替莫普利對大鼠血管平滑肌細(xì)胞彈性蛋白酶的影響

孫娟，舒強(qiáng)，凌光烈

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院局解教研室，沈陽 110001）

替莫普利對大鼠血管平滑肌細(xì)胞彈性蛋白酶的影響

孫娟，舒強(qiáng)，凌光烈

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院局解教研室，沈陽 110001）

目的研究替莫普利對大鼠球囊損傷動脈血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）的彈性蛋白酶水平、表達(dá)和活性的影響。方法 建立大鼠損傷動脈再狹窄模型，實(shí)驗(yàn)組給予鹽酸替莫普利，對照組給予藥品溶劑。動脈損傷后第2、3、5天測定兩組VSMC的彈性蛋白酶ⅢB陽性細(xì)胞率；采用原位雜交的方法測定兩組彈性蛋白酶ⅡmRNA陽性細(xì)胞率；測定兩組彈性蛋白酶活性值。動脈損傷后第3天對兩組進(jìn)行原位明膠酶譜分析。動脈損傷后第10天測定兩組內(nèi)膜面積。結(jié)果 替莫普利組與對照組比較，大鼠損傷動脈VSMC的彈性蛋白酶ⅢB、彈性蛋白酶ⅡmRNA陽性細(xì)胞率顯著降低，彈性蛋白酶活性顯著降低；同時(shí)明膠酶水平顯著降低，內(nèi)膜面積顯著減小。結(jié)論替莫普利可能通過抑制大鼠損傷動脈VSMC的彈性蛋白酶水平、表達(dá)和活性及抑制明膠酶水平，抑制損傷動脈內(nèi)膜肥厚。

再狹窄；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑；血管平滑肌細(xì)胞；彈性蛋白酶

介入治療是臨床治療動脈硬化最為迅速而有效的方法，然而術(shù)后30%～50%的再狹窄發(fā)病率嚴(yán)重影響了手術(shù)的成功［1］，多種治療藥物正在研究當(dāng)中［2，3］。損傷動脈內(nèi)膜肥厚的本質(zhì)是血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖、遷移至內(nèi)膜并產(chǎn)生了細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）。增生的VSMC向內(nèi)膜的遷移更加活躍，遷移至內(nèi)膜的VSMC具有高增殖性。本研究旨在明確損傷動脈VSMC增殖、遷移過程中彈性蛋白酶的變化以及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）替莫普利對這一過程和對彈性蛋白酶、明膠酶的影響，從而明確ACEI抑制損傷動脈內(nèi)膜肥厚的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 大鼠損傷動脈再狹窄模型的建立和分組［4］

Wistar大鼠，雄性，12周齡，體質(zhì)量220～250g，苯巴比妥鈉（45mg/kg）腹腔注射麻醉。測定彈性蛋白酶活性時(shí)損傷主動脈，測定其他項(xiàng)目時(shí)損傷頸總動脈。將2Fr球囊導(dǎo)管（美國Baxter Healthcare公司）插入相應(yīng)動脈，使球囊膨脹至動脈外徑2倍，旋轉(zhuǎn)提拉3次，使內(nèi)皮剝離，中膜過度擴(kuò)張。從動脈損傷前2d開始每日早晚各1次灌胃給藥，實(shí)驗(yàn)組給予鹽酸替莫普利（山東宏富達(dá)公司，每200mg溶于1L含NaHCO3和 KHCO3各 1g的溶劑中）10mg·kg-1·d-1，對照組僅給予藥品溶劑。測定內(nèi)膜面積時(shí)于損傷后10d處死大鼠，測定其他項(xiàng)目時(shí)分別于損傷后2、3、5d處死大鼠，每時(shí)點(diǎn)均處死5只大鼠。

1.2 測定彈性蛋白酶ⅢB水平

用PBS經(jīng)心臟穿刺進(jìn)行壓力為110mmHg的血管灌注，然后用甲醇-Carnoy液灌流固定。取損傷動脈并切成長2mm的5段。將標(biāo)本制成石蠟切片［5］，進(jìn)行HE和Elastica-Masson三染色。再用多克隆抗大鼠胰腺彈性蛋白酶抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。采用抗鏈球菌卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合體法（ABC法），常規(guī)DAB發(fā)色，亮綠或蘇木精染核。

1.3 彈性蛋白酶ⅡmRNA原位雜交

用4%多聚甲醛PBS灌流固定，取損傷動脈并切成長2mm的5段。將標(biāo)本制成石蠟切片，以標(biāo)記地高辛的大鼠胰腺絲氨酸彈性蛋白酶ⅡcDNA為探針（Boehringer公司）［6］進(jìn)行雜交［7］，然后用羊抗地高辛-堿性磷酸酶復(fù)合物進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。NBT/BCIP顯色，亮綠染核。

1.4 測定彈性蛋白酶和明膠酶活性［8］

取損傷動脈，用冰冷肝素化PBS灌流沖凈，剝離外膜后切成1mm×1mm大小標(biāo)本并稱質(zhì)量。將標(biāo)本置于濃度為50mmol/L的胰腺彈性蛋白酶底物中，孵育、離心并取上清液。用分光光度計(jì)測量波長為405nm的對硝基苯胺（p-nitroaniline，p-NA）的吸光度。作出各p-NA濃度對應(yīng)的吸光度值的相對標(biāo)準(zhǔn)線，以 p-NA（μmol/L）/血管濕重（mg）表示彈性蛋白酶活性。

用4%多聚甲醛PBS灌流固定，取損傷動脈并切成長4mm的4段。標(biāo)本依次在5%、10%和15%的4℃蔗糖PBS中各浸泡15min后包埋，制成7～8μm厚冰凍切片。切片置于富含明膠的放射自顯影乳劑載玻片上。切片濕盒中37℃溫箱孵育后，再4℃孵育15h，常規(guī)顯影。

1.5 測定內(nèi)膜面積

取損傷動脈并切成長2mm的5段。用配備攝像機(jī)的顯微鏡（VM 30，Olympus）將血管橫斷面圖像輸入計(jì)算機(jī)并用軟件NIH Image 1.61求出內(nèi)膜面積。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 替莫普利對大鼠損傷動脈彈性蛋白酶ⅢB、彈性蛋白酶ⅡmRNA表達(dá)、彈性蛋白酶活性的影響

動脈損傷后2、3、5d實(shí)驗(yàn)組VSMC彈性蛋白酶ⅢB免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞率明顯小于對照組（P＜0.01﹚（表1），免疫組織化學(xué)染色明顯弱于對照組（圖1）。實(shí)驗(yàn)組VSMC彈性蛋白酶ⅡmRNA陽性細(xì)胞率明顯小于對照組（P＜0.01﹚（表1），免疫組織化學(xué)染色明顯弱于對照組（圖2）。實(shí)驗(yàn)組彈性蛋白酶活性明顯弱于對照組（P＜0.01﹚（表1）。動脈損傷后3d實(shí)驗(yàn)組明膠酶活性幾乎全部被抑制，對照組出現(xiàn)全層連續(xù)片狀透光區(qū)（圖3）。

表1大鼠損傷動脈V S MC的彈性蛋白酶ⅢB、彈性蛋白酶ⅡmR N A陽性細(xì)胞率和彈性蛋白酶活性T a b.1P e r c e n t a g e s o f V S MC s p o s i t i v e f o r e l a s t a s eⅢBa n d e l a s t a s eⅡmR N Aa n d e l a s t a s e a c t i v i t y a t d i f f e r e n t t i me p o i n t s a f t e r a r t e r y i n j u r y Group ElastaseⅢB ElastaseⅡmRNA Elastase activity Experimental Control Day 29.68±2.971)25.92±5.17Day 312.82±4.831)28.65±8.74Day 510.06±3.121)35.66±7.73Day 29.31±8.971)27.82±6.851)P<0.05vs control group.Day 330.46±7.881)45.84±8.74Day 530.21±8.741)54.45±10.24Day 20.46±0.081)0.77±0.21Day 30.51±0.101)0.61±0.09Day 50.42±0.111)0.79±0.31

2.2 替莫普利對內(nèi)膜面積的影響

實(shí)驗(yàn)組10d的內(nèi)膜面積為（8811.5±5918.7）μm2，明顯小于對照組（129382.7±50977.3）μm2（P＜0.01﹚。

3 討論

再狹窄是動脈對損傷的修復(fù)反應(yīng)，主要由早期的內(nèi)膜肥厚和后期的血管重構(gòu)形成。內(nèi)膜肥厚的本質(zhì)是中膜增殖的VSMC向內(nèi)膜的遷移，就增殖與遷移的關(guān)系而言，增殖是遷移的前提，只有增殖到一定的密度的VSMC才能遷移。彈性蛋白是大動脈中含量最豐富的蛋白質(zhì)，彈性蛋白酶在VSMC擺脫與ECM的緊密連接、溶解穿過內(nèi)彈力板而遷移和與ECM相關(guān)的血管重構(gòu)中均有重要的意義。

VSMC通過彈性結(jié)合蛋白與彈性纖維結(jié)合，通過整合素與ECM中的基膜、膠原、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白結(jié)合。彈性蛋白酶能夠降解彈性纖維、Ⅳ型膠原、纖維黏連蛋白、層黏連蛋白和蛋白聚糖，使間質(zhì)的彈性纖維及膠原纖維顯著減少［9］。損傷動脈的VSMC與其周圍彈性纖維的連接減少到1/10則無遷徙的VSMC。損傷通過細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)可引起許多原癌基因的表達(dá)和細(xì)胞因子的生成，從而使VSMC增殖和凋亡的平衡被打破。動脈損傷后彈性蛋白酶的出現(xiàn)有可能是內(nèi)皮剝脫后血清因素滲透至中膜直接刺激VSMC產(chǎn)生，但更有可能是損傷導(dǎo)致VSMC產(chǎn)生了促分裂活性更強(qiáng)的血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）而產(chǎn)生。纖維蛋白溶解酶釋放出與ECM結(jié)合的堿性成纖維細(xì)胞生長因子，刺激周圍的平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生PDGF。

PDGF主要與VSMC增殖有關(guān)，而彈性蛋白酶主要與遷移有關(guān)。遷移細(xì)胞見核分裂像，富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，表現(xiàn)為合成型細(xì)胞的特點(diǎn)。PDGF促進(jìn)VSMC轉(zhuǎn)化為合成型的增殖性細(xì)胞，合成與分泌彈性蛋白酶實(shí)現(xiàn)遷移。

ACEI類藥物替莫普利能夠?qū)⒀芫o張素（angiotensin，Ang）Ⅰ轉(zhuǎn)化為 AngⅡ［10，11］，AngⅡ可誘導(dǎo)VSMC產(chǎn)生PDGF、成纖維細(xì)胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子，從而導(dǎo)致VSMC增殖和遷移。另外激肽受體拮抗劑Hoe140可顯著降低ACEI對再狹窄的抑制提示ACE還是激肽和緩激肽的激肽降解酶。ACEI抑制血漿和血管壁內(nèi)的ACE、激肽和緩激肽降解酶使激肽和緩激肽水平升高，從而激活血管壁內(nèi)的一氧化氮合成酶使一氧化氮水平增高，一氧化氮再通過升高環(huán)鳥苷酸水平而抑制VSMC增生。以上說明ACEI的作用是通過降低AngⅡ的產(chǎn)生和提高激肽和緩激肽水平兩個(gè)途徑發(fā)揮的。

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（編輯陳 姜，英文編輯陳 姜）

Effect of Temocapril on the Elastase in Rat Vascular Smooth Muscle Cell

SUN Juan，SHU Qiang，LING Guang-lie
（Department of Regional Anatomy，The First Hospitial，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effect of temocapril on the level，expression，and activity of elastase in vascular smooth muscle cells（VSMC）in balloon-injured rat artery.MethodsThe rat model of arterial stenosis induced by artery injury was established.The Wistar rats were treated with temocapril hydrochloride （experimental group）and medicine solution （control group），respectively.On days 2，3，and 5after the artery injury，the percentages of cells positive for elastaseⅢB and elastaseⅡ mRNA and the activity of elastase were determined in both groups.Collagenase in situ zymography was performed on day 3after the artery injury.The intimal area was measured 10days after the artery injury.ResultsCompared with the control group，the percentages of cells positive for elastaseⅢB and elastaseⅡ mRNA，the activity of elastase，the level of typeⅣ collagenase，and the intimal area significantly decreased in the experimental group.ConclusionTemocapril may inhibit intimal hypertrophy by inhibiting the level，expression，and activity of elastase and the level of collagenase in VSMCs in the injured artery.

restenosis；angiotensin converting enzyme inhibitor；vascular smooth muscle cell；elastase

R453.9

A

0258-4646（2011）01-0042-03

孫娟（1976-），女，主治醫(yī)師，碩士.E-mail：sunjuan163163163@163.com

2010-04-14