王洪允,江 驥,胡 蓓

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心,北京 100730)

串聯(lián)質(zhì)譜在新生兒遺傳代謝性疾病篩查中的應(yīng)用

王洪允,江 驥,胡 蓓

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院,北京協(xié)和醫(yī)院臨床藥理中心,北京 100730)

遺傳代謝性疾病是一類(lèi)由于單基因缺陷而引起代謝途徑阻斷的疾病。許多遺傳代謝性疾病對(duì)新生兒危害極大,因此是新生兒篩查的主要內(nèi)容。串聯(lián)質(zhì)譜用于新生兒篩查是自 Guthrie將細(xì)菌抑制法用于苯丙酮尿癥篩查以來(lái),新生兒篩查史上最重要的技術(shù)革新。近年來(lái),串聯(lián)質(zhì)譜已成為新生兒遺傳代謝性疾病篩查中最具發(fā)展?jié)摿Φ摹俺?yáng)”技術(shù)。本文介紹串聯(lián)質(zhì)譜在新生兒遺傳代謝性疾病篩查中的技術(shù)優(yōu)勢(shì)、應(yīng)用原理和篩查疾病種類(lèi),并分析該技術(shù)在此領(lǐng)域中的發(fā)展趨勢(shì)。

串聯(lián)質(zhì)譜;遺傳代謝性疾病;新生兒篩查

遺傳代謝性疾病(inherited metabolic diseases,IMD)是指由于基因突變引起酶缺陷、細(xì)胞膜功能異常或受體缺陷,從而導(dǎo)致機(jī)體生化代謝紊亂,造成中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺乏而引起一系列臨床癥狀的一組疾病[1],迄今發(fā)現(xiàn)的疾病已經(jīng)超過(guò)1 000種[2]。雖然IMD單一病種發(fā)病率較低,每種疾病均屬少見(jiàn)病或罕見(jiàn)病,但因病種繁多,綜合患病率并不低。IMD的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,隨年齡、性別不同而有差異,危害極大。有些疾病在新生兒早期,例如出生后數(shù)小時(shí)或幾天內(nèi)即會(huì)發(fā)病,部分疾病卻可能在幼兒期、兒童期、青少年期甚至成年期發(fā)病。由此造成的后果是:一方面,臨床診斷十分困難;另一方面,如果不及早發(fā)現(xiàn)并治療,疾病可對(duì)新生兒造成不可逆轉(zhuǎn)的嚴(yán)重?fù)p害,如智力低下、終身殘疾,甚至死亡。因此,對(duì) IMD應(yīng)致力于早期診斷和及時(shí)治療,從而避免或減輕疾病的危害。自20世紀(jì)60年代 Guthrie等[3]首先采用細(xì)菌抑制法篩查苯丙酮尿癥(PKU)以來(lái),世界各主要國(guó)家均已在不同程度上開(kāi)展了新生兒遺傳代謝性疾病的篩查工作。目前,我國(guó)主要篩查的項(xiàng)目是先天性甲狀腺功能低下和苯丙酮尿癥[4]。然而,在很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi),傳統(tǒng)的IMD篩查方法(如 Guthrie細(xì)菌抑制法、放射免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等)都屬于“一種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)一種疾病”,費(fèi)用高、周期長(zhǎng),不適用于多種疾病的群體篩查。期間,雖然 GC/MS、HPLC等方法的應(yīng)用在一定程度上解決了這一技術(shù)難題,但仍無(wú)法滿(mǎn)足大規(guī)模IMD疾病篩查的要求。

自1990年Millington等[5]首次將串聯(lián)質(zhì)譜用于新生兒篩查以來(lái),在20年的時(shí)間里,串聯(lián)質(zhì)譜已經(jīng)發(fā)展成為IMD篩查中最理想的分析技術(shù)。串聯(lián)質(zhì)譜是一種高靈敏度、高特異性的快速分析技術(shù),可以同時(shí)測(cè)定生物樣品中多種目標(biāo)代謝物,通過(guò)一次實(shí)驗(yàn)即可篩查出包括氨基酸、有機(jī)酸代謝紊亂、脂肪酸氧化缺陷在內(nèi)的多種遺傳代謝性疾病,真正實(shí)現(xiàn)了從“一種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)一種疾病”到“一種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種疾病”的轉(zhuǎn)變,并且能夠使假陽(yáng)性和假陰性的發(fā)生率大大降低。目前,歐、美、澳洲、新加坡及中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)都已經(jīng)普及串聯(lián)質(zhì)譜新生兒疾病篩查方案。本文將回顧近年來(lái)串聯(lián)質(zhì)譜在IMD篩查中的研究結(jié)果,綜述串聯(lián)質(zhì)譜在氨基酸、有機(jī)酸和脂肪酸氧化缺陷等疾病篩查中的應(yīng)用原理和技術(shù)路線(xiàn),并分析該技術(shù)在IMD篩查中的發(fā)展趨勢(shì)。

1 串聯(lián)質(zhì)譜在新生兒 IMD篩查中的技術(shù)路線(xiàn)

1.1 樣品準(zhǔn)備

新生兒IMD篩查中最常用的樣品是血液。血樣采集是新生兒疾病篩查流程中最重要的技術(shù)環(huán)節(jié)之一,采血質(zhì)量直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。干血滴濾紙片法(dry blood spot,DBS)是目前最成熟的血樣采集方法,即由經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的醫(yī)護(hù)人員用采血針刺新生兒足跟后,以濾紙片收集血滴并進(jìn)行干燥處理。在此過(guò)程中,首先需要考慮的問(wèn)題是采樣時(shí)間。目前,普遍認(rèn)為新生兒血樣采集的最佳時(shí)間應(yīng)為出生后48～72 h。如果使用48 h以前的血樣,由于許多代謝標(biāo)志物在體內(nèi)的含量還沒(méi)有達(dá)到一定水平,由此會(huì)增加假陰性率的發(fā)生[6]。血樣采集后,應(yīng)該立即置于合適的儲(chǔ)存或運(yùn)輸環(huán)境中。例如,血中蛋氨酸在室溫條件保存一周后幾乎完全從樣品中消失;乙酰肉毒堿也存在一定程度的降解情況[7]。此外,在應(yīng)用DBS采集血樣時(shí),濾紙的類(lèi)型、如何用濾紙收集血滴以及血片是否干燥也會(huì)影響血樣采集的質(zhì)量。

經(jīng)典的干血片樣品處理方法是Millngton等[5]提出的,即將濾紙片打孔后取出,加入甲醇溶解的內(nèi)標(biāo),用甲醇提取,提取液以氮?dú)馔耆珦]干后加入鹽酸-正丁醇試劑,在加熱條件下密閉反應(yīng)以生成丁酯衍生物,再以氮?dú)獯抵镣耆珦]干,最后用V(乙腈)∶V(水)=1∶1復(fù)溶。需要指出的是,衍生化過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致某些代謝物或內(nèi)標(biāo)的降解,如谷氨酰胺脫氨基轉(zhuǎn)化為谷氨酸[7]。因此,在研究中應(yīng)該根據(jù)實(shí)際情況對(duì)反應(yīng)溫度、時(shí)間和試劑種類(lèi)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2 內(nèi)標(biāo)的選擇

穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)是進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析時(shí)最理想的內(nèi)標(biāo),如2H、13C或15N標(biāo)記-目標(biāo)代謝物。標(biāo)記位置應(yīng)定在目標(biāo)分子較穩(wěn)定的區(qū)域,同時(shí)也應(yīng)避免同位素內(nèi)標(biāo)之間的相互干擾。例如,在酪氨酸分析中,使用13C6-酪氨酸為內(nèi)標(biāo)比以2H4-酪氨酸更為穩(wěn)定,因?yàn)楹笳哂捎陔闹脫Q作用會(huì)導(dǎo)致樣品中酪氨酸含量被高估;又例如,由于乙酰肉毒堿在溶液或樣品制備過(guò)程中會(huì)發(fā)生水解,因此標(biāo)記位置不應(yīng)是N-甲基,而應(yīng)在碳鏈骨架上[8]。

1.3 串聯(lián)質(zhì)譜分析

質(zhì)譜是根據(jù)樣品離子的質(zhì)量電荷比來(lái)進(jìn)行定性和定量研究的一種分析技術(shù)。串聯(lián)質(zhì)譜是將2個(gè)以上的質(zhì)譜串聯(lián)在一起形成的多級(jí)質(zhì)譜,如四極桿-四極桿質(zhì)譜、磁質(zhì)譜-四極桿質(zhì)譜、四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜等。這些質(zhì)譜是由2個(gè)以上的質(zhì)譜在空間上實(shí)現(xiàn)串聯(lián),故又可稱(chēng)為空間串聯(lián)質(zhì)譜。而離子阱、傅里葉回旋共振等質(zhì)譜由于工作原理的特殊性,不需要與其他質(zhì)量分析器串聯(lián),自身即可進(jìn)行質(zhì)譜-質(zhì)譜操作,因此對(duì)應(yīng)的被稱(chēng)為時(shí)間序列串聯(lián)質(zhì)譜。其中,由2個(gè)四極桿質(zhì)量分析器經(jīng)1個(gè)碰撞室串聯(lián)而成的串聯(lián)四極桿質(zhì)譜是在IMD篩查中最常用的質(zhì)譜儀。串聯(lián)四極桿質(zhì)譜在測(cè)定樣品時(shí),樣品首先在離子源中被離子化,隨即通過(guò)第一級(jí)質(zhì)譜(MS1)選擇一定質(zhì)荷比的離子使其進(jìn)入碰撞室,與室內(nèi)的碰撞氣(常用的氣體為 He、Ar、N2、CH4等)進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)裂解產(chǎn)生碎片離子,再由第二級(jí)質(zhì)譜(MS2)根據(jù)質(zhì)荷比對(duì)碎片離子進(jìn)行選擇分析。

串聯(lián)質(zhì)譜有4種主要的掃描方式:子離子掃描、母離子掃描、中性丟失掃描和多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè),IMD篩查常采用后3種掃描方式。在進(jìn)行母離子掃描時(shí),MS2選擇特征碎片離子,MS1線(xiàn)性?huà)呙璨@得所有能夠產(chǎn)生這一碎片離子的母離子;在進(jìn)行中性丟失掃描時(shí),MS1和MS2同時(shí)進(jìn)行線(xiàn)性?huà)呙?但始終保持恒定的質(zhì)量差(Δm),最終獲得可以產(chǎn)生該中性碎片(Δm)的所有離子;在進(jìn)行多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)時(shí),MS1和MS2選擇性檢測(cè)特定母-子離子對(duì)。以串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行IMD篩查時(shí),可以采用單一功能掃描,也可以將幾種掃描方式結(jié)合使用。例如,中性丟失掃描(Δm=102 u)可用于篩查部分酸性和中性氨基酸;母離子掃描(碎片離子m/z85)用于篩查酰基肉毒堿。但如果需要同時(shí)對(duì)氨基酸代謝紊亂和脂肪酸氧化缺陷進(jìn)行篩查時(shí),較理想的分析方式是將中性丟失掃描、母離子掃描與多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)整合使用,即從多渠道獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)以保證篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1.4 方法考核

串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的特點(diǎn)是大大降低了篩查診斷的假陰性和假陽(yáng)性,這得益于串聯(lián)質(zhì)譜在特異性和靈敏度等方面的技術(shù)優(yōu)勢(shì),而方法學(xué)考核是確保這些技術(shù)優(yōu)勢(shì)能夠應(yīng)用于實(shí)際工作的有效途徑?；诩膊『Y查的特殊性進(jìn)行方法建立和考核時(shí),不妨從以下兩方面加以考慮:1)分析方法考核。重點(diǎn)考察方法的特異性、重復(fù)性、精密度和準(zhǔn)確度。2)方法驗(yàn)證。方法建立并通過(guò)考核后,可取一定數(shù)量已知結(jié)果的陽(yáng)性和陰性樣本,編盲后以串聯(lián)質(zhì)譜方法進(jìn)行分析,然后開(kāi)盲驗(yàn)證串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果。此外,還可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)室之間的比對(duì)考核以驗(yàn)證篩查的準(zhǔn)確性。

1.5 串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果處理

借助于質(zhì)譜儀的數(shù)據(jù)處理軟件,獲得的串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以是目標(biāo)代謝物的絕對(duì)濃度,也可以是代謝物與內(nèi)標(biāo)或幾種關(guān)聯(lián)代謝物之間的離子峰豐度比。問(wèn)題的關(guān)鍵是如何將代謝物的測(cè)定數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成有意義的臨床結(jié)果,因?yàn)閿?shù)據(jù)處理方法對(duì)結(jié)果分析有很大影響。例如,在中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏癥(MCAD)中,由于代謝酶的缺乏,患者血中 C8-?；舛緣A異常升高,然而若僅依據(jù)C8-?；舛緣A濃度進(jìn)行篩查,結(jié)果的準(zhǔn)確性明顯劣于C8-酰基肉毒堿/C0-游離肉毒堿或C8-/C2-?；舛緣A的比值[9-10];又例如,在苯丙酮尿癥(phenylketonuria,PKU)中,由于患者體內(nèi)苯丙酸羥化酶的缺乏,苯丙氨酸(Phe)不能正常代謝為酪氨酸(Tyr),隨著時(shí)間的推移,苯丙氨酸不斷蓄積,而酪氨酸持續(xù)減少(飲食中的攝入不足以維持其水平),因此,與 Phe濃度相比,采用 Phe/Tyr比值作為篩查指標(biāo)會(huì)更加靈敏,減少假陰性率[11]。此外,在分析串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)時(shí),還應(yīng)該考慮到體內(nèi)某些代謝物的異常變化可能源于不同疾病,例如,血中 Phe和 C8-?；舛緣A的異常升高除了PKU和MCAD所致外,還可見(jiàn)于丙酸血癥和甲基丙二酸尿癥中。因此,在分析串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)時(shí),必須結(jié)合臨床癥狀以及其他檢驗(yàn)結(jié)果,并注意排除其他疾病的干擾,以保證篩查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 串聯(lián)質(zhì)譜在IMD篩查中的應(yīng)用

IMD是一類(lèi)以功能障礙為主要表現(xiàn)的遺傳性缺陷疾病,它涉及氨基酸、有機(jī)酸、脂肪酸、尿素循環(huán)、碳水化合物、類(lèi)固醇、維生素等多種物質(zhì)的代謝異常,可導(dǎo)致多個(gè)系統(tǒng)受損。根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳科學(xué)院(The American College of Medical Genetics,ACMG)頒布的新生兒篩查指南[12],在54種需要篩查的 IMD疾病中,有38種可以采用串聯(lián)質(zhì)譜方法分析,其中18種屬于首要篩查項(xiàng)目,20種屬于次級(jí)篩查項(xiàng)目,分別列于表1和表2[13]。所涉及的IMD疾病種類(lèi)包括氨基酸代謝紊亂,有機(jī)酸癥,脂肪酸氧化缺陷(?；舛緣A缺乏)和尿素循環(huán)缺陷等。

表1 在A(yíng)CMG新生兒篩查指南中,能夠應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析的首要篩查項(xiàng)目Table 1 Core disorders in ACMGguideline which could be screened via tandem mass spectrometry

表2 在A(yíng)CMG新生兒篩查指南中,能夠應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜分析的次級(jí)篩查項(xiàng)目Table 2 Secondary disorders in ACMGguideline which could be screened via tandem mass spectrometry

2.1 氨基酸代謝紊亂

新生兒的氨基酸代謝異常多數(shù)是由于氨基酸代謝途徑中某些關(guān)鍵酶的缺乏導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸不能進(jìn)行代謝,體內(nèi)濃度出現(xiàn)異常。例如,PKU是比較常見(jiàn)的氨基酸代謝異常疾病,病因在于患者肝內(nèi)缺乏苯丙氨酸羥化酶,使苯丙氨酸不能正常代謝為酪氨酸,因此,大量的苯丙氨酸及苯丙酮酸蓄積于體內(nèi),對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致新生兒智力發(fā)育遲滯。PKU是我國(guó)新生兒篩查中的必檢項(xiàng)目。

目前,根據(jù)ACMG的新生兒篩查指導(dǎo)原則,串聯(lián)質(zhì)譜可以篩查的氨基酸類(lèi)代謝疾病有苯丙酮尿癥、楓糖尿癥、酪氨酸血癥I型和II型、同型半胱氨酸尿癥等10種[12-13]。經(jīng)典的篩查方法需要對(duì)樣品進(jìn)行衍生化,目的在于提高離子化效率和產(chǎn)生特定碎片離子。最常用的衍生化方法是以正丁醇在酸性條件下與氨基酸的羧基發(fā)生反應(yīng),形成丁基酯衍生物。在串聯(lián)質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)解離作用下,多數(shù)α-酸性、中性氨基酸產(chǎn)生102 u(丁基甲酯)的中性碎片丟失,少數(shù)氨基酸產(chǎn)生56 u(甘氨酸)和161 u(精氨酸)中性碎片丟失。此外,部分側(cè)鏈含有堿性基團(tuán)的氨基酸(如賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和天門(mén)冬酰胺等)能夠產(chǎn)生119 u中性丟失[14]。根據(jù)這些質(zhì)譜信息,可以采用中性丟失掃描或/和多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè),建立半定量或絕對(duì)定量的串聯(lián)質(zhì)譜分析方法進(jìn)行氨基酸類(lèi)代謝疾病的篩查。

2.2 脂肪酸氧化缺陷

脂肪酸在線(xiàn)粒體內(nèi)的β氧化是人體能量的主要來(lái)源。長(zhǎng)鏈脂肪酸首先在細(xì)胞質(zhì)中活化成長(zhǎng)鏈脂酰CoA,然后以肉毒堿作為載體(形成?；舛緣A)進(jìn)入線(xiàn)粒體;進(jìn)入線(xiàn)粒體后,隨即釋放出游離肉毒堿和長(zhǎng)鏈脂酰CoA;后者在線(xiàn)粒體的各種酶作用下,經(jīng)脫氫、加水、再脫氫和硫解4個(gè)步驟逐步分解為中鏈和短鏈脂酰CoA,依次進(jìn)入β氧化的下一個(gè)循環(huán)。因此,以上各步驟中任何一種酶的缺乏都會(huì)導(dǎo)致脂肪酸氧化缺陷,而體內(nèi)游離肉毒堿和各對(duì)應(yīng)?；舛緣A的濃度變化可以反應(yīng)脂肪酸代謝的狀況。串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)此類(lèi)疾病的篩查是通過(guò)測(cè)定體內(nèi)游離肉毒堿和各酰基肉毒堿的濃度來(lái)判定是否存在代謝異常。

串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定肉毒堿時(shí)可采用與分析氨基酸一樣的衍生化方法,但因其結(jié)構(gòu)與氨基酸不同,各種肉毒堿經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后產(chǎn)生的是85 u特征碎片離子。因此,可以采用母離子掃描或/和多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè),建立半定量或絕對(duì)定量的串聯(lián)質(zhì)譜分析方法進(jìn)行篩查。目前,串聯(lián)質(zhì)譜方法已經(jīng)成為脂肪酸氧化缺陷篩查中最可靠的分析方法,應(yīng)用于長(zhǎng)鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏、中鏈酰基輔酶A脫氫酶缺乏、短鏈?；o酶A脫氫酶缺乏、極長(zhǎng)鏈?；o酶A脫氫酶缺乏、肉堿棕櫚油酰合成酶缺乏等多種疾病的篩查。本實(shí)驗(yàn)室采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了微量血標(biāo)本中游離肉毒堿及多種?；舛緣A半定量及定量分析方法,該方法以C7-和C11-?；舛緣A為內(nèi)標(biāo),母離子掃描(碎片離子85 u)和選擇離子監(jiān)測(cè)分別對(duì)游離肉毒堿、C2-、C4-、C5-、C10-和C12-?；舛緣A進(jìn)行半定量和絕對(duì)定量,可以用于新生兒篩查[15]。在美國(guó),法定進(jìn)行新生兒氨基酸、游離肉毒堿和?；舛緣A代謝缺陷的篩查,為此,美國(guó) FDA在2004年正式頒布了串聯(lián)質(zhì)譜法在新生兒篩查中應(yīng)用的專(zhuān)門(mén)指導(dǎo)原則[16]。

2.3 有機(jī)酸代謝性疾病

有機(jī)酸是氨基酸、脂肪、糖中間代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的羧酸,有機(jī)酸血(尿)癥是由于某種酶的缺陷導(dǎo)致相關(guān)羧酸及其代謝產(chǎn)物的蓄積而引發(fā)的遺傳代謝性疾病。由于部分有機(jī)酸代謝途徑比較類(lèi)似,具有相同的代謝標(biāo)志物,因此給篩查診斷帶來(lái)了挑戰(zhàn)。例如,丙酸尿癥(propionic academia,PA)表現(xiàn)在新生兒體內(nèi)C3-?；舛緣A濃度異常高,即游離肉毒堿濃度在出生后幾天內(nèi)迅速降低。因此,串聯(lián)質(zhì)譜篩查PA的關(guān)鍵在于對(duì)C3-?；舛緣A和游離,C2-、C16-?；舛緣A快速而準(zhǔn)確的測(cè)定。甲基丙二酸尿癥(methylmalonicaciduria,NMA)是另一種比較常見(jiàn)的有機(jī)酸類(lèi)疾病,靶點(diǎn)同樣是C3-?；舛緣A以及游離,C2-、C16-?；舛緣A。因此,盡管 PA中C3-?；舛緣A濃度值要高于NMA,但由于個(gè)體間的高變異,僅依據(jù)C3-酰基肉毒堿濃度值很難區(qū)分這兩種疾病。Chase等[16]對(duì)所在實(shí)驗(yàn)室近10年的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,通過(guò)嘗試不同代謝物比值和C3-酰基肉毒堿的臨界值,認(rèn)為在C3-?；舛緣A濃度的基礎(chǔ)上,結(jié)合C3/C2比值可以更有效的進(jìn)行PA和NMA篩查[17]。

2.4 溶酶體貯積癥

溶酶體是一種細(xì)胞器,其內(nèi)部含有60多種酸性水解酶,可降解各種生物大分子,如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、粘多糖及糖原等。當(dāng)溶酶體酶出現(xiàn)缺陷時(shí),就會(huì)導(dǎo)致特定生物大分子不能正常降解而在溶酶體中貯積,從而使得溶酶體發(fā)生腫脹,細(xì)胞變得臃腫失常,細(xì)胞功能受到嚴(yán)重影響,最終導(dǎo)致一系列疾病,統(tǒng)稱(chēng)為溶酶體貯積癥(lysosomal storage disorders,LSDs)。溶酶體酶缺陷的直接原因是編碼酶的基因發(fā)生突變,故大多數(shù)LSDs為常染色體隱性遺傳。

雖然每一種LSDs均較少見(jiàn),但作為一組疾病而言,其患病率在活產(chǎn)嬰兒中達(dá)l/7 700,在美洲、歐洲及澳洲,LSDs發(fā)生率約為新生嬰兒的1/5 000～1/8 000,美國(guó)每年約有500～800名LSDs患兒出生,給社會(huì)造成極大負(fù)擔(dān)。迄今我國(guó)尚無(wú)LSDs確切患病率的統(tǒng)計(jì)學(xué)資料,但兒科診斷的LSDs日益增多?；谫A積物的復(fù)雜性及其組織分布與聚積速度的不同,LSDs既可導(dǎo)致多種器官系統(tǒng)的病變,也可僅局限于神經(jīng)系統(tǒng),并且自出生至成年期均可發(fā)病。目前,LSDs的診斷主要通過(guò)測(cè)定溶酶體酶活性及鑒定特殊貯積產(chǎn)物。國(guó)外已有將串聯(lián)質(zhì)譜應(yīng)用于溶酶體貯積癥的篩查,診斷以及治療監(jiān)測(cè)[18],在診斷速度、樣品用量、靈敏性和特異性上均比傳統(tǒng)的酶學(xué)測(cè)定有了很大的提高。

3 串聯(lián)質(zhì)譜在新生兒 IMD篩查中的發(fā)展趨勢(shì)

自Millington將串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)引入新生兒IMD篩查領(lǐng)域以來(lái),液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LCMS/MS)成為IMD篩查中最成熟的質(zhì)譜技術(shù)。LC-MS/MS以色譜實(shí)現(xiàn)分離,串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè),具有分離和結(jié)構(gòu)解析同步完成的特點(diǎn),能快速定量和定性分析復(fù)雜生物基質(zhì)中多種痕量組分。在IMD疾病篩查中,LC-MS/MS的“標(biāo)準(zhǔn)”設(shè)置是LC-ESI-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜。近年來(lái),隨著超高效液相色譜(UPLC)和大氣壓光離子電離(APPI)等多種新技術(shù)的不斷出現(xiàn),LC-MS/MS在分離能力、檢測(cè)靈敏度及適用范圍方面得以進(jìn)一步改善。可以預(yù)見(jiàn),在今后的研究中,基于串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的疾病篩查譜一定會(huì)得以擴(kuò)展。事實(shí)上,雖然ACMG僅列出38種可以采用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行篩查的代謝性疾病,但從分析的角度,目前至少有超過(guò)80種疾病可以歸入這種技術(shù)的篩查體系[13]。那么,采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行疾病篩查需要滿(mǎn)足哪些條件呢?我們認(rèn)為這首先取決于以下兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn):1)特異性。與常規(guī)的免疫等方法相比,對(duì)于目標(biāo)疾病,串聯(lián)質(zhì)譜是否能夠表現(xiàn)出更好的特異性。2)工作效率和檢測(cè)費(fèi)用。對(duì)于多種疾病的代謝標(biāo)志物,串聯(lián)質(zhì)譜方法是否能夠成功實(shí)現(xiàn)從“一種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)一種疾病”到“一種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多種疾病”的轉(zhuǎn)變,從而提高篩查效率、降低篩查費(fèi)用。根據(jù)這兩個(gè)基本原則,考慮到近年來(lái)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的迅速發(fā)展,對(duì)于那些與遺傳代謝性疾病有關(guān)的諸多小分子化合物,如維生素D和B12、類(lèi)固醇(17-OHP、雄甾烯二酮、皮質(zhì)醇)、激素等,以及部分多肽類(lèi)標(biāo)志物,LCMS/MS必將成為篩查的核心技術(shù)。

盡管串聯(lián)質(zhì)譜具有較多優(yōu)勢(shì),但并不能完全否定和取代傳統(tǒng)的篩查方法。此外,串聯(lián)質(zhì)譜在IMD中的應(yīng)用還有以下困擾:1)質(zhì)譜儀價(jià)格昂貴;2)醫(yī)療單位缺少熟練掌握串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的專(zhuān)業(yè)人員;3)醫(yī)生對(duì)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的懷疑和不支持;4)質(zhì)譜數(shù)據(jù)不能合理轉(zhuǎn)化為臨床診斷結(jié)果;5)不同國(guó)家和地區(qū),以及不同種族之間代謝標(biāo)志物參考值的標(biāo)準(zhǔn)化。

隨著人們對(duì)各種遺傳代謝性疾病機(jī)理認(rèn)識(shí)的加深,以及串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的日益成熟,將會(huì)有更多的疾病可以通過(guò)串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析篩查。

[1]羅小平,張李霞.遺傳代謝性疾病的臨床診治進(jìn)展[J].中國(guó)新生兒科雜志,2006,21(4):249-251.

[2]GUTHRIE R,SURI A.A simple phenylalanine method for detecting phenvlketonuria in large populations of newborn infants[J].Pediatrics,1963,32:338-343.

[3]GUTHRIE R,SURI A.A simple phenylalanine method for detecting phenvlketonuria in large populations of newborn infants[J].Pediatrics,1963,32:338-343.

[4]呂 軍,楊 青,張德英,等.我國(guó)新生兒疾病篩查開(kāi)展及管理現(xiàn)狀[J].中華醫(yī)院管理雜志,2004,10(2):720-722.

[5]MILLINGTON D S,KODO N,NORWOOD D L,et al.Tandem mass spectrometry:A new method for acylcarnitine profiling with potential for neonatal screening for inborn errors of metabolism[J].J Inherit Metab Dis,1990,13(3):321-324.

[6]EDELBROEK P M,HEIJDEN J,STOL KL.Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring:Methods,assays,and pitfalls[J]. Ther Drug Monit,2009,31(3):327-336.

[7]LI W,TSE F L S.Dried blood spot sampling in combination with LC-MS/MS for quantitative analysis of small molecules[J].Biomed Chromatogr,2010,24(1):49-65.

[8]RASH ED M S.Clinical applications of tandem mass spectrometry:Ten years of diagnosis and screening for inherited metabolic diseases[J].J Chromatogr B,2001,758(1):27-48.

[9]Van HOV E J L,ZHAN G W,KA HL ER S G,etal. Medium-chain acyl-CoA dehydrogenase(MCAD)deficiency:Diagnosis by acylcarnitine analysis in blood[J].Am J Hum Genet,1993,52(5):958-966.

[10]CHACE D H,HILLMAN S L,Van HOVEJ L,etal.Rapid diagnosis ofMCAD deficiency:Quantitatively analysis of octanoylcarnitine and other acylcarnitines in newborn blood spots by tandem mass spectrometry[J].Clin Chem,1997,43(11):2 106-2 113.

[11]CHACE D H,SHERWIN J E,HILLMAN S L,et al.Use of phenylalanine-to-tyrosine ratio determined by tandem mass spectrometry to improve newborn screening for phenylketonuria of early discharge specimens collected in the first 24 hours[J].Clin Chem,1998,44(12):2 405-2 409.

[12]WATSON M S,MANN M Y,LLOYD-PURYEAR M A,et al.Newborn screening:Toward a uniform screening paneland system-executive summary[J]. Pediatrics,2006,117(5):S296-S307.

[13]COPELAND S.A review of newborn screening in the era of tandem mass spectrometry:What’s new for the pediatric neurologist?[J].Semin Pediatr Neurol,2008,15(3):110-116.

[14]CARPENTER K H,WIELRY V.Application of tandem mass spectrometry to biochemical genetics and newborn screening[J].Clin Chim Acta,2002,322(1/2):1-10.

[15]毛 丹.微量血標(biāo)本中多種L-酯酰內(nèi)毒堿的半定量、定量分析及臨床應(yīng)用的初步探討[D].北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)北京協(xié)和醫(yī)院,2003.

[16]FDA.Class II special controls guidance document:Newborn screening test systems for amino acids,free carnitine,and acylcarnitines using tandem mass spectrometry[S].2004.

[17]CHACE D H,KALAS T A.A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing[J].Clin Biochem,2005,38(4):296-309.

[18]De J ESUS V R,ZHANG K,KEUTZER J,et al.Development and evaluation of quality control dried blood spot materials in newborn screening for lysosomal storage disorders[J].Clin Chem,2009,55:158-164.

Application of Tandem Mass Spectrometry to Newborn Screening for Inherited Metabolic Diseases

WAN G Hong-yun,J IANGJi,HU Pei
(Clinical Pharmacology Research Center,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing100730,China)

Inherited metabolic diseases are a group of metabolic disorders caused by singe gene defect.Many of these diseases carry serious clinical consequences to neonate or infant and therefore are a major part of newborn screening.The application of tandem mass spectrometry is the most important renovation in the field besides the application of bacterial inhibition assay to the screening of phenylketonuria by Guthrie.Recently,tandem mass spectrometry has revolutionized the field with rapid progress in technology.This paper reviews the advantages,fundamentals and screening diseases of tandem mass spectrometry.Future of this technology in newborn screening for inherited metabolic diseases is also predicted.

tandem mass spectrometry;inherited metabolic diseases;newborn screening

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0024-07

2010-11-19;

2011-01-15

王洪允(1975～),男(滿(mǎn)族),遼寧人,博士,助理研究員,臨床藥理學(xué)專(zhuān)業(yè)。E-mail:wanghongyunpharm@yahoo.com

胡 蓓(1956～),女(漢族),四川人,教授,博士生導(dǎo)師,臨床藥理學(xué)專(zhuān)業(yè)。E-mail:pei.hu.pumc@gmail.com