覃 健 何 敏 張志勇 黎湘娟 張 楠 于 佳 容敏華

(廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣西 南寧 530021)

廣西巴馬長壽人群ACE基因多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用

覃 健 何 敏1張志勇 黎湘娟 張 楠 于 佳 容敏華

(廣西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院職業(yè)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生教研室，廣西 南寧 530021)

目的 探討血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因I/D多態(tài)性與環(huán)境因素在巴馬地區(qū)長壽現(xiàn)象發(fā)生中的交互作用。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性(PCR－RFLP)技術(shù)對廣西巴馬地區(qū)200例長壽老人(年齡90～110歲，長壽組)以及288例健康成年人(年齡48～89歲，對照組)的ACE基因進(jìn)行基因分型。應(yīng)用條件Logistic回歸模型分析巴馬長壽發(fā)生的環(huán)境及遺傳因素，根據(jù)交互作用指標(biāo)判斷基因與環(huán)境的交互作用。結(jié)果 長壽區(qū)的環(huán)境因素及ACE基因的ID+DD基因型是巴馬人長壽的促進(jìn)因素，兩者存在交互作用(OR=11.063，r=1.378)。結(jié)論 ACE基因I/D多態(tài)性與環(huán)境因素在巴馬地區(qū)長壽現(xiàn)象發(fā)生中存在一定的交互作用，其長壽現(xiàn)象的發(fā)生是遺傳及環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶;巴馬地區(qū);長壽;交互作用

人類血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因位于17號染色體長臂2區(qū)3帶(17q23)，由26個外顯子和25個內(nèi)含子組成，屬于單拷貝基因。在第16個內(nèi)含子存在287 bp的Alu插入/缺失序列，形成 ACE I/D多態(tài)性。含有 Alu片段，PCR產(chǎn)物長度490 bp，為插入型(I型);沒有此序列，產(chǎn)物長度190 bp，為缺失型(D型)。人類只有I、D兩種等位基因，不同個體可構(gòu)成3種基因型，即插入純合型(II)、缺失純合型(DD)及插入/缺失雜合型(ID)，且多態(tài)性等位基因的傳遞方式符合孟德爾遺傳規(guī)律〔1，2〕。ACE 基因 I/D 多態(tài)性與人類壽命有關(guān)〔3～5〕。廣西巴馬縣是世界著名的第五長壽之鄉(xiāng)，為了探索巴馬地區(qū)長壽現(xiàn)象，本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)－限制性片段長度多態(tài)性(PCRRFLP)技術(shù)分析ACE基因該位點的多態(tài)性，探討其基因多態(tài)性與環(huán)境有利因素的交互作用在巴馬長壽發(fā)生中的意義。

1 材料與方法

1.1 研究地點 廣西巴馬縣平洞、西山、甲篆三個相連的石山區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)為巴馬縣長壽區(qū)，其百歲老人比例在巴馬地區(qū)排名前三位(分別105/105、80/105、76/105)。與之一江之隔的那社、局桑兩個土山區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)為巴馬縣非長壽區(qū)，其百歲老人比例在巴馬地區(qū)排名最后兩位(分別21/105、15/105)。

1.2 研究對象 在巴馬地區(qū)選取長壽老人200例(90～110歲)為長壽組，其中177例來自長壽區(qū)，23例來自非長壽區(qū)。選取家族三代內(nèi)無年齡＞90歲老人的健康對照者288例(48～89歲)為對照組，其中140例來自長壽地區(qū)，148例來自非長壽地區(qū)。

1.3 基因組DNA提取 根據(jù)“知情同意”的原則采集研究對象靜脈血，EDTA 抗凝，采用 Chelex－100 法〔6〕制備血樣 DNA。

1.4 ACE基因型檢測

1.4.1 引物設(shè)計及合成 目前很多研究者采用Rigat法〔7〕，該方法由于PCR反應(yīng)中D等位基因優(yōu)先擴(kuò)增，而導(dǎo)致I等位基因擴(kuò)增無效，可能將ID基因型個體錯誤分類為DD型。已有研究〔8〕證實Rigat法的錯判率為8%左右，但其錯判的原因尚未明確。鑒于此原因，本研究參照周文華等〔9〕報道的基礎(chǔ)上設(shè)計兩對引物，采用PCR兩步法，對上述PCR反應(yīng)得到的DD型再用一對插入片段特異性引物進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，可降低DD基因型的錯判率。

采用Oligo 6.0引物設(shè)計軟件，第一條引物:上游引物為5′CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT －3′，下游引物為 5′－GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT－3′，產(chǎn)物為 490 bp、190 bp;第二條引物:上游引物為5′－TCG CCA GCC CTC CCA TGC CCA TAA－3′，下游引物為 5′－TGG GAC CAC AGC GCC CGC CAC TAC－3′，產(chǎn)物為337 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成提供。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 ①PCR反應(yīng)體系:25 μl體系包括PCR mix 12.5 μl，引物(10 μmol/L)各 0.4 μl，DNA 模板 0.5 μl，去離子水11.2 μl。②第一次PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5 min，94℃、64℃各1 min，72℃ 2 min，循環(huán)35 次，72℃延伸7 min。③第二次PCR反應(yīng)程序:94℃、64℃各1 min，72℃ 2 min，循環(huán)35次，72℃延伸7 min。④2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察PCR產(chǎn)物結(jié)果。

1.4.3 基因分型 采用兩對引物及兩次PCR的方法。DNA樣品經(jīng)第一次 PCR擴(kuò)增后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見490 bp和190 bp的DNA片段，構(gòu)成3種基因型:僅有490 bp條帶的為 II型純合子;僅有190 bp條帶的為 DD型純合子;同時有490 bp和190 bp兩個條帶的為ID型雜合子。對上述PCR反應(yīng)得到的DD型再用一對插入片段特異性引物進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，只有含I等位基因的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物才在337 bp處顯示清晰條帶。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用直接計數(shù)法計算基因型及等位基因頻率，等位基因頻率 =(2×純合子+雜合子)/(2×組別人數(shù))。采用HWE軟件分析研究對象的基因型頻率與Hardy－Weinberg平衡的符合程度，應(yīng)用SPSS13.0軟件包進(jìn)行資料分析，組間比較用χ2檢驗。應(yīng)用條件Logistic回歸模型對基因與環(huán)境的不同在巴馬長壽中的交互作用進(jìn)行分析，根據(jù) Khoury〔10〕和Ottman〔11〕提出的2型交互作用模型(GEI)的交互作用系數(shù)(γ，γ=βeg/βe)判斷交互作用存在與否以及基因－環(huán)境作用類型。①模型判定依據(jù):OReg=ORe×ORg為相乘模型;OReg＞ORe×ORg為超相乘模型;OReg＜ORe×ORg為次相乘模型;OReg=ORe×ORg－1為相加模型。②交互作用判定依據(jù):γ＞1，表示基因因素對環(huán)境暴露的效應(yīng)有放大作用，正向交互作用;γ＜1，表示基因因素對環(huán)境暴露的效應(yīng)有減弱作用，負(fù)向交互作用;γ=1，表示基因因素對環(huán)境暴露沒有交互作用〔10～14〕。

2 結(jié)果

2.1 研究群體的性別比較分析 長壽組200例，男57例，女143例;對照組288例，男106例，女182例，長壽組與對照組的性別沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。

2.2 研究群體的Hardy－Weinberg平衡檢驗 對長壽組、對照組及總體(長壽組+對照組)的ACE基因型進(jìn)行Hardy－Weinberg平衡檢驗，均符合 Hardy－Weinberg平衡規(guī)律(P＞0.05)。表明選擇的樣本具有群體代表性，基因頻率能代表群體的基因分布。見表1。

2.3 基因分型結(jié)果 在長壽組和對照組各發(fā)現(xiàn)了18、16例DD純合型，83、92例ID雜合型，其余的均為II純合型。見圖1、圖 2。

2.4 ACE基因多態(tài)性與巴馬長壽的關(guān)聯(lián)分析 與對照組比較，長壽組DD基因型和D型等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表1 研究群體ACE基因的基因型Hardy-Weinberg平衡檢驗

圖1ACE基因(I/D)多態(tài)性的PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 ACE基因(I/D)多態(tài)性第16內(nèi)含子插入特異性片段電泳圖

表2 長壽組與對照組ACE基因型和等位基因頻率比較

2.5 ACE基因各基因型、長壽區(qū)環(huán)境與巴馬長壽的單因素回歸分析 用單因素Logistic回歸分析，與II基因型相比，攜帶ID+DD基因型的個體可能會長壽的可能性高于對照人群，OR值為1.7，提示攜帶ID+DD基因型的個體可能會增加壽限。與非長壽區(qū)環(huán)境相比，在長壽區(qū)環(huán)境生活的巴馬人導(dǎo)致長壽的可能性高于對照人群，OR值為8.135，提示長壽區(qū)環(huán)境是巴馬長壽的促進(jìn)因素。見表3。

表3 ACE基因型因素、長壽區(qū)環(huán)境因素的單因素Logistic回歸分析

2.6 ACE基因I/D多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用 分析ACE基因(I/D)多態(tài)性與長壽區(qū)環(huán)境因素對巴馬人長壽的交互作用，單獨暴露在長壽區(qū)環(huán)境 ORe值為 5.726(OR，95%CI 3.073～10.668)，單獨攜帶非插入基因型ID+DD的ORg值為0.815(OR，95%CI 0.329～2.136)，說明長壽區(qū)環(huán)境和DD+ID基因型是促進(jìn)長壽的因子。兩者同時存在時，交互作用OReg值為11.063(OR，95%CI 5.809～21.068)，γ值為1.378＞1，表明長壽區(qū)環(huán)境和ID+DD基因型在巴馬長壽發(fā)生中起正向交互作用，兩者是協(xié)同作用，長壽區(qū)環(huán)境對ID+DD基因型在巴馬長壽中的作用具有放大效應(yīng)。OReg=11.063＞5.726×0.815，提示ACE非插入基因型與長壽環(huán)境交互作用機(jī)制在巴馬長壽中為超相乘模型，兩者共同存在時對巴馬長壽的促進(jìn)作用大于兩者單獨存在的作用的乘積。見表4。

表4 ACE基因I/D多態(tài)性、長壽區(qū)環(huán)境對巴馬長壽的聯(lián)合作用

3 討論

人類長壽的原因極為復(fù)雜，總的來說應(yīng)當(dāng)有遺傳因素、環(huán)境因素或二者的綜合作用〔15〕。近年來一些雙生子研究表明，大約25%的人類壽命的變異可以用遺傳因素來解釋〔16，17〕，也就是說大約75%的壽命變化是環(huán)境因素或者是遺傳與環(huán)境因素交互作用的結(jié)果。世界上的長壽區(qū)大體可分為兩種類型，一種是以經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展、環(huán)境相對開放為特點的經(jīng)濟(jì)型長壽區(qū)，例如日本，這與當(dāng)?shù)剌^為發(fā)達(dá)的經(jīng)濟(jì)、較好的社會福利有關(guān)〔18〕。另一種是以經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)、環(huán)境相對封閉為特點的自然型長壽區(qū)，如歐亞交界之處的高加索地區(qū)、中國新疆的和田、廣西的巴馬等。隨著社會的進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近年來一些經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)的百歲老人明顯增多。但迄今為止，世界上大多數(shù)長壽區(qū)仍以自然長壽區(qū)為主，說明自然環(huán)境對人類長壽的影響很大。同時也被認(rèn)為是一些非特異性的因素，因為各個長壽地區(qū)往往還有其獨特的環(huán)境特點，其中對土壤、飲水、作物及人體中微量元素與長壽關(guān)系的研究較多，人體中一些微量元素的含量和比值可能是長壽的特異性因素。上述研究表明，環(huán)境因素(包括膳食、社會和心理因素)可能是巴馬人長壽的重要原因。

本課題組之前研究表明巴馬縣長壽老人存在明顯的地區(qū)分布不均衡性，甲篆、平洞、西山三個鄉(xiāng)長壽人口比例明顯高于那社、局桑等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，由此形成了甲篆、平洞、西山三個鄉(xiāng)組成的“長壽集落區(qū)”，同時存在“非長壽集落區(qū)”，即那社、局桑等地。本研究即探討巴馬縣內(nèi)長壽集落區(qū)與非長壽集落區(qū)對巴馬人長壽的影響及其與遺傳因素對巴馬人長壽的交互作用。

研究基因之間、基因與環(huán)境因子之間的交互作用的方法很多，其分析交互作用時各有優(yōu)缺點，又相互優(yōu)勢互補(bǔ)。從分析方法上看，有叉生分析(crossover analysis)、多因素Logistic回歸模型、多因子降維法(multifactor dimensionality reduction)和基于復(fù)合LD(composite linkage disequilibrium)交互作用分析方法。本研究采用Logistic回歸模型。

用單因素Logistic回歸分析ACE基因型及長壽區(qū)環(huán)境對巴馬長壽的影響，與非長壽區(qū)環(huán)境相比，在長壽區(qū)環(huán)境生活的巴馬人長壽的可能性高于對照人群，OR值為8.135，提示長壽區(qū)環(huán)境生活的巴馬人可能會促進(jìn)長壽。與II基因型相比，攜帶ID+DD基因型的個體長壽的可能性高于對照人群，OR值為1.7，提示攜帶ID、DD基因型的個體可能是長壽的有利因素。

應(yīng)用交互作用模型理論，探討ACE基因多態(tài)性與長壽環(huán)境的交互作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACE基因型ID+DD與長壽區(qū)環(huán)境有一定的正向交互作用，兩者可能是長壽的促進(jìn)因素。兩者是協(xié)同作用，兩者共同存在時，對巴馬長壽的促進(jìn)作用大于兩者單獨存在的作用的乘積。

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Interaction of ACE gene polymorphisms and environmental factors in longevity elderly in Bama of Guangxi

QIN Jian，HE Min，ZHANG Zhi-Yong，et al.
Department of Occupational and Environmental Health，School of Public Health，Guangxi Medical University，Nanning 530021，Guangxi，China

ObjectiveTo investigate the interaction of the environmental factors of the longevity district and ACE gene polymorphisms in Bama longevity.Methods Genotyping of ACE gene was performed by PCR－RFLP for 200 longevous people(aged 90 ～110)and 288 healthy controls(aged 48 ～89).All data were performed with statistics and logistic regression analysis by SPSS.Results The interaction and confounding among the factors were estimated，and there was a positive interaction between the ID+DD genotypes in ACE and the environment of the longevity district.Conclusions The environment of the longevity district would be closely correlated with human longevity in Bama county.The polymorphisms of ACE gene with the environment factor have a synergistic effect on longevity.The longevity of Bama may be the interaction of heredity and environment.

ACE;Bama county;Longevity;Interaction

R994.6

A

1005-9202(2011)12-2163-04

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30560166，No.81060246);廣西科學(xué)基金資助項目(桂科基0639045，桂科自0991115桂科青0832032);廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)項目(桂科能0815011－6－5)

1 廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)科學(xué)實驗中心

張志勇(1963－)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境流行病學(xué)研究。

覃 健(1978－)，男，博士，主要從事環(huán)境流行病學(xué)研究。

〔2010－08－05 收稿 2010－10－28 修回〕

(編輯 張永貴/徐 杰)