鋅依賴的組蛋白去乙?；高x擇性抑制劑研究進展

劉紅椿，杜曉光，耿美玉，

近年來，組蛋白去乙酰化酶(HDAC)作為藥物靶點吸引了眾多的關注，并且已經(jīng)有HDAC抑制劑Vorinostat和Depsipeptide被美國FDA批準以皮膚T淋巴細胞瘤(CTCL)為適應癥而上市應用［1］，在實體瘤治療中的應用也處于臨床試驗階段。這標志著HDAC作為新穎藥物靶標的概念驗證性研究階段的結束，也預示著HDAC抑制劑作為抗腫瘤藥物具有廣闊的開發(fā)前景。

盡管目前關于HDAC抑制劑的設計研究及作用機制研究越來越多，但是HDAC抑制劑抗腫瘤作用的明確機制尚未闡明。目前人們提出的作用機制很多，包括促凋亡、促分化、細胞周期阻滯、抑制DNA損傷修復、上調(diào)腫瘤抑制基因、下調(diào)生長因子、氧化應激等等［2－5］，但這些作用機制往往依賴于細胞類型、實驗條件及特定的化合物。這種多個作用機制現(xiàn)象的出現(xiàn)要歸因于表觀遺傳變化的廣泛性，如組蛋白的乙?；腿ヒ阴；軌蛴绊懚喾N基因的轉錄。更重要的是，HDACs不僅僅能夠催化組蛋白的去乙?；?，而且能夠催化其他一些重要蛋白(如Hsp90、Tubulin等)和轉錄因子(p53、STAT1等)的乙?；，F(xiàn)有的HDAC抑制劑如Vorinostat及其他一些處于臨床研究的侯選化合物往往是泛抑制劑［6］，能同時抑制多個HDAC家族成員。而這些不同亞型的HDAC往往具有不同的定位，在細胞功能調(diào)控上發(fā)揮著不同的作用，并且與不同的疾病類型相關［7－8］。這種作用機制的廣泛性使得 HDAC 泛抑制劑如 Vorinostat、TSA、Belinostat、Panobinostat、LAQ824、JNJ-26481585等會破壞多個依賴于蛋白乙?；募毎麅?nèi)過程，不僅影響腫瘤的生長和轉移［9］，而且會干擾正常的生理功能，使得HDAC泛抑制劑存在潛在的毒副作用。

因此選擇性的HDAC抑制劑不僅能夠降低毒副作用，而且能為各亞型的生物學功能研究提供探針，具有深遠的意義。本文將對HDAC選擇性抑制劑進行綜述。

1 HDAC家族主要成員的定位和功能

HDAC是一個大的酶家族，其成員目前已知有18個不同的亞型，按種系分為 4 大類:Ⅰ(HDAC 1、2、3、8)、Ⅱ(HDAC 4、5、6、7、9、10)、Ⅲ(SIRT1-SIRT7)和Ⅳ(HDAC 11)［10］。其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ為經(jīng)典家族，是 Zn2+－依賴性的HDAC，而Ⅲ屬于Sirtuin家族，是NAD+－依賴的HDAC。目前臨床研究的絕大多數(shù)HDAC抑制劑能夠抑制HDAC的多個亞型，這些亞型往往屬于Zn2+－依賴性的HDAC家族。而針對NAD+－依賴的HDAC的抑制劑目前研究較少，在此不予涉及。

不同亞型HDAC通常具有不同的基因表達模式、細胞定位和生物學功能。目前研究發(fā)現(xiàn)［11］，HDAC 1、2、3主要定位在細胞核內(nèi)，在多種組織細胞中表達，并在多種腫瘤細胞中過表達，且與不良預后有關。HDAC 6主要定位于細胞質，而HDAC 4、5、7和9主要穿梭于細胞核與細胞質之間，只在部分組織細胞中表達，但是有研究表明，HDAC5的表達預示著較好的預后，這提示在腫瘤治療中最好不要抑制此類HDAC亞型。研究表明，在不同類型的腫瘤中HDAC的表達亞型和表達量不同。這種腫瘤選擇性的HDAC表達是亞型選擇性HDAC抑制劑應用的病理學基礎，也提示HDAC抑制劑的選擇性不僅能增強藥效，而且能降低毒副作用。這些發(fā)現(xiàn)也是促使人們開發(fā)選擇性HDAC抑制劑的原因之一。見Tab 1。

2HDAC選擇性抑制劑

應用RNA干擾技術和動物基因敲除技術研究顯示，Ⅰ類和Ⅱa類中的一些HDAC亞型，可能是抗腫瘤作用相關的靶標。其中對HDAC 1、2、3的抑制會引起細胞周期阻滯，產(chǎn)生細胞增殖抑制作用［15］;對HDAC 4的抑制會影響DNA損傷修復的過程［16］;對HDAC 6的抑制會影響Tubulin的乙酰化，降低腫瘤細胞的轉移能力［17］等。隨著HDAC各個亞型的具體調(diào)控機制、生物學功能以及與腫瘤類型關系的深入研究，有針對地選擇某些HDAC亞型的選擇性抑制劑對個體化治療具有重要意義，也將更受人們的青睞。

2.1 HDAC1選擇性抑制劑 HDAC 1是1996年由美國哈佛大學Taunton等［18］發(fā)現(xiàn)的第一個哺乳動物的組蛋白去乙?；?，它是多種蛋白質復合物的催化亞單位，參與組蛋白和非組蛋白的去乙?；?。HDAC 1的表達在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和胃腸道癌等都有明顯升高，被認為是肺癌、乳腺癌的預后指標［10］。研究發(fā)現(xiàn)［19］，HDAC 1 能調(diào)控周期相關蛋白的轉錄，HDAC 1的抑制主要通過上調(diào)p21的表達導致細胞周期的阻滯。

MS-275是1999年由 Suzuki等［20］合成的苯甲酰胺類HDAC 1抑制劑。與泛抑制劑的作用機制不同，MS-275不是以Zn2+為結合靶標，而是以活性口袋最狹窄的部位Phe141和Phe198相對的2個苯環(huán)為靶點，阻塞了HDAC的生理底物(組蛋白N端Lys乙?；瘋孺?伸向催化中心的通道，因此其對亞型選擇性明顯好于Zn2+為結合靶點的抑制劑。MS-275通過增加腫瘤細胞中周期阻滯蛋白p21的水平，抑制細胞增殖，促進細胞分化，在動物實驗中口服抗腫瘤活性好而且毒副作用低［21］。目前該藥物正在美國進行白血病及實體瘤的臨床Ⅱ期研究。另外，臨床研究表明，MS-275與DNA甲基轉移酶抑制劑5-阿扎胞苷聯(lián)用，對第一次化療失敗的高分化的非小細胞肺癌患者有治療作用，顯示了良好的抗腫瘤作用。

2.2 HDAC1/2選擇性抑制劑 HDAC 2與HDAC 1具有高達82%的同源性，且二者的作用機制相似，單獨酶不具有HDAC活性，必須與輔因子形成復合物才能有去乙?；富钚浴DAC 1和HDAC 2可直接與DNA結合蛋白如YY1、SP1等結合。HDAC 2在抑制凋亡中具有重要作用［19］。

2.2.1 Depsipeptide Depsipeptide，又名 FK228、FR901228、NSC630176，是一來源于天然產(chǎn)物的環(huán)肽類化合物，其對HDAC 1和HDAC 2的選擇性相似。計算機模擬的結果表明，Depsipeptide的硫醇基團可以通過一個水分子與Zn2+結合［22］。Depsipeptide對多種血液腫瘤和實體瘤都具有明顯的殺傷作用。目前Depsipeptide已經(jīng)獲得FDA批準用于皮膚T細胞淋巴瘤的治療，其針對慢性淋巴細胞白血病、急性髓樣白血病和其他實體瘤的研究正處于臨床階段［23］。

Tab 1 Properties of zinc dependant HDACs

2.2.2 MGCD103 MGCD0103是一種新型的苯氨基苯甲酰胺類HDAC抑制劑［24］。MGCD0103可以抑制多種腫瘤細胞的生長，比泛抑制劑SAHA和HDAC 1特異性抑制劑MS-275的增殖抑制活性更強［24］。而另有研究表明［25］，MGCD0103主要抑制HDAC 1的活性，同時對HDAC 2、3、11都有一定的抑制作用，故其選擇性還有待進一步的驗證。MGCD0103口服有效，且顯示了良好的藥效和藥代動力學特性，目前正處于多項Ⅱ期臨床研究，是治療血液學疾病和淋巴組織增生疾病的一個比較有前景的化合物［26］。

2.3 HDAC 8選擇性抑制劑 Buggy等［27］在2000年發(fā)現(xiàn)了HDAC的第8個成員——HDAC 8，其在心臟、肺、腎臟和胰腺中均有表達，在肝中的表達量最高。HDAC 8與HDAC 3的同源性最高，達到34%。Knockdown實驗表明HDAC 8對細胞增殖是必須的［28］。HDAC 8在神經(jīng)細胞瘤中有異常表達，選擇性地抑制其活性，可誘導神經(jīng)細胞瘤的分化［13］，提示應用選擇性HDAC 8抑制劑可治療神經(jīng)細胞瘤。

PCI-34051是一個低分子量的異羥肟酸類化合物，能特異性抑制HDAC 8的活性。通過激活PLCγ，PCI-34051能夠誘導T淋巴瘤細胞和白血病細胞發(fā)生caspase依賴性的凋亡，但是對其他造血細胞和實體瘤細胞無明顯影響［29］，提示PCI-34051可能發(fā)展成為一個高效低毒選擇性強的T細胞惡性腫瘤的治療藥物。

2.4 HDAC6選擇性抑制劑 HDAC6屬于ClassⅡb，其獨特之處是擁有兩個催化區(qū)域:一個起始于第215位氨基酸，另一個起始于第610位，兩個催化區(qū)高度同源，而且均含有一個與泛素結合的鋅指結構區(qū)。正常生理條件下，HDAC 6在心、肝、腎、胰等臟器中高表達［30］，而在食道癌［31］和口腔鱗狀上皮細胞癌中過表達。選擇性抑制HDAC 6對細胞的存活影響不大，但是可以明顯增加tubulin和HSP90的乙?；剑?2－33］，從而降低細胞的運動能力和加速HSP90客戶蛋白的降解。代謝活躍的細胞尤其是腫瘤細胞中產(chǎn)生了大量錯誤折疊蛋白，HDAC 6能促進錯誤折疊蛋白降解，故HDAC 6的選擇性抑制可以嚴重地破壞細胞處理錯誤折疊蛋白的能力，導致細胞內(nèi)的蛋白“垃圾”迅速積累，進而誘發(fā)腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞沒有明顯影響，因此近期HDAC 6的選擇性抑制劑備受關注。

2.4.1 Tubacin Tubacin是 Schreiber領導的研究組通過對7392種小分子的篩選得到的HDAC 6的抑制劑，其抑制了哺乳動物細胞的tubulin去乙酰化，但是對組蛋白的乙?；?、基因轉錄和細胞周期進程沒有影響，tubacin能增加tubulin的乙?；?，雖然不影響tubulin的穩(wěn)定性，但是能夠降低細胞的運動性［17］。另外tubacin并不抑制Hsp90的去乙?；崾総ubacin可能特異性抑制HDAC6-SIRT2復合物的形成，而該復合物負責tubulin的去乙酰化［34］。

2.4.2 5-Aryl-2-(trifluoroacetyl)thiophene 該化合物是由Ontoria等［35］研究的HDAC抑制劑，對HDAC 4和HDAC 6的選擇性較好，其抑制HDAC 4和HDAC 6的IC50值分別為310 nmol·L－1和 70 nmol·L－1，對 HDAC 1 的 IC50比 HDAC 6 強40多倍，而且對實體瘤細胞抑制效果較好。

2.4.3 含吡啶丙氨酸的羥肟酸類化合物 Schafer等［36］研究發(fā)現(xiàn)在羥肟酸上進行吡啶丙氨酸修飾，可以得到選擇性的HDAC 6抑制劑5a，其對HDAC 1的IC50是HDAC 6的25倍左右，在細胞水平能夠升高tubulin的乙?；剑鋵δ[瘤細胞的細胞毒活性較HDAC泛抑制劑弱，與蛋白酶體抑制劑硼替佐米有協(xié)同致死作用，提示聯(lián)合用藥可作為其應用的一種策略。

上述的亞型選擇性HDAC抑制劑，從嚴格意義上講，并不具有絕對的選擇性。一方面是由于HDAC各亞型在很大程度上的同源性，既照顧到抑制活性又兼顧選擇性難度較大;另一方面現(xiàn)有的抑制劑在分子水平的酶活評價時，僅有少數(shù)能在11個HDAC亞型上進行全面評價，大多數(shù)化合物僅選用若干HDAC酶進行篩選，所得數(shù)據(jù)不能完全確定其亞型選擇性，因此全面篩選是亞型選擇性抑制劑開發(fā)和評測的重要指標。

3 展望

Tab 2 Inhibitors activity toward HDAC enzymes

目前各種HDAC亞型的特異生物學功能、選擇性表達的腫瘤類型等都沒有完全闡釋清楚，但是結合已有的研究成果可以預測亞型選擇性的HDAC抑制劑擁有明顯的優(yōu)勢，如對腫瘤組織選擇性高、毒副作用較低、可與靶向藥物的聯(lián)合應用［37］等，因此亞型選擇性的HDAC抑制劑是各大研究機構和藥廠開發(fā)的目標。盡管目前有很多HDAC的抑制劑處于不同的研發(fā)階段，但是受限于HADC亞型的同源性較高，且大多數(shù)亞型沒有晶體結構，選擇性的HADC抑制劑數(shù)量還是相當有限的，而且亞型絕對選擇性的抑制劑更是罕見。隨著HDAC亞型生物學研究的深入、晶體結構的健全和完善以及計算機模擬的合理化設計，更多的亞型選擇性的HDAC抑制劑將會涌現(xiàn)出來。

［1］ Shabason J E，Tofilon P J，Camphausen K.HDAC inhibitors in cancer care［J］.Oncol(Williston Park)，2010，24(2):180 －5.

［2］ Rosato R R，Grant S.Histone deacetylase inhibitors:insights into mechanisms of lethality［J］.Expert Opin Ther Targets，2005，9(4):809－24.

［3］ Xu W S，Parmigiani R B，Marks P A.Histone deacetylase inhibitors:molecular mechanisms of action［J］.Oncogene，2007，26(37):5541－52.

［4］ Bolden J E，Peart M J，Johnstone R W.Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5(9):769－84.

［5］ Glaser K B.HDAC inhibitors:clinical update and mechanismbased potential［J］.Biochem Pharmacol，2007，74(5):659 －71.

［6］ 李新剛，吳 青.TSA抑制NB4細胞去乙?；富钚圆⒋龠M細胞周期素激酶抑制劑表達［J］.中國藥理學通報，2005，21(2):165－8.

［6］ Li X G，Wu Q.The inhibition of histone deacetylase and expression promotion of cyclin dependent kinase inhibitor in raji cells by trichostatin A［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(2):165 －8.

［7］ 唐麗琴，魏 偉.組蛋白去乙?；敢种苿┡c炎癥免疫性疾病［J］.中國藥理學通報，2007，24(1):1 －4.

［7］ Tang L Q，Wei W.Histone deacetylase inhibitors and inflammatoryimmune diseases［J］.Chin Pharmacol Bull，2007，24(1):1 －4.

［8］ 孟 玫，姜軍梅，尹曉燕，等.苯丁酸鈉對兩種人肝癌細胞抑癌基因表達的影響［J］.中國藥理學通報，2005，21(11):1406－7.

［8］ Meng M，Jiang J M，Yin X Y，et al.Effects of Sodium phenylbutyrate on differentiation and induction of antigene in human liver carcinoma cell lines［J］.Chin Pharmacol Bull，2005，21(11):1406－7.

［9］ Yasui W，Oue N，Ono S，et al.Histone acetylation and gastrointestinal carcinogenesis［J］.Ann N Y Acad Sci，2003，983:220 －31.

［10］Bertrand P.Inside HDAC with HDAC inhibitors［J］.Eur J Med Chem，2010，45(6):2095 －116.

［11］Weichert W，Roske A，Gekeler V，et al.Association of patterns of class I histone deacetylase expression with patient prognosis in gastric cancer:a retrospective analysis［J］.Lancet Oncol，2008，9(2):139－48.

［12］Bolden J E，Peart M J，Johnstone R W.Anticancer activities of histone deacetylase inhibitors［J］.Nat Rev Drug Discov，2006，5(9):769－84.

［13］Oehme I，Deubzer H E，Lodrini M，et al.Targeting of HDAC8 and investigational inhibitors in neuroblastoma［J］.Expert Opin Investig Drugs，2009，18(11):1605 －17.

［14］Sakuma T，Uzawa K，Onda T，et al.Aberrant expression of histone deacetylase 6 in oral squamous cell carcinoma［J］.Int J Oncol，2006，29(1):117 －24.

［15］Inoue S，Mai A，Dyer M J，et al.Inhibition of histone deacetylase class I but not classⅡis critical for the sensitization of leukemic cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand-induced apoptosis［J］.Cancer Res，2006，66(13):6785 －92.

［16］Kao G D，McKenna W G，Guenther M G，et al.Histone deacetylase 4 interacts with 53BP1 to mediate the DNA damage response［J］.J Cell Biol，2003，160(7):1017 －27.

［17］ Haggarty S J，Koeller K M，Wong J C，et al.Domain-selective small-molecule inhibitor of histone deacetylase 6(HDAC6)-mediated tubulin deacetylation［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(8):4389－94.

［18］ Taunton J，Hassig C A，Schreiber S L.A mammalian histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p［J］.Science，1996，272(5260):408 －11.

［19］Zhu P，Huber E，Kiefer F，et al.Specific and redundant functions of histone deacetylases in regulation of cell cycle and apoptosis［J］.Cell Cycle，2004，3(10):1240 －2.

［20］Suzuki T，Ando T，Tsuchiya K，et al.Synthesis and histone deacetylase inhibitory activity of new benzamide derivatives［J］.J Med Chem，1999，42(15):3001 －3.

［21］Saito A，Yamashita T，Mariko Y，et al.A synthetic inhibitor of histone deacetylase，MS-27-275，with marked in vivo antitumor activity against human tumors［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1999，96(8):4592－7.

［22］Furumai R，Matsuyama A，Kobashi N，et al.FK228(depsipeptide)as a natural prodrug that inhibits class I histone deacetylases［J］.Cancer Res，2002，62(17):4916 －21.

［23］ Shah M H，Binkley P，Chan K，et al.Cardiotoxicity of histone deacetylase inhibitor depsipeptide in patients with metastatic neuroendocrine tumors［J］.Clin Cancer Res，2006，12(13):3997 －4003.

［24］Khan N，Jeffers M，Kumar S，et al.Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors［J］.Biochem J，2008，409(2):581 －9.

［25］Fournel M，Bonfils C，Hou Y，et al.MGCD0103，a novel isotype-selective histone deacetylase inhibitor，has broad spectrum antitumor activity in vitro and in vivo［J］.Mol Cancer Ther，2008，7(4):759－68.

［26］Le T C，Siu L L.Promising antitumor activity with MGCD0103，a novel isotype-selective histone deacetylase inhibitor［J］.Expert Opin Investig Drugs，2008，17(8):1247 －54.

［27］Buggy J J，Sideris M L，Mak P，et al.Cloning and characterization of a novel human histone deacetylase，HDAC8［J］.Biochem J，2000，350 Pt(1):199 －205.

［28］Vannini A，Volpari C，F(xiàn)ilocamo G，et al.Crystal structure of a eukaryotic zinc-dependent histone deacetylase，human HDAC8，complexed with a hydroxamic acid inhibitor［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(42):15064 －9.

［29］ Balasubramanian S，Ramos J，Luo W，et al.A novel histone deacetylase 8(HDAC8)-specific inhibitor PCI-34051 induces apoptosis in T-cell lymphomas［J］.Leukemia，2008，22(5):1026 －34.

［30］李 斌，王濟明.組蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)與腫瘤［J］.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2006，5(12):2030 －1.

［30］Li B，Wang J M.Histone deacetylase 6 and tumor［J］.J Clin Exp Med，2006，5(12):2030 －1.

［31］楊 晉，趙紹林，楊新玲，等.HDAC6在食道癌中表達的初步研究［J］.中國實驗診斷學，2009，13(11):1577 －1579.

［31］Yang J，Zhao S L，Yang X L，et al.Study on the expression of HDAC6 in esophageal carcinoma［J］.Chin J Lab Diagn，2009，13(11):1577－9.

［32］Zhang Y，Li N，Caron C，et al.HDAC-6 interacts with and deacetylates tubulin and microtubules in vivo［J］.EMBO J，2003，22(5):1168－79.

［33］Bali P，Pranpat M，Bradner J，et al.Inhibition of histone deacetylase 6 acetylates and disrupts the chaperone function of heat shock protein 90:a novel basis for antileukemia activity of histone deacetylase inhibitors［J］.J Biol Chem，2005，280(29):26729 －34.

［34］North B J，Marshall B L，Borra M T，et al.The human Sir2 ortholog，SIRT2，is an NAD+-dependent tubulin deacetylase［J］.Mol Cell，2003，11(2):437 －44.

［35］Ontoria J M，Altamura S，Di M A，et al.Identification of novel，selective，and stable inhibitors of class II histone deacetylases.Validation studies of the inhibition of the enzymatic activity of HDAC4 by small molecules as a novel approach for cancer therapy［J］.J Med Chem，2009，52(21):6782 －9.

［36］Schafer S，Saunders L，Schlimme S，et al.Pyridylalanine-containing hydroxamic acids as selective HDAC6 inhibitors［J］.Chem Med Chem，2009，4(2):283 －90.

［37］Frew A J，Johnstone R W，Bolden J E.Enhancing the apoptotic and therapeutic effects of HDAC inhibitors［J］.Cancer Lett，2009，280(2):125－33.