劉思情，張家波，唐瓊英，劉煥章,*

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070；2. 中國科學(xué)院水生生物研究所，湖北 武漢 430072）

基于ND4和ND5基因序列分析的鰍超科魚類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

劉思情1,2，張家波1，唐瓊英2，劉煥章2,*

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070；2. 中國科學(xué)院水生生物研究所，湖北 武漢 430072）

ND4和ND5是線粒體基因組中編碼NADH脫氫酶亞基4和亞基5的兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。該研究以鰍超科魚類為研究對象，新測定了10個(gè)物種的ND4和ND5基因全序列以及中間的3個(gè)tRNA基因共212 bp的序列，結(jié)合從GenBank下載的15個(gè)物種的15條序列進(jìn)行序列比較和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。結(jié)果顯示：鰍超科魚類ND4基因全長1 380～1 387 bp，以ATG為起始密碼子，終止密碼子為不完全終止信號；ND5基因全長1 821～1 839 bp，同樣起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA或TAG；ND4和ND5基因之間插入了3個(gè)tRNA基因，分別編碼攜帶組氨酸、絲氨酸、亮氨酸的tRNA。ND4和ND5基因（包含3個(gè)tRNA基因）中A、T、G、C的平均含量分別為30.4%、27.3%、14.2%、28.1%，A+T (57.7%)的含量高于G+C (42.3%)的含量。轉(zhuǎn)換與顛換比（Ti/Tv）平均值為1.586。選取斑馬魚和鯉魚作為外類群，采用最大簡約法（MP）、最大似然法（ML）和貝葉斯推斷法（BI）進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的重建。三種方法的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果都顯示：花鰍亞科、條鰍亞科、沙鰍亞科、平鰭鰍科及Vaillantellidae分別構(gòu)成單系；它們的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系為：（Vaillantellidae+（沙鰍亞科+（花鰍亞科+（條鰍亞科+平鰭鰍科）。這與線粒體全基因組和某些核基因（如RAG1基因）的研究結(jié)果類似，且支持率較高，表明ND4和ND5基因用于鰍超科魚類的系統(tǒng)發(fā)育分析是可行的；但是該研究的結(jié)果有別于其他線粒體基因的分析結(jié)果，如基于cytb和D-loop基因進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，條鰍亞科和花鰍亞科聚為姐妹群，再和平鰭鰍科聚在一起。這種差異可能是由于使用的基因長度差異造成的，長度越長，信息量越大，所反映的系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果可能更加接近真實(shí)情況。

鰍超科；ND4/ND5基因；序列分析；系統(tǒng)發(fā)育

鯉形目是世界上最大的淡水魚類類群，約有3 268種（Nelson，2006），在經(jīng)濟(jì)發(fā)展和科學(xué)研究中占有很重要的地位。傳統(tǒng)的鯉形目魚類研究多以形態(tài)特征為基礎(chǔ)，其分類及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還存在較多爭議，為此，美國自然科學(xué)基金資助了“鯉形目生命樹（Cypriniformes Tree of Life, CToL）”的國際合作項(xiàng)目，希望聯(lián)合世界各國的魚類學(xué)研究者通過綜合魚類化石、形態(tài)特征及分子等各個(gè)方面的數(shù)據(jù)資料對鯉形目魚類的系統(tǒng)發(fā)育問題進(jìn)行全面的研究。

鰍超科（Cobitoidea）是鯉形目中較為重要的一個(gè)類群，其物種數(shù)約占整個(gè)鯉形目的26%（Nelson, 2006）。關(guān)于鰍超科的分類，Sawada（1982）根據(jù)48個(gè)種及亞種的52個(gè)骨骼及外部性狀特征，把鰍超科分為鰍科（Cobtidae）和平鰭鰍科（Balitoridae）兩個(gè)科，其中鰍科包括沙鰍亞科（Botiinae）、花鰍亞科（Cobitinae），平鰭鰍科包括條鰍亞科（Nemacheilinae）和平鰭鰍亞科（Balitorinae）。而國內(nèi)學(xué)者則大多數(shù)將條鰍亞科歸為鰍科（Chen & Zhu，1984；Zhu，1995；各地方魚類志等）。目前國際上廣為接受的是Sawada（1982）的觀點(diǎn)（Nelson，2006；Saitoh et al，2006）。近年來，一些學(xué)者基于形態(tài)和分子特征對鰍超科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)新的結(jié)果不同于以往的任何研究（Nalbant & Bianco，1998；Saitoh et al，2006；Tang et al，2006；?lechtová et al，2007），沙鰍亞科是上述4個(gè)類群中最原始的類群，其他3個(gè)類群的關(guān)系不明朗。因此，鰍超科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還有待于進(jìn)一步的分析。

ND4和ND5是線粒體基因組中編碼NADH脫氫酶亞基4和亞基5的兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因。有研究顯示，與其他線粒體基因相比，ND4、ND5基因進(jìn)化速率適中，在重建親緣關(guān)系較遠(yuǎn)類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時(shí)，能構(gòu)建出更加可靠的系統(tǒng)發(fā)育樹（Zardoya & Meyer，1996）。目前，將這兩個(gè)基因聯(lián)合運(yùn)用于系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究的報(bào)道還很少。就同一研究類群而言，與短片段序列數(shù)據(jù)集相比，長片段序列數(shù)據(jù)集具有更多的數(shù)據(jù)信息，能夠構(gòu)建出更可靠的系統(tǒng)發(fā)育樹（Hofreiter，2008）。線粒體ND4、ND5基因及兩個(gè)基因間的3個(gè)tRNA基因的聯(lián)合序列（以ND4+5來表示）與應(yīng)用廣泛的cytb基因相比，具有更多的核苷酸位點(diǎn)，信息量相對大很多。本研究以鰍超科魚類為研究對象，對其ND4+5基因序列的變異情況進(jìn)行分析，重建鰍超科魚類的分子系統(tǒng)樹，探討ND4+5基因序列中包含的系統(tǒng)發(fā)育信息，同時(shí)討論鰍超科的系統(tǒng)發(fā)育問題。

1 材料與方法

1.1 研究用標(biāo)本

本研究以斑馬魚（Danio rerio）和鯉魚（Cyprinus carpio）作外類群，選擇了鰍超科魚類五個(gè)類群共23種25個(gè)個(gè)體進(jìn)行序列分析，構(gòu)建鰍超科魚類的分子系統(tǒng)樹。其中鰍超科10個(gè)物種的ND4+5基因?yàn)樾聹y序列，其他15種鰍超科魚類及外類群的同源序列從GenBank下載獲得。DNA測序分析采用的樣品均為95%的酒精固定標(biāo)本，主要從國內(nèi)各水系收集獲得，標(biāo)本保存于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水魚類博物館。具體種類及其他詳細(xì)信息見表1。

1.2 基因組DNA的提取

在本研究中，采用了兩種提取DNA的方法，一種為常規(guī)的酚?氯仿抽提法；另一種為高鹽抽提法。方法如下；

酚?氯仿抽提法，取魚背部肌肉適量于1.5 mL的Eppendorf管中，用蒸餾水、TE（10 mmol/L Tris.HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0）緩沖液浸泡，直到組織中無酒精味。然后加入620 μL的STE（0.1 mol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH8.0）細(xì)胞裂解液，70 μL 10%的SDS，10 μL蛋白酶K（10 μg/μL），置于55℃的恒溫箱中消化至透明。加入等體積的平衡酚抽提兩次（pH值），再加入等體積的氯仿?異戊醇（24∶1）抽提，至無蛋白質(zhì)。加入上清液兩倍體積的無水乙醇沉淀2 h以上，離心后再用75%的乙醇洗滌沉淀，再離心去乙醇干燥后加入30～50 μL的滅菌雙蒸水或TE緩沖液溶解，并存于?20℃的冰箱中備用。

高鹽抽提法，取魚背部肌肉適量于2 mL的Eppendorf管中，剪碎烘干，加入500 μL HOM Buffer和10～15 μL蛋白酶K，置于55℃的恒溫箱中消化至透明。加入500 μL NaCl（4.5 mol/L），300 μL氯仿離心。加入600 μL異丙醇沉淀，于?20℃保存1 h以上，離心后再用70%乙醇洗滌，干燥后加入50 μL滅菌雙蒸水溶解，存于?20℃的冰箱中備用。

1.3 PCR擴(kuò)增

ND4+5基因序列全長3 387～3 443 bp。在mtDNA上，ND4基因左側(cè)是ND4L基因，ND5基因右側(cè)是ND6基因，ND4和ND5基因之間是3個(gè)tRNA基因。基于此結(jié)構(gòu)，分別在ND4L、ND6基因的側(cè)翼區(qū)及ND4、ND5基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物。引物序列參考Miya et al（2006），并稍作改動。用于擴(kuò)增的引物共5對：LArgd1+H11618d；L11427dA+H12632dB；L12328d+H13393d；L13058d+H13721d；L13559d+H14710d（圖1）。

PCR反應(yīng)的總體積為60 μL，反應(yīng)體系包括：10×Buffer 6 μL，dNTPs 1.2 μL（每個(gè)堿基濃度為2.5 mmol/L），引物各1.5 μL（10 μmol/L），Taq酶3.0 U。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，然后循環(huán)包括：94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后再72℃延伸5 min。

1.4 PCR產(chǎn)物的純化和測序

PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖電泳檢測，并在紫外投射儀上觀察。PCR產(chǎn)物用試劑盒進(jìn)行割膠回收或直接過柱回收?；厥债a(chǎn)物送測序公司測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

表 1 研究中所用標(biāo)本及來源Tab. 1 Specimens and their localities in the present study

圖 1 ND4、ND5基因位置圖解及5對引物的相對位置Fig. 1 Schematic representation of the ND4/ND5 gene region and relative positions of 5 pairs of primers

圖 2 轉(zhuǎn)換、顛換的絕對數(shù)目和基于GTR模型的本研究中所有個(gè)體ND4+5基因序列成對比較所得的遺傳距離散點(diǎn)圖Fig. 2 Scatter plot for the absolute number of transitions and transversions versus GTR distance of ND4+5 gene in pairwise comparisons between the species in the present study

DNA序列的排列使用ClustalX軟件，并進(jìn)行手工調(diào)整。從GenBank下載鰍超科魚類和外類群魚類的ND4＋5基因序列。通過比對分析找出序列的起始密碼子（ATG）和終止密碼子，刪除起始密碼子前和終止密碼子后的堿基。序列中各堿基的含量及變異情況用Mega4.0（Tamura et al，2007）中的Statistic命令進(jìn)行分析。用PAUP*軟件統(tǒng)計(jì)出序列中轉(zhuǎn)換和顛換的絕對數(shù)目以及序列的變異情況（用GTR模型下的遺傳距離，GTR distances），并在Statistica 6.0軟件中進(jìn)行作圖分析序列中堿基替代的飽和程度。分子系統(tǒng)樹的構(gòu)建采用最大簡約法（MP）、最大似然法（ML）和貝葉斯推斷法（BI），其中MP和ML法采用PAUP*4.0b10（Swofford，2002）軟件，BI法采用MrBayesV3.0（Ronquist & Huelsenbeck，2003）軟件。MP和ML法各分支的置信度分別采用1 000次和100次自展分析（bootstrap analysis）進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)。BI法以后驗(yàn)概率（posterior probability）來表示各分支的可信性。

2 結(jié) 果

2.1 鰍超科魚類ND4＋5基因序列與遺傳變異分析

比對分析的結(jié)果表明，鰍超科魚類ND4基因全長1 380～1 38 bp，以ATG為起始密碼子，終止密碼子為不完全終止信號；ND5基因全長1 821～1 839 bp，同樣起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA或TAG；ND4和ND5基因之間插入了3個(gè)tRNA基因，分別編碼攜帶組氨酸、絲氨酸和亮氨酸的tRNA，序列長度分別為70、68和73 bp。鰍超科魚類ND4+5基因序列全長3 387～3 443 bp，序列中A、T、G、C的平均含量分別為30.4%、27.3%、14.2%、28.1%，A+T (57.7%)的含量高于G+C (42.3%)的含量。

基于Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算遺傳距離，以確定類群間的遺傳分化程度，結(jié)果顯示類群間的遺傳距離值為0.203～0.255。鰍超科ND4＋5基因序列轉(zhuǎn)換與顛換之比（Ti/Tv）的變異范圍為0.983～9.579，平均值為1.586。 在供分析的3 462個(gè)位點(diǎn)中，共有1 899個(gè)變異位點(diǎn)，其中簡約信息位點(diǎn)為1 525個(gè)。圖1顯示所有個(gè)體ND4+5基因序列的轉(zhuǎn)換和顛換均未達(dá)到飽和，說明序列中的替代均具有系統(tǒng)發(fā)育意義，可用于數(shù)據(jù)分析。在所有的變異水平上，轉(zhuǎn)換數(shù)明顯大于顛換數(shù)。

2.2 分子系統(tǒng)樹

基于目前的數(shù)據(jù)，我們分析了鰍超科魚類5個(gè)不同的類群：條鰍亞科，花鰍亞科，沙鰍亞科，平鰭鰍科和Vaillantellidae的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。其中Vaillantellidae只包含一個(gè)屬Vaillantella，該屬只分布于印尼及馬來西亞一帶（fishbase 2009年2月更新；網(wǎng)址http://www.fishbase.org/search.php）。使用最大簡約法（MP）、最大似然法（ML）和貝葉斯推斷法（BI）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。3種方法構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致（圖3～5）。

以斑馬魚（Danio rerio）和鯉魚（Cyprinus carpio）作為外類群，3種構(gòu)樹方法的結(jié)果一致顯示，鰍超科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系為：（Vaillantellidae+（沙鰍亞科+（花鰍亞科+（條鰍亞科+平鰭鰍科）；條鰍亞科、平鰭鰍科、花鰍亞科、沙鰍亞科和Vaillantellidae這5個(gè)類群都各自獨(dú)立形成單系，且都得到較高的支持率（均超過90；圖3～5）；Vaillantella處于所有鰍類的基部位置，成為一個(gè)獨(dú)立的分支，其支持率較高（MP樹中為78，ML樹中為76，BI樹中為100）。條鰍亞科和平鰭鰍科聚在一起構(gòu)成一個(gè)分支（lineage），支持率均在50以上：MP樹中為自展支持率（bootstrap value, BP）為50， ML樹中BP為68，BI樹中后驗(yàn)概率（posterior probability，PP）為94。該分支與花鰍亞科構(gòu)成姐妹群，然后再與沙鰍亞科一起構(gòu)成一個(gè)大的分支群。至于每個(gè)類群內(nèi)部物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，MP樹（圖3）、ML樹（圖4）和BI樹（圖5）的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)幾乎一致，只在部分類群（花鰍亞科中花鰍屬的三個(gè)物種及條鰍亞科中的4個(gè)物種）的分支順序上存在差異。

圖 3 基于ND4+5基因序列構(gòu)建的鰍超科魚類的MP樹Fig. 3 MP tree of Cobitoidea based on the ND4+5 gene sequences

圖 4 基于ND4+5基因序列構(gòu)建的鰍超科魚類的ML樹Fig. 4 ML tree of Cobitoidea based on the ND4+5 gene sequences

平鰭鰍科明顯分為兩個(gè)支系：平鰭鰍亞科（Balitorinae）和腹吸鰍亞科(Gastromyzoninae)，它們分別構(gòu)成單系群。腹吸鰍亞科構(gòu)成單系的支持率在3種構(gòu)樹方法中都為100%，平鰭鰍亞科的支持率分別為82%（MP樹）、68%（ML樹）和98%（BI樹）。條鰍亞科中，兩個(gè)南鰍屬（Schistura）的物種沒有聚在一起。在M P樹中，橫紋南鰍（Schisturafasciolata）與平頭平鰍（Oreonectes platycephalus）聚在一起。而在MP樹和BI樹中，橫紋南鰍（Schistura fasciolata）與Barbatula toni聚在一起。花鰍亞科中，花鰍屬（Cobitis）和泥鰍屬（Misgurnus）的物種都能分別構(gòu)成單系，且支持率很高（圖3～5）。比較不同構(gòu)樹方法的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ML樹和BI樹中花鰍屬各物種的聚類順序跟MP樹中的有所不同。沙鰍亞科在本研究中只包括兩個(gè)屬：沙鰍屬（Botia）和薄鰍屬（Leptobotia）（Chen，1980；Nelson，1994；Tang et al，2008），這兩個(gè)屬在3種樹中各自構(gòu)成單系，均得到較高的支持率。

3 討 論

3.1 ND4和ND5基因的特點(diǎn)及在系統(tǒng)發(fā)育分析中的應(yīng)用

mtDNA不同區(qū)段基因序列的進(jìn)化速度不一樣（Li & Shao, 2006）。因此，選取mtDNA上的不同基因或片段序列，可以進(jìn)行不同分類水平上的進(jìn)化研究。對于親緣關(guān)系較近的物種，一般選取選擇壓力小、進(jìn)化較快的基因序列；對于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種，則選取選擇壓力大、比較保守的基因序列。

NADH作為線粒體呼吸鏈上的一種功能蛋白，它的基因序列一般很少被用來研究系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。但從本研究的結(jié)果來看，適合解決科級水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，因而在進(jìn)行同一個(gè)目內(nèi)科間水平系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，ND4和ND5基因也不乏為一個(gè)好的分子標(biāo)記。

另外，在重建高階元的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系時(shí)，序列長度是一個(gè)非常需要考慮的問題。約3 kb長的序列被認(rèn)為是一個(gè)較為理想的長度（Miya et al，2006）。ND4+5基因全長3 387～3 443 bp，與cytb基因（1 140 bp）相比，包含更多的系統(tǒng)發(fā)育信息，將該標(biāo)記用于分子系統(tǒng)發(fā)育分析，可能會得到更為準(zhǔn)確的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

圖 5 基于ND4+5 基因序列構(gòu)建的鰍超科魚類的貝葉斯樹Fig. 5 Bayesian tree of Cobitoidea based on the ND4+5 gene sequences

就ND4和ND5基因而言，這兩個(gè)基因單獨(dú)用于系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究已有報(bào)道。Zhang et al（1999）分析12種的鱘形目魚類的ND4基因的序列變異，推測了部分鱘魚的親緣關(guān)系。 Mou et al（2005）以ND4L和ND4基因?yàn)闃?biāo)記研究了黑腹果蠅的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。Zhang et al（2006）對ND5基因進(jìn)行克隆和序列分析，進(jìn)一步確定了大黃魚的分類地位。Makita et al（2000）將ND5應(yīng)用于虎鳳蝶屬(Luehdorfia)的種間研究，結(jié)果顯示，虎鳳蝶屬的種和外群蝴蝶種間ND5基因差異較大，同屬內(nèi)不同物種間ND5基因的差異相對要小。

本研究將ND4和ND5基因及兩基因間的tRNA基因序列聯(lián)合起來，對鰍超科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，得到的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與線粒體基因組、核基因及形態(tài)學(xué)研究的結(jié)果較為一致，表明ND4+5基因序列應(yīng)用于科之間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的重建是可行的。至于該片段能否用于屬間或種間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析還有待進(jìn)一步研究。ND4+5基因易于擴(kuò)增，通過5對引物聯(lián)合擴(kuò)增測序可獲得其全序列。因此，對一些保存不太好的樣本，無法擴(kuò)增其核內(nèi)基因，ND4+5基因可以作為一個(gè)很好的備選分子標(biāo)記。

3.2 鰍超科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

鰍超科中關(guān)于鰍科和平鰭鰍科魚類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系問題，一致存在爭議。Sawada（1982）和Siebert（1987）基于外部形態(tài)和骨骼特征的分析結(jié)果認(rèn)為，鰍科只含兩個(gè)亞科：花鰍亞科和沙鰍亞科，他們認(rèn)為條鰍亞科與平鰭鰍科的成員有較近的親緣關(guān)系，條鰍亞科應(yīng)歸為平鰭鰍科。Nalbant和Bianco（1998）認(rèn)為Sawada（1982）研究中所用的骨骼性狀，在條鰍亞科和平鰭鰍科中較為相似是因?yàn)閮烧呲呁M(jìn)化形成的。因此，Nalbant和Bianco（1998）將條鰍亞科作為一個(gè)獨(dú)立的科對待。后來分子水平上的研究也認(rèn)為條鰍亞科和平鰭鰍科均存在較大的差異，也支持將條鰍亞科獨(dú)立為一個(gè)科；Sawada（1982）的鰍科（包括花鰍亞科和沙鰍亞科）并不構(gòu)成單系?；谶@兩點(diǎn)，花鰍亞科和沙鰍亞科被認(rèn)為應(yīng)提升到科的水平（Nablbant & Bianco，1998；Tang et al，2006；?lechtová et al，2007）。在系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上，Tang et al（2006）基于線粒體cytb和Dloop基因的分析結(jié)果認(rèn)為，條鰍類和花鰍類構(gòu)成姐妹群，再和平鰭鰍類聚在一起，沙鰍類位于更基部的位置；而核基因（?lechtová et al，2007）及線粒體全基因組（Saitoh et al，2006）的結(jié)果卻顯示，條鰍類和平鰭鰍類首先聚在一起，再和花鰍類構(gòu)成姐妹群，沙鰍類位于更基部的位置。

本研究以線粒體ND4+5基因作為分子標(biāo)記所得出的結(jié)果與核基因（?lechtová et al，2007）及線粒體全基因組（Saitoh et al，2006）作為分子標(biāo)記所得出的結(jié)果一致，即條鰍類和平鰭鰍類構(gòu)成姐妹群，再和花鰍類聚在一起，它們構(gòu)成的大分支再和沙鰍類聚在一起，Vaillantellidae處于所有鰍類的基部位置。本研究的結(jié)果與基于線粒體cytb和Dloop基因所得出的條鰍類和花鰍類親緣關(guān)系更近的結(jié)論不一致，這種差異可能是由于所使用的基因的長度差異造成的，長度越長，信息量越大，所反映的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系可能更加接近真實(shí)情況。

本研究中，Vaillantella處于所有鰍類的基部位置，成為一個(gè)獨(dú)立的分支，其支持率較高（MP樹中為78，ML樹中為76，BI樹中為100）。曾有研究對Vaillantella的系統(tǒng)發(fā)育位置持不同的觀點(diǎn)。Sawada（1982）和Siebert（1987）基于形態(tài)數(shù)據(jù)分析研究認(rèn)為，Vaillantella被分別歸為兩個(gè)不同科的物種。有人提出將這個(gè)屬劃分到一個(gè)獨(dú)立的科Vaillantellidae（Nalbant & Bǎnǎrescu，1977；?lechtová et al，2007）。我們的研究支持將其獨(dú)立為一個(gè)科。

本研究中分子系統(tǒng)樹顯示：條鰍亞科中兩個(gè)南鰍屬（Schistura）的物種沒有聚類在一起。在MP樹中，橫紋南鰍（Schistura fasciolata）與平鰍屬（Oreonectes）的平頭平鰍（Oreonectes platycephalus）聚在一起。而在MP樹和BI樹中，橫紋南鰍（Schistura fasciolata）與須鰍屬（Barbatula）的Barbatula toni聚在一起。由此推斷，南鰍屬可能不是一個(gè)單系，這與B?n?rescu和Nalbant（1995）及Tang et al（2006）的研究結(jié)果是一致的，其對應(yīng)的系統(tǒng)學(xué)問題需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

總之，ND4+5基因作為一個(gè)優(yōu)秀的分子標(biāo)記，具有3 400 bp左右的序列長度，包含較多的系統(tǒng)發(fā)育信息。該基因序列不僅容易進(jìn)行擴(kuò)增、測序，而且能構(gòu)建出可信度較高的系統(tǒng)發(fā)育樹。本研究的結(jié)果進(jìn)一步澄清了鰍超科魚類之間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的疑問，從分子水平上支持條鰍亞科與平鰭鰍科具有更近的親緣關(guān)系，從而表明該基因應(yīng)用于科之間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的重建是可行并可信的。

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Phylogenetic Relationships Among Cobitoidea Based on Mitochondrial ND4 and ND5 Gene Sequences

LIU Si-Qing1,2, ZHANG Jia-Bo1, TANG Qiong-Ying2, LIU Huan-Zhang2,*

(1.Huazhong Agricultural University, Wuhan430070,China; 2.Institute of Hydrobiology, the Chinese Academy of Sciences, Wuhan430072,China)

In the present study, we cloned and sequenced 10 new ND4 and ND5 gene sequences of Cobitoidea. These sequences were used to reconstruct phylogenetic relationships together with those of 15 other species downloaded from GenBank. The results showed that the length of ND4 gene sequence was 1 380?1 387 bp with ATG as starting codon and incomplete termination signal as terminated codon; the length of ND5 gene sequence was 1 821?1 839 bp with ATG as starting codon and TAA or TAG as terminated codon; three tRNA genes coding tRNAs that carry hisidine, serine and leucine respectively, were inserted between ND4 and ND5 genes. A, T, C and G accounted for 30.4%, 27.3%, 14.2% and 28.1% in ND4/ND5 gene (including intervening three tRNA genes). The content of A+T (57.7%) is higher than that of G+C (42.3%). The estimated Ti/Tv ratio was 1.586. WithDanio rerioandCyprinus carpioas outgroups, the phylogenetic relationships of Cobitoidea were analyzed using maximum parsimony (MP) method, maximum likelihood (ML) method and Bayesian analyses (BI). Results of all the three methods indicated that Cobitinae, Nemacheilinae, Botiinae, Balitoridae and Vaillantellidae were all monophyletic respectively, and their interrelationships were: (Vaillantellidae + (Botiinae + (Cobitinae + (Nemacheilinae + Balitoridae)))), which was consistent with the previous studies based on the whole mitogenome and some nuclear genes sequences (eg. RAG1 gene). However, the present results differ from those based upon other mtDNA genes sequences (e.g. the cytband D-loop showed that Nemacheilinae grouped with Cobitinaeforming sister-group, then they clustered with Balitoridae). The difference could be due to the phylogenetic information carried by different length sequence: Longer sequences carry more information and result in more reliable phylogenetic trees.

Cobitoidea; ND4/ND5 gene; Sequence analysis; Phylogeny

Q959.468; Q349; Q951.3

A

0254-5853-(2010)03-0221-09

10.3724/SP.J.1141.2010.03221

2009-06-02；接受日期：2009-10-30

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(40432003；30700072)；美國自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目CToL

*通訊作者 (Corresponding author)，Tel: 027-68780776，E-mail: hzliu@ihb.ac.cn

劉思情，女，碩士研究生