn)為 MCP-1和 IL-8的表達(dá)上調(diào)與腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn) LPS刺激腎小管上皮細(xì)胞 4h后,細(xì)胞上清中 IL-8、MCP-1蛋白表達(dá)分別增加(1.62±0.12)、(2.25±0.4)倍,與以往研究相符[14,15]。而 15d-PGJ2預(yù)處理 2h可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的 IL-8和 MCP-1表達(dá)的增加。據(jù)此我們推測(cè) PPARγ激動(dòng)劑可能通過抑制腎小管上皮細(xì)胞分泌趨化因子 IL-8和 MCP-1,減少相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞(如單核/巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞)浸潤至腎間質(zhì),進(jìn)而降低相關(guān)的炎癥因子[如腫瘤壞死因子 α(TNF-α)、IL-1、IL-6等]和生長因子[如轉(zhuǎn)化生長因子 β(TGF-β)和血小板衍生生長因子(PDGF)等]表達(dá),從而減輕腎間質(zhì)炎癥損傷。

以往研究表明 PPARγ激動(dòng)劑對(duì)炎癥反應(yīng)的抑制作用包括依賴 PPARγ和不依賴 PPARγ兩個(gè)方面[16-18]。為了進(jìn)一步研究 15d-PGJ2對(duì) LPS誘導(dǎo)的趨化因子表達(dá)的影響是否依賴于 PPARγ,我們用siRNA干擾技術(shù)沉默 HK-2細(xì)胞中 PPARγ。在轉(zhuǎn)染pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi control的 HK-2細(xì)胞中,PPARγ正常表達(dá),15d-PGJ2預(yù)處理 2h可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的 IL-8和 MCP-1表達(dá);在轉(zhuǎn)染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-mi043-2-1質(zhì)粒 HK-2細(xì)胞中,PPARγ蛋白僅表達(dá) 27.74%,15d-PGJ2預(yù)處理 2h仍然可顯著抑制 LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞分泌 IL-8和MCP-1,其對(duì) IL-8和 MCP-1抑制作用分別是同組轉(zhuǎn)染 pcDNAγ6.2-GW/EmGFP-micontrol細(xì) 胞 的82.06%、65.47%(mRNA水平),71.39%、79.01%(蛋白水平)。故我們認(rèn)為 15d-PGJ2對(duì)趨化因子表達(dá)的抑制作用不完全依賴于 PPARγ。

圖5 15d-PGJ2抑制 LPS誘導(dǎo)的 IκBα磷酸化

LPS激活的炎癥通路中以NF-κB通路最為重要。LPS通過激活細(xì)胞膜表面 TLR4,活化 IKK激酶,使IκB磷酸化,進(jìn)而迅速泛素化降解,NF-κB被活化并易位至細(xì)胞核內(nèi),與靶基因上游調(diào)控序列相結(jié)合,激活下游基因轉(zhuǎn)錄[18,19]。本研究中,間接免疫熒光結(jié)果顯示 15d-PGJ2可通過不依賴于 PPARγ的方式抑制LPS誘導(dǎo)的 NF-κB核易位。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)15d-PGJ2可以通過不依賴于 PPARγ的方式抑制胞質(zhì)中 I-κB磷酸化,進(jìn)而抑制 NF-κB的核易位。據(jù)此我們認(rèn)為,15d-PGJ2進(jìn)入細(xì)胞后可直接抑制 I-κB磷酸化,減少 I-κB的泛素化降解,進(jìn)而抑制 NF-κB活化和核易位,從而減少下游IL-8和 MCP-1轉(zhuǎn)錄,且以上作用不依賴于核受體 PPARγ。此外,與 CON組比較,15d-PGJ2組的細(xì)胞中 NF-κB表達(dá)顯著增加,但主要分布在胞質(zhì),胞核中很少。我們推測(cè)這可能與 15d-PGJ2抑制趨化因子表達(dá),使得 NF-κB代償性增加有關(guān)。

綜上所述,本研究進(jìn)一步探明了 PPARγ激動(dòng)劑減輕腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制,即 PPARγ激動(dòng)劑15d-PGJ2能夠以不依賴核受體 PPARγ的方式抑制LPS誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞分泌趨化因子 IL-8和MCP-1,這一作用與抑制 IκB磷酸化有關(guān),這為PPARγ激動(dòng)劑干預(yù)腎臟炎癥提供了理論依據(jù)。

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