任石茍 李奠礎(chǔ) 許志芳

（1山西輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，太原030013） （2山西瑞潔生物科技有限公司，侯馬043000）

·應(yīng)用研究·

生物傳感分析儀在乳酸發(fā)酵中的應(yīng)用研究

任石茍1*李奠礎(chǔ)1許志芳2

（1山西輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，太原030013） （2山西瑞潔生物科技有限公司，侯馬043000）

簡述了生物傳感分析儀的檢驗(yàn)原理，對5個發(fā)酵液樣品進(jìn)行了測定，其結(jié)果是精密度和測定周期都優(yōu)于常規(guī)分析。

生物傳感儀；乳酸；葡萄糖；固定化酶

乳酸菌發(fā)酵的特點(diǎn)是邊糖化、邊發(fā)酵，既有淀粉質(zhì)水解為葡萄糖，又有葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸。葡萄糖的變化可衡量發(fā)酵正常與否，以消耗葡萄糖值的數(shù)量來確定發(fā)酵水平的高低，及時準(zhǔn)確地測定發(fā)酵料中殘還原糖的含量，以便了解發(fā)酵過程中糖類消耗情況。利用先進(jìn)的跟蹤檢測技術(shù)在人為條件控制下使耗糖、產(chǎn)酸達(dá)到最佳狀態(tài)，將有助于指導(dǎo)發(fā)酵生產(chǎn)。

目前，國內(nèi)乳酸發(fā)酵生產(chǎn)中測定還原糖一般采用化學(xué)分析法，應(yīng)用較為普遍的有斐林定糖法。斐林定糖法始于20世紀(jì)40年代，至今仍常見于我國的工廠和實(shí)驗(yàn)室，是傳統(tǒng)的測糖方法，其實(shí)質(zhì)為二價銅在堿性條件下被還原糖中游離羰基還原為一價的氧化亞銅。因此，堿性斐林氏溶液測定的還原糖類應(yīng)該包括：麥芽糖、乳糖、雙糖等具有還原性的糖類。該測定方法的適用范圍主要為發(fā)酵液中的總糖和殘?zhí)堑暮?。該法操作繁瑣，也容易受還原物質(zhì)的干擾影響測定結(jié)果。另外，其結(jié)果需由經(jīng)驗(yàn)數(shù)字換算，用標(biāo)準(zhǔn)糖液對照分析，故在分析操作時要嚴(yán)格遵循規(guī)定的操作方法進(jìn)行，否則將會引入較大誤差。

生物傳感器是利用酶作為分子識別元件，由于酶具有高選擇性及專一性的特點(diǎn)，使得生物傳感器在樣品分析中不需要對樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理，實(shí)現(xiàn)了簡單、快速分析的目的。他是迄今為止能在眾多成分存在時，用酶電極法專一性地、快速、準(zhǔn)確地定量得到葡萄糖和乳酸含量的方法之一，該方法已納入國家標(biāo)準(zhǔn)。

1 生物傳感分析儀檢驗(yàn)原理

SBA-40C型生物傳感分析儀是以固定化酶為關(guān)鍵元件，由微電腦控制雙指標(biāo)智能化儀表。他具有兩支生物探測電極，可以用一份樣品在20 s同時得到兩種物質(zhì)的定量分析結(jié)果，同時自動完成沖洗循環(huán)，然后進(jìn)行下一次的測定?？梢杂呻娔X自動定標(biāo)，以達(dá)到精確的定量測定結(jié)果。

SBA-40C型生物傳感分析儀是利用酶促反應(yīng)來定量，其工作原理為：固定化酶針對性地專一催化某一底物生成葡萄糖酸、丙酮酸等產(chǎn)物和過氧化氫。其反應(yīng)過程為：

其中：固定化酶有谷氨酸氧化酶、葡萄糖氧化酶或乳酸氧化酶；底物有谷氨酸、葡萄糖、乳酸；產(chǎn)物有（α－酮戊二酸＋NH4）、（丙酮酸+H2O）、（葡萄糖酸+H2O2）。

酶是一種特殊的具有催化活性的蛋白質(zhì)，他的催化活性隨保存時間的延長或測定樣品次數(shù)的增加而逐步降低。但酶經(jīng)固定化處理后，這一過程會顯著變慢。在固定化酶膜的保存期內(nèi)，可以近似地把酶的活性看作不變。H2O2電極與固定化酶膜緊貼在一起，酶只在局部位置上起作用。在較短時間內(nèi)，可以認(rèn)為緩沖液中樣品和H2O2濃度不變。酶膜上底物濃度Sd是緩沖液中的底物向膜內(nèi)滲透和酶反應(yīng)分解的綜合結(jié)果。根據(jù)菲克擴(kuò)散第一定律和酶反應(yīng)米氏動力學(xué)公式，當(dāng)被測物的濃度很低時（S<

其中，Dd為底物通過支撐膜向酶膜層的擴(kuò)散系數(shù)；S為緩沖液中的底物濃度；t為酶反應(yīng)時間；Vmax為最大反應(yīng)速度；Km為米氏常數(shù)。因開始測定時Sd=0，計(jì)算后得到：

另外，電極表面的H2O2的濃度與酶生成H2O2速度和H2O2向緩沖溶液中的擴(kuò)散速度有關(guān)，電極表面H2O2濃度C與酶反應(yīng)時間t的關(guān)系為：

其中，DH為H2O2通過支撐膜向緩沖液的擴(kuò)散系數(shù)。把（1） 式代人（2） 式得到電極表面H2O2濃度C隨時間的變化關(guān)系為：

H2O2濃度的變化速率達(dá)到最大時，d2C/dt=0，此時H2O2濃度變化速率為：

實(shí)驗(yàn)表明，對同一酶膜，不同濃度樣品達(dá)到最大反應(yīng)速度所需時間t是一致的，所以e-Bt為一常數(shù)。在電極表面，H2O2變化的最大速率與被測底物的濃度S成正比。通過測定電極表面H2O2變化的最大速率，并與標(biāo)準(zhǔn)底物作對比，即可計(jì)算出被測樣品的濃度。

正是基于這一原理，把固定化酶固定在過氧化氫電極上，反應(yīng)過程中產(chǎn)生的過氧化氫與葡萄糖或L-乳酸含量成正比，過氧化氫與過氧化氫電極接觸產(chǎn)生電信號，電信號經(jīng)過放大處理，可直接顯示測定結(jié)果。由于產(chǎn)物過氧化氫的量與底物葡萄糖或L-乳酸的量呈線性關(guān)系，通過檢測過氧化氫的生成量可得到葡萄糖或L-乳酸的含量。

2 試驗(yàn)部分

2.1 儀器及試劑

SBA－40C型生物傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所；

SBA系列分析儀專用50mg/dL乳酸、100mg/dL谷氨酸－葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液；

SBA系列分析儀專用緩沖劑：每包緩沖劑可配制5000mL緩沖液，使用時，每包緩沖劑加入5000mL蒸餾水，充分搖勻使其完全溶解。

2.2 試驗(yàn)過程：

2.2.1 采樣

發(fā)酵過程中的采樣代表著發(fā)酵某個時段及運(yùn)行期間、發(fā)酵液中產(chǎn)酸和耗糖的情況，因此樣品必須具有普遍性，因此在發(fā)酵專用取樣口進(jìn)行取樣時，用蒸汽進(jìn)行滅菌處理后，將料液自由放出一定量后，用發(fā)酵液清洗取樣杯三次，接取相應(yīng)數(shù)量的料液進(jìn)行檢測。

發(fā)酵液樣品編號為：1號樣品（0 h）、2號樣品（12 h）、3號樣品 （24 h）、4號樣品 （36 h）、5號樣品（48 h）、6號樣品（60 h）。

2.2.2 樣品預(yù)處理

取經(jīng)過濾后的樣品1 mL，在容量瓶中用蒸餾水定容至250 mL，使其樣品稀釋到0 mg/100mL～100 mg/100mL范圍內(nèi)，即為待測樣品。用SBA-40C生物傳感分析儀對發(fā)酵液中的乳酸含量及殘?zhí)呛窟M(jìn)行測定，緩沖劑為SBA系列分析儀專用緩沖劑。

2.2.3 樣品測定

定標(biāo)：開機(jī)后，把50 mg/dL乳酸、100 mg/dL谷氨酸－葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液注入反應(yīng)池，進(jìn)樣量25 μL，20 s后顯示打印數(shù)據(jù)。反復(fù)測定乳酸－葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，當(dāng)儀器穩(wěn)定后，即前后兩針的結(jié)果相對誤差小于1%時，儀器便自動定好標(biāo)，標(biāo)志是進(jìn)樣燈（綠燈）一直亮，不閃動。

樣品測定：定標(biāo)后注入25 μL待測發(fā)酵液樣品于反應(yīng)池中，20 s后顯示打印結(jié)果，屏幕顯示乳酸含量及葡萄糖含量。見表1。

表1 樣品檢測打印結(jié)果

同時，以斐林氏滴定法進(jìn)行對比測定。

2.2.4 結(jié)果記錄

根據(jù)樣品的稀釋情況按以下兩個公式分別計(jì)算L－乳酸及殘?zhí)堑暮浚?jì)算結(jié)果見表2。

表2 樣品計(jì)算結(jié)果

式中：250——稀釋倍數(shù)；

1 000——單位換算。

采用斐林氏滴定法對同一樣品殘?zhí)呛窟M(jìn)行的測定結(jié)果見表3。

表3 裴林氏滴定法測定殘?zhí)呛拷Y(jié)果

3 結(jié)果討論

3.1 生物傳感儀測定精密度

生物傳感儀測定的殘?zhí)呛拷Y(jié)果分析見下頁表4、表5、表6。

3.2 斐林氏測定精密度（見下頁表7）

3.3 測定精密度比較

通過表4～表7分析比較，可以看出應(yīng)用生物傳感儀分析檢測樣品的精密性較斐林氏滴淀法測定結(jié)果要高。

3.4 測定周期

斐林氏檢測方法測糖首先需要按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行準(zhǔn)確的藥品配制及標(biāo)定，檢測過程中，除了要進(jìn)行一定的稀釋外，在滴定過程中還需要加熱煮沸，消耗的時間較為長，操作繁瑣，其結(jié)果需由經(jīng)驗(yàn)數(shù)字換算，用標(biāo)準(zhǔn)糖液對照分析，測定周期約為20 min。采用EDTA絡(luò)合滴定法測乳酸含量，也需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與標(biāo)定。

SBA－40C生物傳感儀可以同時檢測發(fā)酵液中L－乳酸和葡萄糖的含量，僅僅需要提前進(jìn)行設(shè)備的預(yù)熱和定標(biāo)，預(yù)熱在取樣的同時則可以打開儀器使其自行運(yùn)行，工作人員取回樣品后即可進(jìn)行定標(biāo)，定標(biāo)20 s可得到結(jié)果，再經(jīng)25 s自動沖洗行下一次測定，3次定標(biāo)即可進(jìn)行樣品的檢測，測定周期約為 8 min～10 min。

4 結(jié)論

生物傳感分析儀具有測定速度快，測定精度高，每次測定的成本低，操作簡單的特點(diǎn)。對發(fā)酵工序中液化程度也可進(jìn)行檢測。生產(chǎn)實(shí)踐中，可根據(jù)實(shí)際情況對樣品的稀釋度進(jìn)行調(diào)整，從而進(jìn)一步

的提高生物傳感儀檢測分析的精密度。另外，如何使生物傳感儀實(shí)現(xiàn)真正的在線檢測，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)乳酸發(fā)酵的在線控制，將會成為研究人員感興趣的課題。

表4 1號樣品生物傳感儀測定殘?zhí)呛拷Y(jié)果分析

表5 3號樣品生物傳感儀測定殘?zhí)呛拷Y(jié)果分析

表6 5號樣品生物傳感儀測定殘?zhí)呛拷Y(jié)果分析

表7 斐林氏法測定殘?zhí)呛拷Y(jié)果分析

［1］黃潔，宋紀(jì)蓉，史紅兵，等.蘋果發(fā)酵液中殘余還原糖的測定方法比較［J］.工業(yè)微生物，2001，31（3）：38-40.

［2］馮洽平，吳平，羅澤友.生物傳感器用于葡萄酒中葡萄糖含量測定的研究［J］.四川輕化工學(xué)院學(xué)報，2003，16（1）：56-58.

［3］朱思榮，周萬里，馮東，等.SBA-70型血糖一乳酸自動分析儀的研制［J］.分析儀器，2004（4）：15-19.

Research on the application of biological sensor in lactic acid fermentation

RENShi-gou1*LI Dian-chu1XUZhi-fang2
1（Shanxi vocational and technical college oflight industry,Taiyuan 030013，China）2
（Shanxi ruijie biotechnologycompanyLtd.，Houma 043000，China）

The principle of the biological sensor was introduced.Five lactic acid fermentation samples were detected.The results showed that the accuracyand detection period were better than the normal analysis.

biological sensor； lactic acid；clucose；immobilized enzyme

TS201.1

A

1673-6004（2011）03-0047-05

*任石茍，男，1964年出生，1988年畢業(yè)于無錫輕工業(yè)學(xué)院（現(xiàn)江南大學(xué)）工業(yè)發(fā)酵專業(yè)，工程碩士，講師。

2011-09-16