付艷紅,劉敏艷,胡冠芳,李玉奇

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院農(nóng)藥學(xué)系,甘肅蘭州 730070;2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,甘肅蘭州 730070)

灰綠黃堇(Corydalis adunca)屬罌粟科紫堇屬植物,為我國特有,分布于新疆、內(nèi)蒙古大青山以西和西北各省的干旱山地草原或荒漠草原地區(qū)。王繼生等[1-2]發(fā)現(xiàn)灰綠黃堇水提物鎮(zhèn)痛抗炎的有效成分為灰綠黃堇總生物堿[3]。唐艷麗等[4-5]報道了9個生物堿;隨后,梁俊玉等[6]又分離出紫堇堿和去氫紫堇堿。國內(nèi)開展了灰綠黃堇的藥理活性和毒性研究[7],而在殺蟲活性研究方面國內(nèi)外迄今未見文獻報道。植物源農(nóng)藥在農(nóng)作物病蟲害防治中具有對環(huán)境友好、毒性普遍較低、病蟲害不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點,是生產(chǎn)無公害農(nóng)產(chǎn)品應(yīng)優(yōu)先選用的農(nóng)藥品種。目前我國尚未見有利用灰綠黃堇生物堿研制的植物源農(nóng)藥的登記。鑒于此,本研究分析了灰綠黃瑾提取物對粘蟲的殺蟲活性和作用方式,旨在為利用灰綠黃堇開發(fā)新型植物源殺蟲劑提供線索和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物材料 灰綠黃堇盛花期全株(根、莖、葉、花)采自甘肅省蘭州市榆中縣。洗凈后在室內(nèi)陰干,粉碎過40目篩,在室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試蟲源 粘蟲(Mythimna separate)采自蘭州市榆中縣良種繁殖場小麥田,室內(nèi)用玉米(Zea mays)葉或小麥(Triticum aestivum)苗連續(xù)飼養(yǎng)供試。

1.1.3 供試溶劑 甲醇、乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、氯仿,均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物樣品的提取 采用冷浸漬法提取[8-9]。稱取植物樣品50 g,置于棕色廣口瓶中,分別加入500 mL不同溶劑浸泡72 h,過濾后收集濾液;濾渣繼續(xù)用500 mL溶劑浸泡48 h,過濾后收集濾液;濾渣再用500 mL溶劑浸泡24 h,過濾后收集濾液,棄除殘渣,合并 3次濾液。濾液經(jīng) RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至干為粗提物,稱其質(zhì)量,計算產(chǎn)出率。用甲醇溶解并定容至50 mL,相當于干樣品1 000 g/L的質(zhì)量濃度,在冰箱中4℃下保存?zhèn)溆?。生物測定前加入1%的表面活性劑JFC(C7～C9烷醇聚氧乙烯醚)。

1.2.2 提取物的萃取分離 2 000 g灰綠黃堇盛花期全株的甲醇粗提物用4 000 g自來水加熱攪拌溶解(溫度40℃),分別用1 500 mL石油醚、1 500 mL乙酸乙酯和1 000 mL氯仿萃取3次,合并3次萃取液。分別將石油醚、乙酸乙酯、氯仿萃取液以及最終水液濃縮得浸膏,配制成與粗提物相同的濃度,在冰箱中4℃下保存?zhèn)溆谩Ｉ餃y定前加入1%的表面活性劑JFC。以幾率值分析法求毒力回歸方程y=a+bx、致死中質(zhì)量濃度及其95%置信限。

1.2.3 生物活性測定方法 觸殺作用的測定:采用蟲體浸漬法[10-11]。提取物用水稀釋成5倍液,劑量相當于干粉200 g/L。挑選大小一致的粘蟲3齡初期幼蟲,在藥液中浸漬5 s,取出后用濾紙吸去多余藥液,然后放入直徑12 cm鋪有濾紙保濕的培養(yǎng)皿中,飼喂新鮮玉米葉片。每處理50頭幼蟲,重復(fù)4次。以甲醇+JFC用水稀釋成5倍液浸漬處理作為對照。在溫度(25±1)℃、濕度60%～80%、光照時間光∶暗=14∶10條件下飼養(yǎng),視取食情況及時添加玉米葉片。24 h后調(diào)查死亡數(shù),計算死亡率和校正死亡率。

生長發(fā)育抑制作用的測定:采用夾毒葉碟法[12]。將玉米葉片剪成6 cm×4 cm的葉碟,用移液管吸取2 mL萃取物原液均勻涂抹于葉蝶正面,待溶劑揮發(fā)后,用自制的淀粉漿糊粘上另一片同樣大小的葉蝶,制成夾毒葉碟。然后放入直徑9 cm鋪有保濕濾紙的培養(yǎng)皿中,每皿放1頭饑餓4 h并已稱量的粘蟲3齡幼蟲(體質(zhì)量控制在0.15 g以下),累計處理60頭幼蟲,以甲醇+JFC原液處理葉蝶作為對照。飼養(yǎng)條件同上。待試蟲取食完夾毒葉碟后,更換新鮮的夾毒葉碟,3 d后分別稱量幼蟲體質(zhì)量,并更換新鮮無毒葉片繼續(xù)飼養(yǎng)。以后逐日稱量幼蟲體質(zhì)量,至幼蟲體質(zhì)量不再增加時為止。根據(jù)幼蟲體質(zhì)量增長情況計算生長發(fā)育抑制率。計算公式如下:

胃毒作用的測定:采用夾毒葉碟法[12]。3次重復(fù),每次重復(fù)20頭;飼養(yǎng)條件同上。測定期間逐日觀察記載幼蟲死亡數(shù)、化蛹數(shù)、不正常羽化數(shù),求出死亡率及校正死亡率。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法 利用SPSS軟件中ANOVA方法對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析,并用Duncan's新復(fù)極差法比較數(shù)據(jù)之間的差異顯著性。采用幾率值分析法求毒力回歸方程,并求致死中質(zhì)量濃度及其95%置信限。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰綠黃堇不同極性溶劑粗提物的觸殺作用 灰綠黃堇甲醇、乙醇、丙酮、石油醚和乙酸乙酯5種不同極性溶劑粗提物5倍稀釋液對粘蟲3齡幼蟲均具一定的觸殺作用,其中以甲醇粗提物觸殺作用最強,其校正死亡率為15.5%,由此確定甲醇為最佳提取溶劑(表1)。

2.2 灰綠黃堇甲醇粗提物不同溶劑萃取物的觸殺作用 灰綠黃堇甲醇粗提物用石油醚、乙酸乙酯和氯仿3種不同極性溶劑萃取,以氯仿萃取物粘蟲3齡幼蟲的觸殺作用最強,其校正死亡率為87.50%;其次為石油醚和乙酸乙酯萃取物,校正死亡率分別為30.00%和23.33%,由此確定氯仿為最佳萃取溶劑(表2)。

表3可知,氯仿萃取物隨著稀釋倍數(shù)的提高,對粘蟲的校正死亡率逐漸降低,其毒力回歸方程為 y=-5.098 7+4.567 5x(相關(guān)系數(shù)為0.985 2),致死中質(zhì)量濃度 (95%置信限)為13.071 3(12.364 2～13.818 9)g/L。

2.3 氯仿萃取物對生長發(fā)育的抑制作用灰綠黃堇甲醇粗提物氯仿萃取物對粘蟲3齡幼蟲具有很強的生長發(fā)育抑制作用,處理后3和5 d的生長發(fā)育抑制率分別為88.66%和60.28%;處理后7 d仍有一定的生長發(fā)育抑制作用,抑制率可達23.12%(表4)。

表1 灰綠黃堇不同極性溶劑粗提物對粘蟲3齡幼蟲觸殺作用的測定結(jié)果

2.4 氯仿萃取物的胃毒作用 灰綠黃堇甲醇粗提物氯仿萃取物原液對粘蟲3齡幼蟲具有很強的胃毒作用,其校正死亡率可達91.38%(表5)。

表2 灰綠黃堇甲醇粗提物不同極性溶劑萃取物對粘蟲3齡幼蟲觸殺作用的測定結(jié)果

表4 灰綠黃堇甲醇粗提物氯仿萃取物對粘蟲3齡幼蟲生長發(fā)育抑制作用的測定結(jié)果

表5 灰綠黃堇甲醇粗提物氯仿萃取物原液對粘蟲3齡幼蟲胃毒作用的測定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

灰綠黃堇為我國特有,分布較廣,生物量較大,殺蟲活性高,具有良好的開發(fā)利用前景。本研究結(jié)果表明,灰綠黃堇不同極性溶劑粗提物對粘蟲3齡幼蟲的觸殺作用以甲醇粗提物最強,在22.08 g/L質(zhì)量濃度下的校正死亡率為15.5%;甲醇粗提物不同極性溶劑萃取物的觸殺作用則以氯仿萃取物最強,在質(zhì)量濃度22.08 g/L下的校正死亡率可達 87.5%,其毒力回歸方程為y=-5.098 7+4.567 5x,致死中質(zhì)量濃度為13.07 g/L;氯仿萃取物對粘蟲3齡幼蟲具有很強的生長發(fā)育抑制作用和胃毒作用,生長發(fā)育抑制率和校正死亡率分別為88.66%和91.38%。今后將繼續(xù)研究氯仿萃取物對蚜蟲、紅蜘蛛、甜菜夜蛾、甘藍夜蛾和棉鈴蟲等害蟲的殺蟲活性和作用方式。

近年來應(yīng)用化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生的“3R”問題給人類健康帶來了嚴重隱患,并且造成生態(tài)環(huán)境失衡,引發(fā)有害生物產(chǎn)生抗藥性和害蟲再猖獗,導(dǎo)致害蟲天敵及其他有益生物數(shù)量下降、人畜中毒。為了改善人類的生存環(huán)境和食物品質(zhì),世界眾多科學(xué)家們已把尋找高效、低毒、低殘留和與環(huán)境和諧的生態(tài)合理農(nóng)藥作為農(nóng)藥的研發(fā)方向,從植物中提取分離殺蟲活性成分的研究受到了廣泛的關(guān)注[13-14]。

灰綠黃堇的開發(fā)利用可考慮兩條途徑,一是制成粗制品或粗提取液直接用于防治害蟲;二是對氯仿萃取物開展分離提純,鑒定出殺蟲活性成分的化學(xué)結(jié)構(gòu),確定主成分;探明各成分之間有無協(xié)同、增效、拮抗作用;明確主成分的殺蟲作用機理、殺蟲譜和作用方式[15-16];對主成分開展仿生合成和結(jié)構(gòu)優(yōu)化、人工合成,為利用灰綠黃堇創(chuàng)制高效、低毒、低殘留新型農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

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