余 倩

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東 廣州 510225;2.中山大學(xué) 有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275)

1972年Kerr等人［1］首次提出細(xì)胞凋亡的概念，即在一定的生理或病理?xiàng)l件下，細(xì)胞受內(nèi)在遺傳機(jī)制控制，自動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程。細(xì)胞凋亡有明顯形態(tài)學(xué)和生化學(xué)的特征，形態(tài)學(xué)特征包括:細(xì)胞核濃縮和片段化，胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞體急劇變小，細(xì)胞骨架解體，且常伴隨有細(xì)胞質(zhì)膜出泡現(xiàn)象［2］。生化學(xué)特征包括:染色質(zhì)片段化，形成長(zhǎng)度180～200 bp整數(shù)倍的寡聚核苷酸片段，瓊脂糖凝膠電泳時(shí)呈現(xiàn)“梯狀”條帶 (DNA ladder)。

在多細(xì)胞生物體中，細(xì)胞凋亡作為一種抗病毒應(yīng)答機(jī)制能限制入侵細(xì)胞中的病毒，從而減少子代病毒的產(chǎn)生，及造成流產(chǎn)性感染［3－5］。目前已發(fā)現(xiàn)多種桿狀病毒可誘導(dǎo)昆蟲(chóng)離體細(xì)胞凋亡，如野生型苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒誘導(dǎo)?；页嵋苟闟.littoralis細(xì)胞 SL2 凋亡等［6］。

斜紋夜蛾 (Spodoptera litura，Splt)和甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua，Se)同屬夜蛾科灰翅夜蛾屬的昆蟲(chóng)，親緣關(guān)系很近，且斜紋夜蛾核多角體病毒 (Splt nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV和SeMNPV基因組相似性很高［7－8］，但這兩種病毒不能交叉感染各自宿主。SeMNPV感染SpLi-221會(huì)引起細(xì)胞凋亡［9］，而SpltMNPV感染Se301的研究還未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。本文在顯微水平和亞顯微水平上對(duì)SpltMNPV感染離體細(xì)胞Se301的過(guò)程進(jìn)行了描述，并對(duì)感染失敗原因進(jìn)行了初步分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 昆蟲(chóng)細(xì)胞與病毒 野生型SpltMNPV中山大學(xué)分離株由本實(shí)驗(yàn)室保存。SeMNPV－SeUS1引自美國(guó)加州大學(xué)Riverside分校B.A.Federici教授實(shí)驗(yàn)室。甜菜夜蛾細(xì)胞Se301由荷蘭Wageningen大學(xué)J.M.Vlak教授惠贈(zèng)，用φ=10%胎牛血清的Grace's培養(yǎng)基(Invitrogen)27℃培養(yǎng)。

1.1.2 供試?yán)ハx(chóng) 斜紋夜蛾、甜菜夜蛾幼蟲(chóng)由本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)蟲(chóng)室提供，為人工飼料飼養(yǎng)的健康幼蟲(chóng)。人工飼料配方見(jiàn)參考資料［10］，飼養(yǎng)溫度27～28℃。

1.1.3 試劑 DAPI(4'，6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride)購(gòu)自Roche公司;細(xì)胞總DNA提取試劑盒購(gòu)自Takara。

1.2 方法

1.2.1 病毒多角體擴(kuò)增 將病毒多角體涂布于人工飼料表面喂飼四齡初昆蟲(chóng)幼蟲(chóng)，感染4～5 d后收集呈現(xiàn)典型病毒感染癥狀的幼蟲(chóng) (蟲(chóng)體倒掛，身體腫脹，呈灰白色)，置室溫下靜置2～3 d讓其自然發(fā)酵。用10倍的PBS懸浮發(fā)酵的蟲(chóng)尸，經(jīng)4層紗布過(guò)濾，濾液經(jīng)3 000 r/min離心10 min，沉淀物重懸于適量PBS中，600 r/min離心5 min，收集上清。如此重復(fù)3～4次，直至多角體懸浮液呈乳白色，光學(xué)顯微鏡檢查在多角體懸液中雜質(zhì)很少，即為較純的病毒多角體。

1.2.2 病蟲(chóng)血淋巴制備 用多角體喂飼四齡初幼蟲(chóng)，感染3 d后經(jīng)鏡檢有極少量多角體出現(xiàn)即取血淋巴。用φ=70%乙醇將病蟲(chóng)表面消毒，剪開(kāi)腹足，血淋巴滴入含w=0.1%苯基硫脲的Grace's培養(yǎng)基中，3 000 r/min離心10 min，除去血淋巴細(xì)胞，取上清經(jīng)過(guò)濾滅菌保存，供細(xì)胞感染用。

1.2.3 病毒感染 在35 mm培養(yǎng)皿中以0.5×106個(gè)細(xì)胞/孔密度接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Se301細(xì)胞;待細(xì)胞貼壁1 h后，移出培養(yǎng)基，病毒以MOI為1感染細(xì)胞，27℃培養(yǎng)1 h并間隔搖動(dòng)培養(yǎng)板;1 h后棄感染液，以無(wú)抗生素?zé)o血清Grace's培養(yǎng)基洗2次，然后加入Grace's培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。加入病毒即開(kāi)始計(jì)時(shí)，于感染后不同時(shí)間收集取樣，3 000 r/min離心10 min，棄上清，細(xì)胞沉淀先放入液氮速凍30 min，再放入－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 病毒滴度測(cè)定 采用終點(diǎn)稀釋法對(duì)病毒進(jìn)行定量測(cè)定［10］，具體步驟參考 O'REILLY主編的《桿狀病毒表達(dá)載體》。

1.2.5 電鏡樣品制備及觀察 用病毒SeMNPV和SpltMNPV以MOI=1分別感染Se301細(xì)胞，于感染后0、24、48、72、96和120 h用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，2 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞。按常規(guī)電鏡樣品制備方法制備，簡(jiǎn)述包括前固定、漂洗、后固定、脫水、浸透、包埋、聚合、切片、染色步驟。鏡檢:用JEM－100CX型電鏡在加速電壓80 KV下觀察。

1.2.6 DAPI染色 將固體粉末用雙蒸水稀釋成終質(zhì)量濃度1～5 mg/mL作為儲(chǔ)存液;用甲醇稀釋儲(chǔ)存液至終質(zhì)量濃度1 μg/mL作為工作液。具體操作步驟參見(jiàn)Roche公司產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。使用340 nm/380 nm濾片進(jìn)行熒光顯微鏡觀察。

1.2.7 細(xì)胞總DNA的提取 按照Merck公司的細(xì)胞總DNA提取試劑盒 (Suicide TrackTMDNA Ladder Isolation Kit)操作手冊(cè)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 SpltMNPV感染Se301細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡觀察SpltMNPV按照MOI=1的感染復(fù)數(shù)感染Se301

細(xì)胞，感染后每天用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞觀察。正常Se301細(xì)胞形態(tài)為長(zhǎng)形梭狀 (圖1a);SeMNPV感染Se301細(xì)胞后細(xì)胞出現(xiàn)典型的感染癥狀，如細(xì)胞變圓;后期細(xì)胞中能觀察到大量多角體 (圖1b)。SpltMNPV感染Se301細(xì)胞光鏡觀察結(jié)果顯示在感染后24～120 h期間細(xì)胞出現(xiàn)明顯病理現(xiàn)象，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)病理癥狀越來(lái)越嚴(yán)重，在24～48 h時(shí)出現(xiàn)極少量凋亡小體，大部分細(xì)胞出現(xiàn)感染癥狀，如細(xì)胞變圓變大;也可觀察到空泡細(xì)胞和少量細(xì)胞聚集 (圖1c)，到96～120 h時(shí)出現(xiàn)大量細(xì)胞聚集，空泡細(xì)胞明顯增多，但始終觀察不到病毒多角體 (圖1d)。

2.2 SpltMNPV感染Se301細(xì)胞的電子顯微鏡觀察

圖1 病毒感染的Se301細(xì)胞光鏡照片F(xiàn)ig.1 Light micrographs of Se301 cells infected

圖2 SpltMNPV感染的Se301細(xì)胞電鏡照片F(xiàn)ig.2 Electron micrographs analysis of Se301 cells infected with SpltMNPV

光鏡觀察顯示感染細(xì)胞除產(chǎn)生少量凋亡小體外大部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡和細(xì)胞聚集現(xiàn)象，為了更清楚準(zhǔn)確的觀察細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了什么病理變化，這些空泡細(xì)胞內(nèi)到底有沒(méi)有DNA存在，融合在一起的細(xì)胞是什么狀態(tài)，我們收取SpltMNPV感染Se301細(xì)胞后24，48，72，96，120 h樣品進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果如圖2顯示:正常Se301細(xì)胞成單個(gè)長(zhǎng)橢圓形，具有完整細(xì)胞器、細(xì)胞膜和核膜;細(xì)胞質(zhì)和染色質(zhì)分布均勻 (圖2:a)。SeMNPV感染Se301細(xì)胞72 h整個(gè)細(xì)胞變成圓形，細(xì)胞質(zhì)均勻分布，但細(xì)胞核膨大，病毒在核中央形成了病毒發(fā)生基質(zhì)，再放大數(shù)倍后可觀察到細(xì)胞核內(nèi)有許多正在包裝和已經(jīng)包裝好的病毒粒子 (圖2:b，c)。SpltMNPV感染Se301細(xì)胞電鏡觀察顯示:從感染后24～120 h均能觀察到細(xì)胞病理現(xiàn)象，且晚期更劇烈。有些細(xì)胞只能看見(jiàn)細(xì)胞核膜包裹著高度凝聚的染色質(zhì)，觀察不到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在兩個(gè)細(xì)胞間無(wú)清晰界限只有許多空泡存在;有一些細(xì)胞變圓細(xì)胞核膜完整且細(xì)胞核完好但細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)許多空泡;有一些細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)完全被泡狀化且細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)被高度濃縮凝聚并附于核膜周邊 (圖2:d，e，f);以上結(jié)果可被判斷細(xì)胞出現(xiàn)了早期凋亡癥狀，但始終沒(méi)有進(jìn)行至細(xì)胞凋亡晚期出現(xiàn)凋亡小體。

2.3 DAPI染色

電鏡結(jié)果表明細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡特征，為了更直觀地觀察細(xì)胞 DNA的變化，我們用 DAPI對(duì)SpltMNPV感染Se301細(xì)胞進(jìn)行染色。DAPI是一種能與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料﹐常被用于凋亡的檢測(cè);DAPI染劑能被紫外光激發(fā)，在熒光顯微鏡下觀察為藍(lán)色。

熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示:正常Se301細(xì)胞由于細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，DAPI染色后細(xì)胞核呈現(xiàn)為明亮而均勻的圓形 (圖3:a);而被感染的Se301細(xì)胞從感染后24～120 h有明顯變化(圖3:b，c，d)，例如有些細(xì)胞染色質(zhì)分布不均，高度凝聚成不規(guī)則形狀如月牙形，并集中在細(xì)胞核邊緣;有些細(xì)胞細(xì)胞核染色熒光強(qiáng)度很弱，形狀也不規(guī)則;還有些細(xì)胞中的DNA已經(jīng)斷裂，染色后呈現(xiàn)為許多個(gè)熒光小點(diǎn)并集中在核邊緣上，細(xì)胞至感染后期也無(wú)太大改變并未見(jiàn)有大量凋亡小體產(chǎn)生。以上結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞出現(xiàn)了早期凋亡現(xiàn)象，而未進(jìn)行至晚期，這些結(jié)果與電鏡觀察結(jié)果一致。

圖3 DAPI染色的Se301細(xì)胞熒光顯微鏡觀察Fig.3 Micrographes of Se301 Stained by DAPI

2.4 DNA ladder

細(xì)胞凋亡的另一個(gè)特征是出現(xiàn)DNA ladder現(xiàn)象，這屬于凋亡晚期事件但比極晚期事件出現(xiàn)凋亡小體早。為了鑒定細(xì)胞凋亡進(jìn)程是否進(jìn)行至DNA ladder階段，收取 SpltMNPV感染 Se301細(xì)胞24，48和72 h的細(xì)胞樣品，提取其細(xì)胞總DNA進(jìn)行電泳。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4顯示:SpltMNPV感染Se301細(xì)胞24，48和72 h樣品與正常Se301細(xì)胞及SeMNPV感染Se301細(xì)胞72 h樣品一樣都沒(méi)有出現(xiàn)典型梯度條帶。這些結(jié)果說(shuō)明SpltMNPV感染Se301細(xì)胞從24～72 h都未進(jìn)行至DNA梯度條帶的凋亡晚期階段。

圖4 Se301細(xì)胞總DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig.4 Agarose gel electrophoresis of oligonucleosomal laddering isolated from Se301 cells

2.5 一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

光鏡檢測(cè)一直未觀察到SpltMNPV感染Se301細(xì)胞中有多角體產(chǎn)生，說(shuō)明細(xì)胞的早期凋亡對(duì)病毒感染以及子代病毒產(chǎn)生具有嚴(yán)重影響。進(jìn)行TCID50一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定檢測(cè)病毒是否產(chǎn)生了BV。收取SpltMNPV感染Se301細(xì)胞24，48，72，96，120 h的細(xì)胞上清，同時(shí)也收取相應(yīng)時(shí)間的SpltMNPV感染SpLi-221細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照，用SpLi-221細(xì)胞測(cè)定SpltMNPV滴度。結(jié)果顯示:SpltMNPV感染SpLi221細(xì)胞后病毒產(chǎn)生了大量有感染性的子代病毒，且感染后72 h達(dá)到最大值;而SpltMNPV感染Se301細(xì)胞樣品中檢測(cè)不到有感染性的BV產(chǎn)生。

圖5 SpltMNPV感染SpLi－221或Se301細(xì)胞的BV增長(zhǎng)曲線Fig.5 The BV replicative curves generated from an infection of SpltMNPV in Se301 or SpLi-221 cells

3 討論

本研究通過(guò)光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡對(duì)SpltMNPV感染非受納細(xì)胞Se301進(jìn)行形態(tài)觀察，以及DAPI染色等檢測(cè)，首次發(fā)現(xiàn)被SpltMNPV感染的Se301細(xì)胞發(fā)生了早期凋亡但未能進(jìn)行至晚期凋亡出現(xiàn)凋亡小體，本結(jié)果又一次證明了細(xì)胞凋亡是宿主抵抗病毒感染的防御機(jī)制，具有普遍的生物學(xué)意義。先前已有關(guān)于桿狀病毒誘導(dǎo)離體細(xì)胞凋亡的報(bào)道:如野生型AcMNPV感染的SL2［6］，美國(guó)白蛾核多角體病毒 (HyphantriacuneaNPV，HycuNPV)感染的Ld652Y細(xì)胞［11］，但這些研究中細(xì)胞凋亡都進(jìn)行至凋亡晚期即形成凋亡小體。桿狀病毒誘導(dǎo)早期細(xì)胞凋亡是否影響病毒復(fù)制周期的完成至今還少有報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)正是由于Se301發(fā)生了早期細(xì)胞凋亡從而阻止SpltMNPV產(chǎn)生BV和ODV子代病毒，可稱(chēng)Se301細(xì)胞為SpltMNPV的非受納細(xì)胞。

對(duì)于任何一種病毒來(lái)說(shuō)它進(jìn)入宿主細(xì)胞和組織的能力和它在里面復(fù)制并釋放有感染活性病毒的能力決定著這種病毒的宿主范圍。SpltMNPV感染Se301細(xì)胞后在早期24 h時(shí)有極少數(shù)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡小體，推測(cè)可能是病毒BV在病毒表面的糖蛋白GP64或其同源蛋白LD130參與下通過(guò)包內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后［12］，其早期事件如早期基因的表達(dá)誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡。有研究已證實(shí)桿狀病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可由感染早期事件所引起［13］。ie1是病毒感染的極早期基因，先前研究表明它能引起由AcMNPV誘導(dǎo)的Sf21細(xì)胞凋亡［14］。

被SpltMNPV感染的Se301細(xì)胞絕大部分只出現(xiàn)了早期凋亡并停滯在這個(gè)階段，沒(méi)有進(jìn)行至晚期出現(xiàn)凋亡小體。推測(cè)病毒進(jìn)入細(xì)胞后雖然病毒的早期事件引起了細(xì)胞凋亡的開(kāi)啟，可能病毒的抗凋亡基因Splt-iap4或Splt-p49得到了表達(dá)且具有抗凋亡功能，從而阻止了細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。早期基因表達(dá)后病毒借此機(jī)會(huì)進(jìn)行了自身的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，DNA復(fù)制后病毒隨即進(jìn)行晚期或極晚期基因表達(dá)［15］，由于某種未知原因，病毒晚期基因的表達(dá)可能受到抑制以至病毒不能完成BV的裝配和產(chǎn)生子代病毒，所以在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到了以上的現(xiàn)象。

根據(jù)凋亡形態(tài)學(xué)的特征，本研究中的現(xiàn)象除一些與早期凋亡一致外，還有一些與凋亡特征不符，如細(xì)胞聚集融合在一起。由于受死亡信號(hào)刺激，典型的凋亡早期細(xì)胞應(yīng)出現(xiàn)細(xì)胞膜卷曲皺縮，表面微絨毛消失，連接消失，與周?chē)募?xì)胞脫離等癥狀，而所觀察到的現(xiàn)象卻是幾個(gè)細(xì)胞簇集在一起分不清細(xì)胞邊界。實(shí)驗(yàn)中我們注意到，Se301細(xì)胞被SeMNPV感染后早期會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞聚集現(xiàn)象，病毒產(chǎn)生子代病毒后又慢慢自行分開(kāi)，所以推測(cè)以上現(xiàn)象為早期凋亡和病毒感染細(xì)胞雙重影響的結(jié)果。

致謝本研究在中山大學(xué)龐義教授和楊凱教授的指導(dǎo)和幫助下完成，謹(jǐn)以感謝。

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