劉 野,李 群,李 賀,阮成江

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116029;2.大連民族學(xué)院生物技術(shù)與資源利用國家民委教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116605;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,沈陽 100161)

海濱錦葵莖尖組織培養(yǎng)再生體系的優(yōu)化

劉 野1,2,李 群3,李 賀2,阮成江2

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧大連 116029;2.大連民族學(xué)院生物技術(shù)與資源利用國家民委教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連 116605;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,沈陽 100161)

以莖尖為外植體,對海濱錦葵 (Kosteletzkya virginica)再生體系的優(yōu)化進(jìn)行了研究,結(jié)果表明:莖尖萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為MS+ IAA0.3 mg·L-1+ZT0.3 mg·L-1,萌發(fā)率為 91.11%;繼代增殖最適培養(yǎng)基為 MS+ IAA0.1 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1,增殖系數(shù)為 4.67;生根培養(yǎng)基為MS(蔗糖 3%、瓊脂 0.6%、pH值 5.8),生根率為 90%。煉苗移栽后,成活率可達(dá) 60%。

海濱錦葵;莖尖;組織培養(yǎng);植株再生

海濱錦葵 (Kosteletzkya virginica)為錦葵科多年生草本植物,自然分布于美國含鹽沼澤地帶,1992年作為發(fā)展鹽土農(nóng)業(yè)的鹽生植物從美國引進(jìn)中國,已在山東、遼寧、江蘇等沿海灘涂試種成功,是一種優(yōu)良的耐鹽油料植物[1],油脂含量與重要的經(jīng)濟(jì)作物大豆不相上下[2],作為生物柴油原料[3-4],具有很大的發(fā)展?jié)摿?。為進(jìn)一步提高其種子中油脂的含量,使其成為理想的生物柴油原料,可通過轉(zhuǎn)基因育種來進(jìn)行遺傳改良,而建立高效的植株再生體系則是轉(zhuǎn)基因育種成功的前提條件之一[5]。本實(shí)驗(yàn)以海濱錦葵莖尖為外植體,在不同的培養(yǎng)基上進(jìn)行莖尖萌發(fā)誘導(dǎo)、芽的繼代增殖以及植株再生培養(yǎng),以期獲得高頻再生體系。

1 材料與方法

1.1 材料

海濱錦葵種子于 2008年秋采自大連民族學(xué)院海濱錦葵試驗(yàn)地。

1.2 方法

1.2.1 無菌材料的獲得

海濱錦葵莖尖取自 3日齡的無菌苗,用鑷子和解剖刀除去子葉,以充分暴露被幼葉包裹著的莖尖分生組織 (顯微鏡下呈白色半透明圓錐狀)[6],切除莖尖頂端的生長點(diǎn)后取 0.5～1.0 mm的莖尖,用于離體培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)方法

以 MS(蔗糖 3%、瓊脂 0.8%、pH值 5.8)[7]培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,附加不同濃度的 IAA,ZT,KT,6-BA先誘導(dǎo)莖尖萌發(fā),再進(jìn)行繼代增殖,之后將高約 2.5～3 cm的增殖苗轉(zhuǎn)移到不加任何激素的MS培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)生根。激素類物質(zhì)均過濾滅菌,在基本培養(yǎng)基高溫高壓滅菌后加入[7]。

1.2.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度:(26±1)℃;相對濕度:70%～80%;光照:14 h·d-1;光強(qiáng):2 000lx[7]

1.2.4 煉苗移栽

當(dāng)幼苗的根長到 2 cm左右時(shí)去除封口膜,在室內(nèi)自然光下煉苗 3 d。然后取出并漂洗黏附于根上的培養(yǎng)基和松散的愈傷組織,立即移植到含水量 60%的營養(yǎng)土 (V(腐殖土)∶V(珍珠巖)=3∶1)中,并保持營養(yǎng)土表面濕潤[7]。培養(yǎng) 5 d左右移入花盆并轉(zhuǎn)至室外培養(yǎng),15 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.5 計(jì)算方法

萌發(fā)率 =(萌發(fā)生長的外植體數(shù) /接種外植體數(shù))×100%;

褐化率 =(褐化的外植體數(shù)/接種外植體數(shù))×100%;

增殖系數(shù) =(增殖芽數(shù) /接種芽數(shù))×100%;

生根率 =(生根苗數(shù) /接種的苗數(shù))×100%;

成活率 =(成活苗/移栽的組培苗總數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種發(fā)芽率

海濱錦葵的莖尖接種到附加不同濃度的I

AA,KT,ZT和 6-BA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)萌發(fā),5～8 d莖尖分生組織開始萌動(dòng) (如圖 1、圖 2),其中有的在基部形成愈傷組織,有的芽開始伸長,隨后芽生長速度加快。誘導(dǎo) 15 d結(jié)果顯示 (見表 1),5種培養(yǎng)基對莖尖的萌發(fā)有極顯著差異 (F=50.75,P＜0.01)。第二種處理對莖尖的萌發(fā)效果最好,萌發(fā)率為 91.11%。

圖 1 萌動(dòng)的莖尖

圖 2 誘導(dǎo) 15 d后萌發(fā)的莖尖

表 1 IAA,KT,ZT與 6-BA對海濱錦葵莖尖誘導(dǎo)分化的影響

2.2 繼代增殖培養(yǎng)及植株再生

繼代增殖 15 d后統(tǒng)計(jì)芽增殖情況 (如圖 3),結(jié)果表明,第一種處理對芽誘導(dǎo)效果最好,增殖系數(shù)為 4.67(見表 2),生長旺盛且多為 3個(gè)以上叢生芽。生根培養(yǎng) 10 d左右可產(chǎn)生不定根,15 d后生根率為 90%,小苗生根速度快,莖粗壯,葉片生長旺盛,根系非常發(fā)達(dá) (如圖 4)。煉苗移栽時(shí)要注意保持營養(yǎng)土表面濕潤,控制室內(nèi)濕度在 70%～80%,溫度在 25℃左右,培養(yǎng) 5 d后移栽入花盆[7],轉(zhuǎn)至室外培養(yǎng)。統(tǒng)計(jì)幼苗成活率為 60%(如圖 5)。

表 2 IAA,KT,ZT與 6-BA對海濱錦葵莖尖繼代增殖的影響

圖 3 芽的增殖

圖 4 生根培養(yǎng)基上的生根情況

圖 5 再生植株

3 討 論

莖尖萌發(fā)的過程中出現(xiàn)了不同程度的褐化現(xiàn)象,可以在培養(yǎng)基中添加一些抗氧化物質(zhì),如添加PVP[8]、活性炭[9]來解決褐化問題。海濱錦葵組織培養(yǎng)過程中的重點(diǎn)和難點(diǎn)是芽的繼代增殖。外植體的選擇、激素的選擇尤其是細(xì)胞分裂素的選擇都是至關(guān)重要的。本實(shí)驗(yàn)選取苗高 2.5～3.0 cm,芽粗壯,長有真葉且顏色嫩綠的莖尖進(jìn)行繼代增殖,取得了較好的效果。Cook等[10]、鄭熙等[7]和郭予琦等[11]分別使用 1.0 mg·L-1NAA和 10 mg·L-12-iP、0.1 mg·L-1IAA和 0.5 mg·L-1L ZT、1.0 mg·L-1NAA和 10 mg·L-12-iP組合成功的誘導(dǎo)出海濱錦葵不同部位的愈傷組織不定芽;郭予琦等[11]在實(shí)驗(yàn)中指出,KT對誘導(dǎo)海濱錦葵莖段愈傷組織不定芽的作用極弱;但是張寶紅等[12]在棉花莖尖分生組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中指出,KT的添加對芽的增殖和生長是有利的,棉花和海濱錦葵同屬于錦葵科植物。本實(shí)驗(yàn)以海濱錦葵莖尖為外植體 ,利用 0.1 mg·L-1IAA、0.5 mg·L-1KT組合,芽的增殖系數(shù)達(dá)到了 4.67,首先表明了相同的激素對不同的外植體的作用效果不同;其次表明當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長素濃度比例處于較高水平時(shí)有利于芽的增殖[13],細(xì)胞分裂素在誘導(dǎo)芽的增殖時(shí)起主導(dǎo)作用[14]。鄭熙等[7]、郭予琦等[11]和Cook等[10]的植株再生實(shí)驗(yàn)整個(gè)周期分別用了約130,120,93 d,而本實(shí)驗(yàn)只用了 65 d,從很大程度上縮短了海濱錦葵植株再生的周期。

4 結(jié) 語

本實(shí)驗(yàn)以海濱錦葵莖尖為外植體進(jìn)行植株再生,莖尖萌發(fā)最適培養(yǎng)基為MS+ IAA0.3 mg·L-1+ZT0.3 mg·L-1,萌發(fā)率為 91.11%;繼代增殖最適培養(yǎng)基為 MS+ IAA0.1 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1,增殖系數(shù)為 4.67;生根培養(yǎng)基為 MS(蔗糖 3%、瓊脂 0.6%、pH值 5.8),生根率為 90%。并進(jìn)行了溫室煉苗與移栽等技術(shù)研究,幼苗成活率達(dá)到 60%。實(shí)驗(yàn)過程成功地優(yōu)化了海濱錦葵莖尖組織培養(yǎng)再生體系,對進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)基因方法培育海濱錦葵優(yōu)良新品系具有重要的意義。

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Optim ization of Tissue Culture Regeneration System ofM eristem ofKosteletzkya virginica

L IU Ye1,2,L I Qun3,L I He2,RUAN Cheng-j iang2
(1.College ofLife Science,LiaoningNormalUniversity,Dalian Liaoning 116029,China;2.KeyLaboratory ofBiotechnology&Bio-ResourcesUtilization,State Ethnic Affairs Commission andMinistry of Education,Dalian NationalitiesUniversity,Dalian Liaoning 116605,China;3.College ofBiological Science and Technology,ShenyangAgriculturalUniversity,ShenyangLiaoning 100161,China)

We studied optimization of the regeneration system ofKosteletzkya virginicausingmeristem as the explant.The results showed thatMS+ IAA0.3 mg·L-1+ZT0.3 mg·L-1was the best culture medium for ger mination with a germination rate of 91.11%;the best subculture medium wasMS+ IAA0.1 mg·L-1+ZT0.5 mg·L-1,with a multiplication factor of 4.67;the bestmedium for rootingwasMS(sucrose at3%,agar at0.6%and pH at 5.8)with a 90%rooting rate.The survival rate of hardened-off seedlingswas up to 60%after being transplanted.

Kosteletzkya virginica;meristem;tissue culture;plant regeneration

Q943.1

A

1009-315X(2010)01-0009-04

2009-10-25

國家“十一五”科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目子專題 (2006BAD09A04);中國博士后科學(xué)基金特別資助項(xiàng)目(200801371);中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (20070420990);江蘇省博士后基金資助項(xiàng)目 (0702018C)。

劉野 (1981-),男,遼寧興城人,遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士研究生,主要從事植物生物技術(shù)研究。

阮成江 (1972-),男,河南新縣人,教授,博士,學(xué)校優(yōu)秀學(xué)科帶頭人,碩士生導(dǎo)師,主要從事植物進(jìn)化適應(yīng)和遺傳育種研究,E-mail:ruan@dlnu.edu.cn。

(責(zé)任編輯 鄒永紅)