硫酸長(zhǎng)春堿與DNA相互作用的機(jī)理研究

劉 煒，張瓊梅，畢和平

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？?571158）

硫酸長(zhǎng)春堿與DNA相互作用的機(jī)理研究

劉 煒，張瓊梅，畢和平

（海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 海口 571158）

應(yīng)用熒光光譜法、紫外光譜法和粘度法研究了硫酸長(zhǎng)春堿和鯡魚(yú)精DNA分子間的相互作用.在pH為7.4的Tris-HCl緩沖溶液體系中,測(cè)量不同DNA濃度下硫酸長(zhǎng)春堿的熒光發(fā)射光譜，DNA對(duì)硫酸長(zhǎng)春堿產(chǎn)生了較強(qiáng)的熒光猝滅作用.運(yùn)用位點(diǎn)模型計(jì)算了兩個(gè)不同溫度下硫酸長(zhǎng)春堿與DNA的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù),根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)確定了硫酸長(zhǎng)春堿與DNA之間的作用力以氫鍵和范德華力為主；結(jié)合熒光探針實(shí)驗(yàn)以及粘度實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明硫酸長(zhǎng)春堿是以溝槽結(jié)合的方式與DNA結(jié)合.

硫酸長(zhǎng)春堿；DNA；相互作用；機(jī)理

核酸是重要的生命物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)生物的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖等有重要作用.一些藥物分子與DNA的相互作用會(huì)影響到DNA的生理和物理化學(xué)性質(zhì)，改變DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制.在醫(yī)藥研究中，DNA與靶向分子相互作用的研究不僅可以闡述一些抗腫瘤、抗病毒藥物以及致癌物的作用機(jī)理，而且對(duì)進(jìn)一步指導(dǎo)新型藥物的設(shè)計(jì)合成的研究都具有重要意義[1-2].

長(zhǎng)春堿為夾竹桃科植物長(zhǎng)春花中提取的一種有抗癌活性的生物堿，目前尚未見(jiàn)有關(guān)其與DNA相互作用的研究報(bào)道.本文主要研究硫酸長(zhǎng)春堿與DNA相互作用的機(jī)理，獲得硫酸長(zhǎng)春堿與DNA相互作用的信息，包括反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、熱力學(xué)參數(shù)以及結(jié)合方式等，為研究硫酸長(zhǎng)春堿的抗癌機(jī)理提供了重要信息.圖1為硫酸長(zhǎng)春堿的結(jié)構(gòu)式.

圖1 硫酸長(zhǎng)春堿結(jié)構(gòu)式Fig.1 Stucture of Vinblastine sulfate

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF-5301熒光分光光度儀（Hitachi,日本）；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；PHSJ-4A型pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器公司）；鯡魚(yú)精DNA（sigma，美國(guó)）；硫酸長(zhǎng)春堿（海南希源化工有限公司，純度＞98%）；其它所用試劑均為分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL容量瓶中，依次加入等量pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液，固定量的硫酸長(zhǎng)春堿溶液和不同量的DNA溶液，并用二次蒸餾水稀釋到刻度，搖勻，在熒光儀上進(jìn)行熒光光譜和吸收光譜的測(cè)定.熒光激發(fā)波長(zhǎng)選擇271 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為363 nm，狹縫寬度均為5 nm.

在10 mL容量瓶中，依次加入等量pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液，固定量的DNA溶液和不同量的硫酸長(zhǎng)春堿溶液，并用二次蒸餾水稀釋到刻度，搖勻，進(jìn)行粘度的測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA對(duì)硫酸長(zhǎng)春堿熒光光譜的影響

圖2為pH7.4tris-HCl緩沖液中DNA存在下硫酸長(zhǎng)春堿的熒光發(fā)射光譜.從圖2中可以看出，硫酸長(zhǎng)春堿（a：2×10-5mol/L）在363 nm處有一最大發(fā)射峰，DNA存在可使硫酸長(zhǎng)春堿363 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度發(fā)生猝滅，隨著DNA濃度增大（b→d：6.8×10-5mol/L，1.36×10-4mol/L，2.04×10-4mol/L），猝滅程度逐漸增強(qiáng)，表明DNA和硫酸長(zhǎng)春堿可能形成了復(fù)合物.

2.2 DNA對(duì)硫酸長(zhǎng)春堿紫外吸收光譜的影響

圖3為pH7.4 tris-HCl緩沖液中DNA存在下硫酸長(zhǎng)春堿的紫外吸收光譜.從圖3中可以看出，硫酸長(zhǎng)春堿（a：2×10-5mol/L）在271 nm處有一紫外吸收峰，隨著DNA濃度的增大（b→c：6.8×10-5mol/L，1.36×10-4mol/L），硫酸長(zhǎng)春堿的紫外吸收峰先發(fā)生降低和藍(lán)移，后發(fā)生顯著升高和藍(lán)移.由于有機(jī)分子與DNA以嵌入或溝槽方式結(jié)合時(shí)會(huì)導(dǎo)致有機(jī)分子的紫外吸收峰強(qiáng)度發(fā)生升高或降低，同時(shí)最大吸收峰波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生藍(lán)移或紅移[3]，因此硫酸長(zhǎng)春堿與DNA可能是以嵌入或溝槽的方式結(jié)合.

圖2DNA存在下硫酸長(zhǎng)春堿的熒光發(fā)射光譜Fig.2 The fluorescence emission spectra of vinblastine sulfate in the presence of DNA

圖3DNA存在下硫酸長(zhǎng)春堿的紫外吸收光譜Fig.3 The UV absorption spectra of vinblastine sulfate in the presence of DNA

2.3 DNA與硫酸長(zhǎng)春堿二元絡(luò)合物的組成及其結(jié)合常數(shù)

根據(jù)靜態(tài)猝滅公式

（F0與F分別代表總的和游離態(tài)的藥物的熒光強(qiáng)度，K為硫酸長(zhǎng)春堿與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)，c為猝滅劑的平衡濃度，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)），由式（1）分別作出不同溫度下硫酸長(zhǎng)春堿-DNA體系的關(guān)系圖，結(jié)果分別見(jiàn)圖4和圖5，通過(guò)斜率和外推截距可以求出硫酸長(zhǎng)春堿與猝滅劑之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù).由圖4可知，25℃時(shí)硫酸長(zhǎng)春堿與DNA之間的結(jié)合常數(shù)為2.66×104，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.195，線性相關(guān)系數(shù)為0.991 1；由圖5可知，40℃時(shí)硫酸長(zhǎng)春堿與DNA之間的結(jié)合常數(shù)為1.05×104，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1.071 9，線性相關(guān)系數(shù)為0.983 9.

2.4 硫酸長(zhǎng)春堿與DNA結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力

藥物小分子與生物大分子的作用力包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用力等，藥物不同，與DNA作用力類(lèi)型也不同.當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變可視作常數(shù)，根據(jù)熱力學(xué)公式可以計(jì)算藥物小分子與生物大分子作用間的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)：

圖425℃時(shí)DNA和硫酸長(zhǎng)春堿的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Fig.4 The binding constant and sites of vinblastine sulfate-DNA at 25℃

圖540℃時(shí)DNA和硫酸長(zhǎng)春堿的結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Fig.5 The binding constant and sites of vinblastine sulfate-DNA at 40℃

根據(jù)藥物小分子與生物大分子作用的有關(guān)熱力學(xué)參數(shù)可以簡(jiǎn)單判斷其相互作用類(lèi)型[5]：若ΔH＞0及ΔS＞0則主要表現(xiàn)為疏水作用，ΔH＜0及ΔS＞0主要表現(xiàn)為靜電作用，ΔH＜0及ΔS＜0主要表現(xiàn)氫鍵或者范德華作用.

根據(jù)硫酸長(zhǎng)春堿與DNA的結(jié)合常數(shù)K1（298 K）=2.66×104，K2（313K）=1.05×104，按式（2）～（4）可以求得二者結(jié)合過(guò)程的熱力學(xué)函數(shù)：ΔHm=-48.2kJ·mol-1，ΔGm（298K）=-25.2kJ·mol-1，ΔSm（298K）=-77J·K-1·mol-1，由此可初步判斷硫酸長(zhǎng)春堿與DNA間是以氫鍵或者范德華作用力結(jié)合為主.

2.5 硫酸長(zhǎng)春堿對(duì)小檗堿-DNA體系熒光強(qiáng)度影響的研究

鹽酸小檗堿（BR）是以治療腸道痢疾而著稱(chēng)的黃連素，可以專(zhuān)一性地插入DNA雙螺旋的堿基對(duì)之間，使本身很弱的熒光得到顯著性增強(qiáng)，當(dāng)鹽酸小檗堿從雙螺旋中出來(lái)時(shí)，熒光又顯著性降低，因此可作為熒光探針研究DNA與小分子化合物的相互作用[6].若硫酸長(zhǎng)春堿和DNA是以嵌入的方式結(jié)合，則硫酸長(zhǎng)春堿可與BR競(jìng)爭(zhēng)DNA的結(jié)合位點(diǎn)，將BR從DNA分子中擠出，從而使BR-DNA體系的熒光強(qiáng)度降低.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著硫酸長(zhǎng)春堿濃度的增大，BR-DNA體系熒光強(qiáng)度基本不變，說(shuō)明了硫酸長(zhǎng)春堿與DNA之間不是嵌入結(jié)合.

2.6 粘度研究

具有光學(xué)活性的探針對(duì)于探討鍵合模式一般可以提供必要的但不是充分的證據(jù)[7]，粘度測(cè)定是檢測(cè)配合物與DNA是否以嵌入方式結(jié)合的最有效的方法.小分子配合物通過(guò)經(jīng)典嵌入式與DNA作用時(shí)，DNA相鄰堿基對(duì)的距離會(huì)增大以容納配體，導(dǎo)致DNA雙螺旋伸長(zhǎng)，DNA溶液的粘度增加；當(dāng)以靜電、溝槽結(jié)合等非嵌入方式與DNA作用時(shí)，DNA溶液的粘度度變化不明顯[8].

在相同濃度的DNA及緩沖體系溶液中加入不同濃度的長(zhǎng)春堿測(cè)量其粘度.由實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按式（5）計(jì)算相對(duì)粘度：

式中t0為空白溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間，t為含不同量長(zhǎng)春堿的DNA溶液流經(jīng)毛細(xì)管所需時(shí)間，以（η/η0）1/3對(duì)結(jié)合比率r作圖，η0為未加入硫酸長(zhǎng)春堿時(shí)DNA的粘度，隨著長(zhǎng)春堿濃度增大，DNA溶液的粘度基本不變，因此可知長(zhǎng)春堿與DNA之間不是以嵌入方式結(jié)合.

2.7 作用機(jī)理探討

小分子探針與雙螺旋DNA結(jié)合方式主要包括靜電式、嵌入式和溝槽式3種模式.根據(jù)硫酸長(zhǎng)春堿與DNA的作用力主要為氫鍵或者范德華作用力，可以排除靜電結(jié)合的方式；如果小分子與DNA鍵合作用是通過(guò)經(jīng)典嵌入式，則藥物分子-DNA體系溶液的粘度應(yīng)該增加，然而粘度實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示硫酸長(zhǎng)春堿-DNA體系溶液的粘度不變，而且硫酸長(zhǎng)春堿對(duì)BR-DNA體系熒光強(qiáng)度不產(chǎn)生猝滅作用，結(jié)合硫酸長(zhǎng)春堿和DNA反應(yīng)的紫外吸收譜圖，說(shuō)明長(zhǎng)春堿與DNA應(yīng)該是以溝槽結(jié)合的方式相互作用.

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Study on the Interaction Between Vinblastine Sulfate and DNA

LIU Wei，ZHANG Qiongmei，BI Heping
（College of Chemistry and Chemical Engineering,Hainan Normal University,Haikou571158，China）

The interaction of vinblastine sulfate with DNA was studied using UV spectrometry,fluorescence spectrome?try and viscosity method.Fluorescence emission spectra of vinblastine sulfate with various concentration of DNA at pH 7.4 tris-HCl buffer solution was measured.The results showed that the fluorescence intensity of vinblastine sulfate was quenched when DNA was added.The binding constant K and the binding sites n were calculated at two different centi?grade.The main binding force between vinblastine sulfate and DNA is hydrogen bonding or van der Waals force accord?ing to thermodynamic parameters.It was proved that vinblastine binds with DNA in a mode of groove binding combined with the results of fluorescence probe test and viscosity test.

vinblastine sulfate；DNA；interaction；mechanism

O 657.32

A

1674-4942（2010）04-0403-04

2010-09-19

海南省教育廳項(xiàng)目（Hjkj2009-39），海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（209004）

黃 瀾