誘導性多能干細胞若干關鍵問題的研究進展*

李家速,趙宜香綜述,姚忠祥審校

(1.第三軍醫(yī)大學學員旅四隊,重慶400038;2.第三軍醫(yī)大學組織胚胎學教研室,重慶400038;3.中國藥科大學中藥學院09453班,江蘇南京211198)

2006年,Takahashi和Yamanaka[1]研究小組利用逆轉錄病毒將Oct3/4、Sox2、c-myc和 Klf4四個轉錄因子(four transcription factors,4TFs)導入小鼠已分化的成纖維母細胞,再應用小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell,ESc)培養(yǎng)條件將其去分化,重編程為誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPS)。iPS在形態(tài)結構、表面標志物、增殖分化和畸胎瘤形成等方面與ESc極為相似,因此,其在移植免疫排斥、干細胞治療、組織器官再生以及法律倫理學等方面極具優(yōu)勢。自此以后,iPS便成為多領域的研究熱點,在誘導的因子、載體安全性、效率等方面都取得了舉世矚目的成果。本文將對iPS誘導重編程的最新研究進展進行綜述。

1 誘導產生iPS的必要因子

Takahashi和Yamanaka[1]研究小組證實了4TFs的組合可以誘導iPS的產生,但誘導的效率較低,安全性方面也存在風險,因此這些轉錄因子是否具有可替代性,是否均為必要因子等問題還有待深入研究。

Yu等[2]利用慢病毒載體介導Oct4、Sox2、Nanog和Lin28 4種轉錄因子,成功誘導胎兒成纖維細胞轉化為具有人ESc特征的iPS;Zhou等[3]則利用腺病毒介導 Ngn3、Pdx1、M afa 3種轉錄因子轉染成年動物的胰腺外分泌細胞,成功轉化為胰島B細胞;而Huangfu等[4]只用 Oct4、Sox2就生成了人成纖維細胞的iPS,說明Oct4、Sox2在誘導重編程的過程中是必需的。Kim等[5-6]利用單個轉錄因子Oct4的異位表達,即人為操縱外源基因Oct4的導入和表達,成功誘導人胎兒神經干細胞轉化為iPS,證實Oct4在分子水平誘導多潛能性方面不僅是必要的而且是能夠勝任的,實現(xiàn)了單因子誘導iPS的創(chuàng)舉。Oct4是多能干細胞的標記物,被認為是只在多能干細胞中高水平表達的轉錄因子,通過外源性信號分子介導的信號轉導通路,與內源性轉錄因子Nanog、Sox2等共同組成基因調控網絡,以維持干細胞的多能性,因其作用的多樣性和表達的特異性而被認為是控制干細胞多能性的決定性因素[7]。通過逆轉錄病毒將Oct4導入胎兒神經干細胞,嵌入鼠內細胞群,并在人ESc條件下培養(yǎng),直到ESc樣克隆能被機械分離和進一步增殖分化,并通過多種篩選手段證實單因子Oct4誘導產生的該iPS無論是在基因表達譜、表觀遺傳學特征還是在體內外的全能性上,都與人ESc非常相似。這項成果將極大地推進對重編程機制的理解和制備患者特異性多潛能干細胞的研究。

有研究通過同時利用多種因子的不同組合重編程神經干細胞的細胞模型,證實Oct4和Klf4已經足夠誘導出神經干細胞的多潛能性[8]。但是由于所需外源因子個數(shù)不確定和重編程目標細胞的異質性等原因,重編程潛在的分子機制還是不完全明了。

2 低毒性或無毒性載體的使用

最早得到的iPS是經由原癌基因c-myc或其蛋白產物生成的,Klf4也牽涉致癌作用,而且是通過逆轉錄病毒、腺病毒及慢病毒來介導的,易導致外來因子異位表達整合入宿主細胞的基因組,存在變異、自身基因表達調節(jié)失調、移植后腫瘤形成等風險,從而阻礙其未來的臨床應用。最近的研究利用DNA轉座子、質粒及游離載體等,誘導成功后剔除外源性插入物,在iPS安全性方面取得了突破性進展。

Kaji等[9]以含有遺傳序列DNA片段的轉座子替代病毒作為多蛋白表達載體,在CAG增強子的驅動下,將串聯(lián)在2A寡肽序列上的4TFs同時導入鼠和人多能性標記物高表達的成纖維細胞,成功獲得iPS后又利用Cre重組酶瞬時轉染系統(tǒng),將外源性重組因子尤其是 c-myc切除,降低了致癌風險,極大地增強了iPS在再生醫(yī)學、藥物篩選和構建疾病模型等方面的應用性。此方法的優(yōu)點在于載體擁有自我剪切的能力,可以在移植后被剔除,但此途徑重組效率偏低,還有待進一步研究。

Soldner等[10]利用Cre重組酶在生成iPS后將外源性重組因子去除,盡管保持了iPS的可塑狀態(tài),但依舊不能避免殘余插入物導致的基因突變。Woltjen等[11]采用相似的不依賴病毒的單一化轉座子piggyBac表達載體,介導可誘導的特殊轉錄因子多西環(huán)素(doxycycline),易化導入宿主細胞基因組,產生穩(wěn)定的iPS;接著他們利用具有天然屬性的piggyBac系統(tǒng)轉座酶的瞬時表達,無痕跡地去除iPS的外源性插入物即致癌基因,從而使生成的iPS更安全和高效。

由此可見,2A寡肽序列的應用不僅使得誘導所需的轉錄因子在單一結構上遞送,而且使得外來結構的完全切除變得更加容易。這項新技術在加速重編程機制的深入研究和未來的細胞治療方面有重大意義。倘若與micro RNA、基因標記等技術結合起來,安全效果可能會更好。

Okita等[12-13]使用兩個質粒作為載體,一個質粒包含編碼Oct3/4、Klf4和Sox2的cDNAs,另一個含有編碼c-myc的cDNAs。前者連接在來自致病病毒的、可自行分裂的2A寡肽序列上,通過質粒反復轉染小鼠胚胎成纖維細胞,經PCR篩選,可獲得無功能性轉基因表達的iPS,移植入裸鼠可以生成畸胎瘤,以及促成成熟嵌合體。這種在質粒介導下生成iPS的方法,對闡明重編程和全能性的潛在機制意義重大。但此法的速度較慢,效率仍然較低,至于是否適用于其他組織器官和物種還有待于進一步研究。

Jia等[14]則在已有質粒編碼 POU5F1(即 OCT4)、SOX2、LIN28和NANOG的基礎上,外加一個GFP報告基因的2A序列,基于PhiC31的分子內重組系統(tǒng)除去或退化細菌質粒主鏈,再將其純化和分離,獲得minicircle載體,即一種具有超螺旋結構的DNA分子,誘導多潛能性的人脂肪干細胞,從而獲得無轉基因的人iPS。和單純質粒相比,由于外源性沉默機制活性的降低,此法具有更高的轉染率和異位基因表達能力,因此被認為可能是iPS生成的理想策略。Yu等[15]則使用無需整合的游離載體,生成的iPS完全脫離載體和轉基因序列,在增殖和分化潛能方面與人ESc十分相似。此外,選擇恰當?shù)捏w細胞也對誘導產生的iPS的安全性極為關鍵。Miura等[16]用11種途徑合成了36個鼠iPS,通過形成次級神經球(secondary neurospheres)來評估畸胎瘤形成的機制。為了搞清楚這些次級神經球在體內的表現(xiàn)特征,將這些次級神經球移植入實驗鼠大腦,并進一步解剖檢測畸胎瘤的形成。來自鼠ESc的3個克隆移植入34只鼠腦后,有3只死亡,其中1只形成畸胎瘤,發(fā)病率為2.9%;來自鼠胚胎樣成纖維細胞的12個iPS移植入100只鼠腦后,有33只形成大小不等的畸胎瘤,發(fā)病率為33.0%;而來自鼠尾尖成纖維細胞的11個iPS移植入55只鼠腦后,有46只形成畸胎瘤,發(fā)病率為83.6%;來自鼠肝細胞的7個iPS移植入36只鼠腦后,有13只死亡,其中 10只形成畸胎瘤,發(fā)病率為27.8%;而來自鼠胃上皮細胞的2個iPS移植入8只鼠腦內,沒有觀察到畸胎瘤。

上述數(shù)據顯示,由不同成體細胞衍生的iPS,生成的次級神經球在形成畸胎瘤的危險性上存在很大差異。因此,選擇何種體細胞來誘導產生iPS,是未來細胞治療面臨的嚴峻挑戰(zhàn)之一。同時,這項研究也驗證了Yamanaka[17]的隨機模型認為的,大部分乃至全部的分化細胞在導入4TFs后都有誘導為iPS的潛力。此外,研究還認為c-myc逆轉錄病毒的使用并不影響次級神經球畸胎瘤的形成傾向,而且也沒有檢測到c-myc或其他轉錄因子在iPS或次級神經球內的復活,但對于不同畸胎瘤形成傾向的潛在機制還有待進一步的研究。

3 高效誘導產生iPS的可能機制

可能由于外源因子使得組織干細胞變形、病毒整合入特定的基因組位點以及插入的拷貝數(shù)不確定等緣故,Yamanaka研究小組及以前的誘導iPS的研究成功率只有0.067%[1]。但隨著研究的深入,基因路徑阻斷劑、化學小分子抑制劑等的應用,在加速誘導進程、提高效率等方面發(fā)揮了重要作用。

Hong等[18]在抑制p53和缺乏逆轉錄病毒c-myc的條件下,轉染鼠胚胎成纖維細胞,經Nanog-GFP報告基因系統(tǒng)進行易感性和特異性鑒定,證實為iPS,轉化率提高了10%。同時證實在p53缺失背景下,可以將終末分化的T淋巴細胞去分化重編程為iPS。他們利用DNA微陣列技術(microarray),分析人和鼠的成纖維細胞中均受p53調節(jié)的34個共有基因,證明p53可以抑制細胞癌變。Aparicio和Eaves[19]則認為p53途徑在正常組織體內平衡和腫瘤形成的調控方面發(fā)揮重要作用。這在一定程度上說明,上述途徑雖然提高了轉化率,但也增加了新形成的iPS致癌風險。Marioán等[20]認為 p53介導的DNA損傷響應限制了重編程,從而確保了新形成的iPS基因組的完整性。在敲除p53的情況下,提高轉化率的同時,卻面臨著DNA損傷,并長期伴隨著iPS形成異常以及染色體異常等風險。因此,p53對預防來自欠佳的親本細胞的iPSDNA損傷具有重要作用。而且,只有當誘導DNA損傷的重組因子被引進后,p53途徑才會被激活,因此,避開DNA損傷的細胞不可能開啟p53途徑,而效率低的原因可能與被編程細胞的DNA損傷有密切關系。該研究同時發(fā)現(xiàn),由于端?？s短導致的DNA損傷增強的鼠成纖維細胞(G3 Terc2/2 M EFs)不能被誘導為iPS,盡管這些野生型細胞擁有正常的增殖速率和被癌基因轉染的能力,故而推測諸如縮短的端粒等可能是阻礙DNA損傷的野生型細胞被重編程的主要障礙。為了證實p53與DNA損傷的野生型細胞增殖的密切關系,在p53存在與缺失的情況下,利用Oct4、Klf4和Sox2重編程端?？s短了的野生型細胞來檢測p53的作用,經過反復誘導和比照,發(fā)現(xiàn)p53可能是通過限制翻譯,來阻礙誘導鼠和人DNA損傷的野生型細胞形成iPS,并通過p53依賴的細胞凋亡機制清除這些細胞,而且這種效應在功能失調的端?；蛲庠葱愿弑壤鼶NA損傷的野生型細胞將會惡化。數(shù)據顯示在這個過程中,p53對DNA損傷是致敏的,而且p53是通過介導多潛能性誘導階段的欠佳細胞的凋亡來限制重編程的,因此,可以認為p53在重編程和轉化這兩個過程中,對損傷細胞都發(fā)揮著重要的控制作用。但是,持久抑制p53會增強基因組的不穩(wěn)定性,因而會影響iPS的生成[21]。

Li等[22]證實INK4/ARF基因座的激活是iPS誘導過程中限制速率的又一障礙。通常情況下,INK4/ARF基因座是處于靜默狀態(tài)的,在誘導過程中被激活。研究證實,抑制INK4/ARF基因座的活性,對iPS誘導效率產生極大地正面效應,而同時抑制 p53和 INK4/ARF基因座的活性,則增強了細胞的自我更新能力,從而使體細胞的重編程變得容易[23]。

Lin等[24]利用 ALK5抑制劑SB431542和M EK抑制劑PD0325901提供的化學平臺,將誘導效率提高到常規(guī)方法的100多倍。常規(guī)方法用未經處理的、編碼4TFs的cDNAs轉染后,形成若干顆粒狀克隆,暗示其只是不完全的重編程克隆;在只有SB431542的情況下,同樣觀察到顆粒狀克隆,數(shù)目比人ESc樣克隆多幾倍;而在SB431542和PD0325901組合使用的情況下,顆粒狀克隆大大減少,人ESc樣克隆卻伴發(fā)性增加,說明此兩種抑制劑的組合可引導不完全重編程克隆狀態(tài)轉變?yōu)橥耆闹鼐幊炭寺顟B(tài),從此推進整個重編程進程。此外,經此兩種抑制劑處理過的cDNAs,7 d即可誘導出iPS,大大加速了重編程的動力學進程。進一步的研究還發(fā)現(xiàn),一種小分子Thiazovivin與SB431542和PD0325901混合后,能大大提高iPS分離后的存活率,獲得更多的重編程克隆。為了檢測Thiazovivin在高效分離的同時是否對SB431542和PD0325901組合產生促進作用,利用三者混合物再次誘導,發(fā)現(xiàn)誘導效率提高了近200倍,并縮短了轉化周期。

上述新方法的獨特之處在于調整了上游的信號途徑,而且能快速改進普通細胞類型的重編程,能夠為非病毒、非DNA依賴的更高效率和更安全的重編程進程提供基礎性平臺,從而為各種各樣的應用提供極其安全的人iPS。如果將前述的小分子抑制劑[24]和恰當?shù)墓w細胞類型策略[16]結合起來,效果可能會更上一層樓。

此外,蛋白質合成阻礙劑valproic acid(VPA)[25]、低氧環(huán)境[26]以及維生素C[27]同樣可以提高iPS的誘導效率,此方面的研究還在深入,前景誘人。

4 小 結

目前關于iPS的研究正如火如荼的進行著,在iPS誘導的原料、效率、安全性等方面都取得了可喜的進展。此外,在iPS的全能性、臨床應用等方面也收獲甚大。通過四倍體囊胚注射方法證實iPS全能性的小鼠已經誕生,還有誘導產生患者特異性iPS的報道,在原材料的獲取、移植免疫排斥、干細胞研究,退行性或損傷性疾病等方面優(yōu)勢顯著。但總體而言,誘導的效率還有待提高,安全性還需改進,遺傳學的穩(wěn)定性及后續(xù)變化證據尚顯不足,誘導極具多潛能性的耕作動物細胞(如牛、馬等)的研究才剛起步(已經培養(yǎng)出豬源iPS系),重編程的分子調控機制目前還不是很清楚,因此,iPS應用于臨床實踐還為時尚早。但相信,隨著研究的深入,iPS所具有的優(yōu)勢在自體細胞替代治療、再生醫(yī)學、發(fā)育生物學、藥物開發(fā)、疾病模型等方面的臨床應用前景是廣闊的,必將給相關疾病的患者帶來福音。

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