皂苷Rb1活性代謝產(chǎn)物NG701聚合物載藥膠束的制備及其體外細(xì)胞毒性評價(jià)Δ

朱宇軒，賈乙，張建祥，李曉輝

（第三軍醫(yī)大學(xué)藥劑學(xué)教研室，重慶市 400038）

皂苷Rb1活性代謝產(chǎn)物NG701聚合物載藥膠束的制備及其體外細(xì)胞毒性評價(jià)Δ

朱宇軒＊，賈乙，張建祥，李曉輝#

（第三軍醫(yī)大學(xué)藥劑學(xué)教研室，重慶市 400038）

目的：制備二醇類皂苷Rb1活性代謝產(chǎn)物（NG701）的聚合物載藥膠束，并對其進(jìn)行體外細(xì)胞毒性評價(jià)。方法：合成兩親性嵌段共聚物即聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯（PEG-PBLA）并借助紅外光譜和核磁共振氫譜進(jìn)行表征；采用透析法制備NG701/PEG-PBLA聚合物載藥膠束，觀察其形態(tài)和粒徑分布，建立高效液相色譜法測定其含量并計(jì)算載藥量和包封率。以Hela細(xì)胞為模型，采用MTT法評價(jià)聚合物載藥膠束的細(xì)胞毒性作用，并與NG701原料藥比較。結(jié)果：紅外光譜和核磁共振氫譜證實(shí)形成了PEG-PBLA，所制備的聚合物載藥膠束呈球形，粒徑小于200nm，載藥量最高達(dá)32.7%，包封率最高為93.2%。與原料藥發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的有效濃度100μg·mL－1比較，聚合物載藥膠束為50μg·mL－1（P＜0.05）。結(jié)論：以PEG-PBLA為載體制備的載藥膠束聚合物，可有效提高NG701的細(xì)胞毒性作用。

皂苷Rb1活性代謝產(chǎn)物；NG701；聚合物載藥膠束；制備；體外細(xì)胞毒性

三七總皂苷（PNS）是從人參中所提取出的全部人參皂苷的總稱，按其皂苷元母核結(jié)構(gòu)可分為齊墩果酸類、原人參二醇類、原人參三醇類。NG701是二醇類皂苷Rb1在人腸道內(nèi)的代謝產(chǎn)物compound K，本室既往研究[1～4]表明，口服NG701可以有效防治動脈粥樣硬化的發(fā)生及具有抗腫瘤等多種生物活性，但其在水溶液中極低的溶解度（＜0.01g）不利于吸收。兩親性聚合物自組裝的聚合物膠束是近年來研究廣泛的、可作為藥物納米載體的新型給藥系統(tǒng)，其可以有效提高藥物的溶解度，并顯著改善其藥動學(xué)行為。目前為止，已有多種聚合物膠束作為抗癌藥物的納米給藥系統(tǒng)正在進(jìn)行臨床研究，如阿霉素、紫杉醇、喜樹堿等水溶性較差的藥物[5～8]?；诖?，筆者通過合成兩親性聚合物聚乙二醇-聚天冬氨酸芐酯（PEG-PBLA），將其制備成聚合物載藥膠束以解決NG701水溶性差問題，并對其載藥量和體外藥效等進(jìn)行初步探討。

1 儀器、材料與方法

1.1 儀器與材料

LC-20A高效液相色譜儀、SPD檢測器（日本島津公司）；AVANCE-500核磁共振氫譜儀（瑞士Bruker公司）；5DXC紅外光譜儀（美國Nicolet公司）；ZS90粒徑分析儀（英國馬爾文公司）；TECNAI-10透射電子顯微鏡（荷蘭飛利浦公司）。

NG701（云南某藥業(yè)公司提供，純度：＞98%）；L-天冬氨酸-β-芐酯（BLA，美國Sigma公司）；端氨基聚乙二醇（美國Laysan Bio 公司，MW＝5000）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國HyClone公司）；二甲基甲酰胺、二甲基亞砜（DMSO）均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純。

乳腺癌Hela細(xì)胞由本室留存。

透析袋（北京華美生科生物技術(shù)有限公司，截留分子量為3500）。

1.2 方法

先通過端氨基聚乙二醇（PEG-NH2）引發(fā)的氨基酸的N-羧基酸酐的開環(huán)聚合物合成兩親性嵌段共聚物PEG-PBLA，再借助紅外光譜和核磁共振光譜表征以確定聚合物合成成功。采用改良的透析法制備NG701/PEG-PBLA聚合物載藥膠束，測定其載藥量、粒徑等并進(jìn)行形態(tài)觀察，結(jié)合MTT法比較載藥膠束與NG701原料藥的細(xì)胞毒性作用。

1.2.1 PEG-PBLA的合成。先將BLA制備成相應(yīng)的N-羧基酸酐單體（BLA-NCA），然后以PEG-NH2為大分子引發(fā)劑引發(fā)BLA-NCA開環(huán)聚合物，以此得到兩親聚合物PEG-PBLA[9]。

1.2.2 PEG-PBLA的紅外光譜分析。稱取一定量的PEG-PBLA、PEG、PBLA，壓片后用紅外光譜儀測定，比較三者的紅外光譜。

1.2.3 PEG-PBLA的核磁共振氫譜分析。室溫下，分別在D2O和DMSO-d6中采集PEG-PBLA的氫譜，觀察質(zhì)子峰信號的改變。

1.2.4 聚合物載藥膠束的制備。分別精密稱取一定量的NG701（1、2、4、6mg）與10mg PEG-PBLA，溶于1mL DMSO中，轉(zhuǎn)移至透析袋中，置于去離子水環(huán)境中，每隔一定時(shí)間更換去離子水，攪拌24h后，冷凍干燥，即得。

1.2.5 透射電鏡觀察。取不同NG701含量的聚合物載藥膠束，將透析后的溶液稀釋后滴于銅網(wǎng)膜上，用濾紙將邊緣溶液吸干，自然條件下干燥后通過透射電鏡觀察所制膠束形態(tài)。

1.2.6 聚合物載藥膠束的粒徑分析。取不同NG701含量的聚合物載藥膠束，通過粒徑分析儀測定其粒徑分布。

1.2.7 高效液相色譜法測定NG701的含量。色譜條件：色譜柱：kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（90∶10）；檢測波長：203nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；流速：1mL·min－1。精密制備不同濃度（5、10、25、50、75、100μg·mL－1）的NG701乙腈溶液，直接進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)（A），濃度為橫坐標(biāo)（c）作圖，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程。按規(guī)定方法進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，并取聚合物載藥膠束制備成相應(yīng)溶液進(jìn)樣分析。

1.2.8 聚合物載藥膠束載藥量及包封率的測定。稱取5mg聚合物載藥膠束，溶于10mL乙腈中，進(jìn)樣，測定其含量，計(jì)算載藥量和包封率。載藥量（%）＝（膠束中所含藥物重量/膠束總重量）×100%；包封率（%）＝（實(shí)際載藥量/理論載藥量）×100%。

1.2.9 MTT法測定細(xì)胞毒性。將Hela細(xì)胞按每孔104個(gè)的細(xì)胞密度接種到96孔板，加入200μL培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。待細(xì)胞密度達(dá)到孔體積的80%左右，吸去培養(yǎng)液，加入200μL一系列不同濃度（以NG701計(jì)，0、25、50、100μg·mL－1）的聚合物載藥膠束和NG701原料藥的無血清培養(yǎng)液（分別為聚合物載藥膠束組和NG701原料藥組，均為試驗(yàn)組），正常組不加藥。孵育，分別在1、2、4、6h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入90μL無血清培養(yǎng)液和10μL的5mg·mL－1的MTT溶液，繼續(xù)孵育3h。翻板棄去液體，每孔加入100mL DMSO，振蕩10min。酶標(biāo)儀上570nm波長測光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞的存活率＝試驗(yàn)組OD570/正常組OD570×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 紅外光譜處理

PEG-PBLA、PEG、PBLA的紅外光譜見圖1。

圖1 PEG-PBLA、PEG、PBLA紅外光譜圖Fig1 IR spectrum of PEG-PBLA，PEG，PBLA

由圖1可見，PEG-PBLA（圖1A）中同時(shí)出現(xiàn)PBLA和PEG（圖1B）的紅外光譜吸收峰，表明成功合成了預(yù)期結(jié)構(gòu)的聚合物，即PEG-PBLA。

2.2 核磁共振氫譜分析

PEG-PBLA在DMSO-d6和D2O中的氫譜圖詳見圖2。

由圖2A可見，7.3ppm附近出現(xiàn)的是PBLA段中苯環(huán)質(zhì)子峰，而3.5ppm附近出現(xiàn)的是PEG中氧乙烯單元質(zhì)子峰。因此，該結(jié)果再結(jié)合紅外光譜圖，表明通過聚合反應(yīng)得到了聚合物PEG-PBLA。同時(shí)，根據(jù)氫譜計(jì)算得到聚合物中PEG和PBLA段中結(jié)構(gòu)單元的摩爾比為112∶12。圖2B所示為PEG-PBLA在D2O中的氫譜，結(jié)果表明PBLA段的質(zhì)子峰信號顯著減弱，提示PBLA段可能通過疏水作用自發(fā)組裝形成了聚合物膠束。

圖2 PEG-PBLA的核磁共振氫譜圖Fig2 1H-NMR spectra of PEG-PBLA

2.3 聚合物載藥膠束的透射電鏡觀察

通過透析法制備的不同NG701含量的聚合物載藥膠束形態(tài)見圖3。

圖3 不同NG701含量的聚合物載藥膠束透射電鏡圖Fig3 TEM of polymer drug-loading micelles with different content of NG701

由圖3可見，所制得的聚合物載藥膠束呈球形，粒徑較小且大小較為均一。當(dāng)NG701/PEG-PBLA投藥量為6∶10時(shí)，可以看出有少數(shù)較大的顆粒，并有部分發(fā)生團(tuán)聚。

2.4 聚合物載藥膠束粒徑測定

不同NG701含量的聚合物載藥膠束的粒徑分布見圖4。

圖4 不同NG701含量的聚合物載藥膠束的粒徑分布圖Fig4 Distribution of particle size of polymer drug-loading micelles with different content of NG701

由圖4可見，膠束的粒徑較小且分布均勻，且隨著NG701投藥量的增加而略微變大。NG701與PEG-PBLA投藥量為1∶10、2∶10和4∶10時(shí)，對應(yīng)的膠束的平均大小分別為34.2、46.3、47.2nm；而當(dāng)投藥量達(dá)到6∶10時(shí)，有少量較大顆粒出現(xiàn)，平均粒徑在150.1～783.1nm，與電鏡觀察結(jié)果相同。

2.5 NG701含量測定

建立的回歸方程為A＝6747.49268+5212.41035c（r＝0.9992），NG701檢測濃度線性范圍為5～100μg·mL－1。日內(nèi)RSD＝0.76%（n＝5），日間RSD＝2.3%（n＝5）。平均回收率為97.65%（RSD＝1.8%，n＝5）。聚合物載藥膠束溶液和NG701溶液的色譜見圖5，表明藥物和聚合物分離良好。

圖5 高效液相色譜圖A.NG701；B.聚合物載藥膠束；1.NG701Fig5 HPLC chromatogramA.NG701；B.polymer drug-loading micelles；1.NG701

2.6 載藥量及包封率

聚合物載藥膠束的載藥量及包封率結(jié)果見圖6。

圖6 NG701/PEG-PBLA載藥量及包封率Fig6 Drug-loading rate and encapsulation coefficency of NG701/PEG-PBLA

由圖6可知，NG701與PEG-PBLA投藥量為1∶10、2∶10、4∶10、6∶10時(shí)，對應(yīng)的聚合物載藥膠束的載藥量分別為6.5%、12.1%、22.7%、32.7%，包封率分別為63.7%、69.3%、82.4%、93.2%。

2.7 體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)

聚合物載藥膠束組和NG701原料藥組在不同濃度、不同作用時(shí)間下的細(xì)胞存活率結(jié)果見圖7。

由圖7可見，當(dāng)NG701濃度為50μg·mL－1時(shí)，聚合物載藥膠束組在1h后即表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性，而原料藥組在100μg·mL－1時(shí)才能有效殺死細(xì)胞（P＜0.05）。

3 討論

腫瘤是影響人類生命健康最嚴(yán)重的疾病之一，對腫瘤發(fā)病機(jī)制、診斷、治療與預(yù)防的研究不僅是醫(yī)藥學(xué)研究的前沿科學(xué)問題，更是人類健康的迫切需求。NG701是二醇類人參皂苷在人體腸道內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物和最終吸收形式，近年來，由于其獨(dú)特的藥理活性作用，對該化合物的研究越來越受到重視。

近年來關(guān)于聚合物微球、脂質(zhì)體、聚合物膠束作為藥用載體的報(bào)道很多。但是，每種載體都分別有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。微球由于其粒徑比較大，適合局部給藥（如做成栓塞、透皮制劑等），不適合注射用藥；脂質(zhì)體可用于多種給藥途徑和制劑，且作為抗腫瘤藥物載體時(shí)可使藥物選擇性地殺傷癌細(xì)胞，提高療效，但其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所清除，且載藥量低。與之相比，聚合物膠束載藥范圍廣、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、粒徑小，具有良好的組織滲透性，可以在體內(nèi)長循環(huán)，從而使藥物有效地到達(dá)靶點(diǎn)，是一種很有前途的納米載藥體系[9～13]。

圖7 聚合物載藥膠束組和NG701原料藥組在給藥1、2、4、6h后的細(xì)胞存活情況Fig7 Cell survival of polymer drug-loading micelles group and NG701group 1，2，4，6h after medication

由于NG701在水中的溶解性極差，極大地限制了其給藥途徑甚至療效的發(fā)揮。在本文中，以PEG為親水段、PBLA為疏水段的PEG-PBLA兩親性高分子聚合物為載體材料，通過透析法制備了粒徑在200nm以下的載藥膠束且具有較高的載藥量和包封率[14～16]，解決了NG701自身溶解度小的問題。通過前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞對NG701敏感度不高，因此在本試驗(yàn)中選用不敏感的Hela細(xì)胞作為模型細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)的初步探討，從結(jié)果來看，聚合物載藥膠束能夠明顯提高藥效且降低給藥劑量，可以有效地降低藥物的毒副作用。

綜上所述，筆者認(rèn)為采用兩親性高分子聚合物制備載藥膠束的方法可以解決NG701溶解度差的問題，同時(shí)對其他疏水性藥物也提供了一種可行性方法，本文為進(jìn)一步探討提高疏水性藥物的生物利用度奠定了理論基礎(chǔ)。

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Preparation of Polymer Drug-loading Micelles of Saponin Rb1Active Metabolite NG701and in Vitro Cytotoxicity Evaluation

ZHU Yu-xuan，JIA Yi，ZHANG Jian-xiang，LI Xiao-hui
（Dept.of Pharmaceutics，The Third Military Medical University，Chongqing 400038，China）

OBJECTIVE：To prepare polymer drug-loading micelles of Rb1active metabolite（NG701），and to evaluate cytotoxicity of it in vitro.METHODS：Amphiphilic copolymer PEG-PBLA was synthesized and then characterized by IR spectrum and HNMR.Dialysis process was used to prepare NG701/PEG-PBLA polymer drug-loading micelles.The morphology and particle size of micelles were observed.The content of NG701was determined by HPLC，and the drug-loading rate and encapsulation coefficency were calculated.Hela cells were employed as the model to evaluate the cytotoxicity of NG701-loading PEG-PBLA micelles by MTT assay.It was compared with that of NG701raw material.RESULTS：IR spectrum and HNMR confirmed the synthesis of PEG-PBLA.Prepared micelles were in round shape with size smaller than 200nm.The drug-loading rate reached 32.7%at the most and encapsulation coefficency was 93.2%at the most.Compared with active concentration of NG701raw material 100μ g·mL－1，the active concentration of polymer was 50μg·mL－1（P＜0.05）.CONCLUSION：Polymer drug-loading micelles with PEG-PBLA as carrier can improve cytotoxicity of NG 701effectively.

Saponin Rb1active metabolite；NG701；Polymer drug loading micelles；Preparation；In vitro cytotoxicity

#通訊作者：教授，博士研究生導(dǎo)師。研究方向：心血管藥理學(xué)及抗炎免疫藥理學(xué)。電話：023-68752318。E-mail：lpsh008@yahoo.com.cn

R943；R965

A

1001-0408（2011）17-1576-04

Δ國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21004077）

＊碩士研究生。研究方向：藥劑學(xué)。E-mail：zhuyuxuan6688@163.com

2011-03-09

2011-03-19）