木瓜蛋白酶體外酶解苜蓿草粉適宜條件的研究

周 群，玉永雄，劉景環(huán)，康紅軍

（西南大學(xué)重慶牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 北碚 400716）

有研究表明，苜蓿含有動(dòng)物所需要的各種必需氨基酸，而且含量豐富、品質(zhì)好，限制性氨基酸特別是賴(lài)氨酸含量豐富。苜蓿氨基酸組成比例較為均衡，且苜蓿價(jià)格較低，用其部分替代豆粕可以降低飼料成本，提高養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟(jì)效益，這是一種解決植物性蛋白質(zhì)缺乏的有效途徑。由于不同蛋白質(zhì)的氨基酸組成與空間結(jié)構(gòu)不同，在動(dòng)物體內(nèi)的消化吸收率也大不相同。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被水解為小肽和游離氨基酸后，其吸收利用率就會(huì)大大增加。因此，為了充分利用好蛋白質(zhì)資源，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行水解是十分必要的。以蛋白質(zhì)為原料，水解制取氨基酸的方法有酸水解法、堿水解法和酶水解法3種。酸水解法水解雖徹底，但條件劇烈，色氨酸全被破壞，絲氨酸、酪氨酸和蘇氨酸被部分破壞；水解液需經(jīng)過(guò)中和及脫鹽處理，工藝路線長(zhǎng)，能耗高，設(shè)備腐蝕大，營(yíng)養(yǎng)成分損失多。堿水解只能得到消旋化的氨基酸，羥基氨基酸、巰基氨基酸全被破壞；且造價(jià)高，設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，營(yíng)養(yǎng)成分損失也大。酶水解法反應(yīng)條件溫和，操作簡(jiǎn)單，能保留更多的營(yíng)養(yǎng)成分，且水解過(guò)程易控制，不會(huì)造成大的環(huán)境污染。本試驗(yàn)的目的就是在酶解法的基礎(chǔ)上，結(jié)合王文亮、王利民確定的底物用量、木瓜蛋白酶消化溫度和時(shí)間、最適酶解溫度，研究體外酶解部分苜蓿草粉替代豆粕的最適反應(yīng)條件，包括最適酶濃度、酶解溫度、時(shí)間等主要參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 苜蓿草粉：刈割西南大學(xué)牧草實(shí)驗(yàn)室后山試驗(yàn)田種植的紫花苜蓿草，晾曬、烘干后粉碎為80目的苜蓿草粉，粗蛋白含量為20%；豆粕：市售豆粕，粗蛋白含量為45.86%；木瓜蛋白酶：廣西某生物制品有限公司生產(chǎn)，酶活力為300萬(wàn)U/g。

儀器：電子天平，自動(dòng)凱氏定氮儀，水浴鍋。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苜蓿草粉及豆粕蛋白質(zhì)含量測(cè)定、混合底物及產(chǎn)物內(nèi)蛋白質(zhì)含量測(cè)定 采用凱氏定氮法。

1.2.2 酶解反應(yīng) 利用蛋白替代法得到苜蓿草粉與豆粕混合物，加入一定量的三蒸水制備成酶解底物。加入一定量的酶后，將試驗(yàn)樣品放入恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)一定時(shí)間后取出樣品立即置沸水浴中加熱10min，滅活酶以終止反應(yīng)。

1.2.3 水解度的測(cè)定 將反應(yīng)后的酶解物進(jìn)行固液分離，分別測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。固態(tài)反應(yīng)產(chǎn)物內(nèi)蛋白質(zhì)含量減少量與原樣品中蛋白質(zhì)含量的百分比即為判斷酶解效率的指標(biāo)。百分比低則酶解效率高，蛋白質(zhì)的水解度高，游離出的氨基酸及小分子肽鏈多，反之則相反。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶濃度對(duì)水解度的影響 制備18g苜蓿草粉與豆粕的混合物，其中12g豆粕，6g苜蓿草粉。在混合物中加入92g三蒸水配制成酶反應(yīng)底物。加酶量分別為0.0075g、0.015g、0.02g、0.03g。反應(yīng)溫度為 65℃，反應(yīng)時(shí)間10h。不同加酶量對(duì)水解反應(yīng)的影響如圖1所示。

圖1 加酶量對(duì)水解度的影響

當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，底物的水解度取決于酶的濃度。理論上講，酶分子愈多，水解度愈大，但由圖1可看出，開(kāi)始時(shí)水解度隨酶濃度的增大而增大得較快，當(dāng)加酶量為0.02g時(shí)，水解度達(dá)到最大值，酶濃度繼續(xù)增大水解度變化不大，且有下降的趨勢(shì)。

2.2 溫度對(duì)水解度的影響 設(shè)定加酶量為0.02g，分別置于19℃、30℃、40℃、50℃、65℃ 5個(gè)不同的水浴反應(yīng)溫度進(jìn)行酶解反應(yīng)，其他條件不變，結(jié)果見(jiàn)圖2。

分析圖2可知，水解度隨反應(yīng)溫度的升高而升高，當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)65℃時(shí)，水解度最高。因考慮到生產(chǎn)過(guò)程中很難達(dá)到高溫度酶解的條件，故沒(méi)有設(shè)定更高反應(yīng)溫度水平。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶在加酶量為0.02g，即底物濃度0.11%時(shí)的最適反應(yīng)溫度為65℃。

圖2 反應(yīng)溫度對(duì)水解度的影響

2.3 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響 在加酶量為0.02 g，溫度 65℃條件下，取 3h、5h、8h、10h 4個(gè)不同反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行酶解反應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響

由圖3可看出，水解度隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，反應(yīng)時(shí)間為10h時(shí)，水解度最高。因此，木瓜蛋白酶水解苜蓿蛋白的時(shí)間控制在10h左右為宜。

3 結(jié)論

溫度對(duì)酶解液的蛋白質(zhì)含量具有較大影響，溫度為65℃時(shí)，蛋白質(zhì)水解率比較高。酶濃度在試驗(yàn)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)酶解率隨著酶用量的增加而升高。綜合其他因素和從經(jīng)濟(jì)角度考慮，酶用量為0.02g時(shí)最好。因此，木瓜蛋白酶體外酶解苜蓿草粉替代部分豆粕的最佳工藝條件是：酶用量為0.02g，水解溫度為65℃，水解時(shí)間為10h。

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