真皮成纖維細胞多向分化潛能的研究進展

馬曉飛 朱 明 綜述 張 艷 柴 崗 審校

真皮成纖維細胞多向分化潛能的研究進展

馬曉飛 朱 明 綜述 張 艷 柴 崗 審校

真皮成纖維細胞起源于胚胎中胚層間質(zhì)細胞，是構(gòu)成體內(nèi)疏松結(jié)締組織的主要細胞成分。以往認為，真皮成纖維細胞在機體發(fā)育過程中是分化完全的終末細胞，不具備多向分化潛能，只能作為真皮組織的種子細胞。近年來研究發(fā)現(xiàn)，真皮成纖維細胞能夠表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)標志物，具有多向分化潛能，在特定條件下能夠向骨、脂肪、軟骨、肌腱、神經(jīng)以及胰島等多胚層組織器官分化，可能成為組織器官構(gòu)建的種子細胞來源?，F(xiàn)將真皮成纖維細胞的多向分化潛能研究現(xiàn)狀進行綜述。

真皮成纖維細胞 多向分化潛能 干細胞

真皮成纖維細胞（Dermal Fibroblasts，DFs）來源于胚胎中胚層間質(zhì)細胞，是人體內(nèi)分布范圍最廣，參與組織修復最重要的一類細胞[1]。與其他中胚層來源的細胞不同，真皮成纖維細胞保留了中胚層細胞增殖力強、體外培養(yǎng)不易老化、多次傳代仍能保持強大增殖力的特性，同時取材與培養(yǎng)十分簡單，被視為人體內(nèi)數(shù)量最大的“種子細胞庫”[2]。長期以來，DFs被認為是分化完全的終末細胞，不具備向其他細胞系分化的潛能。然而，近年的研究發(fā)現(xiàn)，DFs能夠表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)標志物CD71、CD73/SH3-SH4、CD90/Thy-1、CD105/SH2和CD16/ALCAM，在特定條件下能夠表達骨蛋白、軟骨基質(zhì)、胞內(nèi)脂滴以及神經(jīng)膠質(zhì)等相關(guān)特異性標志物，其細胞基質(zhì)能夠長時間維持誘導后的細胞表型，具備向三胚層組織細胞分化的潛能[3-5]，有望真正成為組織器官構(gòu)建的種子細胞來源。

1 DFs 成骨分化潛能評價

骨折愈合過程是多種細胞、生長因子和細胞外基質(zhì)之間相互作用的復雜動態(tài)過程，分為炎癥反應階段、纖維骨痂階段、原始骨痂階段和繼發(fā)性骨痂階段。成纖維細胞參與了骨折愈合的全部過程，并起著重要作用[6]。在炎癥反應階段，成纖維細胞隨新生血管長入骨折血腫中，并在血腫周圍大量聚集。隨后成纖維細胞進入活化階段，電鏡顯示細胞出現(xiàn)大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核酸以及粗大的高爾基體，證明此階段成纖維細胞具有蛋白合成和分泌能力，能夠分泌膠原及胞外基質(zhì)等多種修復成分，形成纖維性骨痂及骨外膜。在骨性骨痂階段，除成骨細胞之外，活化的成纖維細胞還參與細胞間質(zhì)成分的鈣化。成纖維細胞的線粒體內(nèi)存在大量鈣離子，能夠以基質(zhì)小泡的形式將鈣離子分泌至胞外，在膠原纖維之間形成鈣結(jié)節(jié)，最終融合成骨組織，證明了成纖維細胞在成骨過程中的重要作用[7]。Lin等[8]研究發(fā)現(xiàn)，骨折后局部肉芽組織及新生骨小梁中的成纖維細胞，與各種成骨相關(guān)細胞同樣地表達BMP，表明機體創(chuàng)傷后引發(fā)BMP內(nèi)源性調(diào)控，使得成纖維細胞和間充質(zhì)細胞向成骨細胞誘導分化，進而參與成骨修復過程。

同時，在體外環(huán)境下，真皮成纖維細胞同樣具有成骨潛能。在特定蛋白和誘導劑的影響下，真皮成纖維細胞形態(tài)雜亂，交織形成多層結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)線粒體鈣顆粒增多，能夠分泌ALP、骨鈣素及BMP等，且成骨過程中膠原基質(zhì)合成分泌和鈣鹽沉積與體內(nèi)基本一致，均能形成骨組織。Hee等[9]提取真皮成纖維細胞，加入特定的內(nèi)源性骨形態(tài)發(fā)生蛋白及維生素D等誘導劑，發(fā)現(xiàn)真皮成纖維細胞向成骨方向分化，細胞形態(tài)多變，基質(zhì)分泌能力增強，染色顯示鈣基質(zhì)沉積，并表達ALP和骨鈣素等成骨細胞特異性標志物，表明真皮成纖維細胞具有成骨潛能，在特定環(huán)境下能夠形成骨組織。Hee等[10]又根據(jù)表面抗原對新生兒真皮成纖維細胞進行篩選，同時分離骨髓間充質(zhì)細胞作為對照，結(jié)果顯示真皮成纖維細胞與骨髓間充質(zhì)細胞對誘導劑的反應不同，真皮成纖維細胞具有更大的成骨誘導潛能。

2 DFs成脂分化潛能評價

真皮成纖維細胞與脂肪干細胞同起源于中胚層間質(zhì)細胞。脂肪干細胞作為成體干細胞，已被證明具有成骨、成脂、成軟骨及神經(jīng)等多向分化潛能，成為多種組織器官構(gòu)建的種子細胞[11]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，真皮成纖維細胞具有多向分化潛能，能夠表達與脂肪干細胞相近的表面標志CD29、CD44、CD71、CD73/SH3-SH4、CD90/Thy-1、CD105/SH2、CD166/ALCAM，并在特定誘導條件下向脂肪干細胞分化，形成脂肪組織[12]。Crigler等[13]分離小鼠真皮成纖維細胞進行各系誘導分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)部分鼠成纖維細胞能夠在誘導條件下向脂肪組織分化，形成成熟的脂肪。改變誘導條件，鼠成纖維細胞也能向骨、軟骨等組織分化。Huang等[14]發(fā)現(xiàn)，人真皮組織內(nèi)存在一種類似于干細胞的真皮間充質(zhì)細胞，表達與成體干細胞類似的表面標志物CD90、CD105、CD166、CD73、SH3和SH4，在特定條件下能夠向脂肪細胞、骨細胞和神經(jīng)細胞等分化，形成各類組織，具有多向分化潛能。同時，成纖維細胞生長因子同樣能夠提高脂肪干細胞的多向分化潛能，促進其向軟骨、骨、神經(jīng)等組織的分化[15]。Junker等[16]分離DFs后進行成脂、成骨和成軟骨誘導，DFs顯示了向脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞分化的潛能；同時對DFs進行單細胞克隆培養(yǎng)，單克隆體系顯示出同克隆前類似的分化潛能，并表達干細胞相關(guān)標志物，進一步確定了DFs成為組織工程種子細胞的可能性。

3 DFs成軟骨潛能評價

軟骨組織構(gòu)建最重要的是獲得來源穩(wěn)定、數(shù)量可觀、增殖力強、不易老化的種子細胞。真皮成纖維細胞與軟骨細胞均起源于中胚層，與軟骨細胞不同的是，真皮成纖維細胞保持了高度的增殖力，多次傳代仍能維持表型穩(wěn)定。同時，一系列研究結(jié)果表明，真皮成纖維細胞具有干細胞特性，在特定誘導條件下能夠向包括軟骨在內(nèi)的多種組織細胞分化，是一類潛在的軟骨種子細胞。通過分析DFs的表型特征及分化潛能，并利用骨形態(tài)發(fā)生蛋白將DFs進行成軟骨表型誘導，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導后的DFs可向軟骨分化，Ⅱ型膠原及軟骨基質(zhì)檢測均呈陽性。Yin等[17]發(fā)現(xiàn)，DFs在CDMP1的誘導下能夠向軟骨細胞表型分化，表達Ⅱ型膠原及agggrecan等軟骨特異性標志物，細胞的誘導分化率達到70%以上。French等[18]首先利用IGF-I預處理DFs，然后利用蛋白聚糖誘導體系對DFs進行成軟骨定向誘導，誘導1周后對其進行檢測，發(fā)現(xiàn)DFs特殊染色顯示其分泌軟骨基質(zhì)；RT-PCR檢測出Ⅱ型膠原，表明DFs在特定條件下可向軟骨誘導分化。Zhao等[19]探討了真皮成纖維細胞的體內(nèi)構(gòu)建軟骨潛能，將犬真皮成纖維細胞誘導后植入關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)，結(jié)果顯示誘導后的犬真皮成纖維細胞具有軟骨分化潛能，能夠在體內(nèi)修復半月板缺損。Hiramatsu等[20]將c-Myc、Klf4和sox9基因轉(zhuǎn)入真皮成纖維細胞，同時在特定誘導環(huán)境下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)真皮成纖維細胞能夠向軟骨細胞表型分化，并維持表型穩(wěn)定。

4 DFs成肌腱分化潛能評價

與大多數(shù)肌腱缺損修復的臨床替代物相比，組織工程肌腱具有良好的生物活性和生物相容性。而真皮成纖維細胞與肌腱細胞的高度相似性和同源性也使得真皮成纖維細胞成為肌腱構(gòu)建的種子細胞之一。Dvoránková等[21]采用凝集素誘導體系定向誘導DFs，誘導后DFs向肌成纖維細胞分化，并分泌大量胞外基質(zhì)，實驗組創(chuàng)傷愈合優(yōu)于對照組，顯示了DFs的誘導分化潛能。Ieda等[22]利用iPS轉(zhuǎn)染體系將Gata4、Mef2c和Tbx5等3個基因片段轉(zhuǎn)入DFs誘導培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后的DFs迅速高效地向心肌成纖維細胞分化，檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的DFs具有類似心肌的基因譜，表達心肌表面標志物并能夠自發(fā)進行收縮，表明了體外環(huán)境下DFs的成肌潛能。在體內(nèi)環(huán)境下，Liu等[23]利用真皮成纖維細胞對豬的肌腱缺損進行修復，與單純支架組相比，真皮成纖維細胞6周后形成與正常肌腱相近的組織，而單純支架組材料降解萎縮，無法形成組織，證明了真皮成纖維細胞具有向肌腱細胞分化的潛能。Deng等[24]進一步在肌腱構(gòu)建中施加力學刺激，結(jié)果表明經(jīng)過力學刺激后的新生肌腱膠原更加成熟，排列更加整齊，機械抗拉力更強，使得真皮成纖維細胞構(gòu)建的肌腱在大體觀、組織學、生物力學等方面均類似于正常肌腱，表明真皮成纖維細胞能夠構(gòu)建較為成熟的肌腱組織。

5 DFs成神經(jīng)誘導分化潛能評價

神經(jīng)系統(tǒng)紊亂表現(xiàn)為神經(jīng)的脫髓鞘改變，治愈神經(jīng)脫髓鞘最有效的是切除病變神經(jīng)，進行少突膠質(zhì)細胞的移植。當前單純進行少突膠質(zhì)細胞的移植還存在一定難度。神經(jīng)組織的缺損主要依靠神經(jīng)干細胞的分化和修復來完成。文獻表明，胚胎干細胞及成體干細胞在特定條件下可向神經(jīng)細胞分化，并參與神經(jīng)組織的修復，同時近期研究出現(xiàn)的iPS細胞為神經(jīng)損傷的修復提供了一條新途徑。真皮成纖維細胞向神經(jīng)細胞誘導較為復雜，大量研究表明，iPS細胞具有多向分化潛能，能夠向神經(jīng)細胞誘導分化，但在誘導體系、表型維持及致瘤性等方面還存在一系列問題[22-24]。Ogawa等[25]采用干細胞誘導方案，優(yōu)化誘導條件，誘導iPS細胞向少突膠質(zhì)細胞分化，結(jié)果顯示盡管誘導效率較低，僅有部分iPS細胞向少突膠質(zhì)細胞分化，但明確了真皮成纖維細胞的神經(jīng)分化潛能。Lee等[26]借鑒iPS轉(zhuǎn)染途徑，將神經(jīng)相關(guān)因子轉(zhuǎn)入DFs，并采用神經(jīng)細胞培養(yǎng)體系進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細胞表達神經(jīng)相關(guān)蛋白及神經(jīng)膠質(zhì)細胞表面標志，并具備神經(jīng)鈉通道，表明轉(zhuǎn)染后的DFs向神經(jīng)樣細胞分化。

6 DFs成胰島分化潛能評價

近年來，iPS的研究表明，DFs可在轉(zhuǎn)染基因的條件下向包括胰腺在內(nèi)的多組織器官分化，但因其致瘤性限制了進一步發(fā)展。Guo等[27]發(fā)現(xiàn)，在特定誘導體系下，DFs能夠向胰島細胞分化，表達胰島細胞表面標志，并能夠分泌胰島素，表明DFs的胰島分化潛能。Tateishi等[28]將DFs分離進行單克隆培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)單克隆培養(yǎng)的 DFs仍具有胰島分化潛能，能夠形成分泌胰島素的細胞克隆體，具有相關(guān)胰島基因片段并表達胰島細胞標志物。Bi等[29]的研究結(jié)果證實了DFs單克隆體系下的成胰島潛能，并證明體內(nèi)環(huán)境下，誘導后的DFs能夠分泌胰島素改善高血糖動物模型的血糖情況，進一步證明了DFs的成胰島能力。

近年來，對真皮成纖維細胞，包括iPS細胞的深入研究，發(fā)現(xiàn)真皮成纖維細胞同樣具有干細胞的特性，能夠向骨、軟骨、脂肪、肌腱、神經(jīng)、胰島、心肌等多種組織誘導分化，具有多向分化潛能，是一類潛在的種子細胞。但是，真皮成纖維細胞作為組織工程種子細胞進行組織構(gòu)建還存在許多問題，例如iPS細胞的轉(zhuǎn)化效率低下、致瘤性、轉(zhuǎn)化機制復雜、信號傳導不明確，以及構(gòu)建的組織器官不成熟等[30]，這些都將制約真皮成纖維的應用，需要進行更為深入的研究探索。

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Research Progress on Multipotential of Dermal Fibroblast

MA Xiaofei,ZHU Ming,ZHANG Yan,CHAI Gang.

Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai JiaoTong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:ZHANG Yan(E-mail:zycg81@yahoo.com.cn).

【Summary】DFs derived from mesenchymal cells of mesodermal embryo are the main cells of loose connective tissue.DFs had been considered as full differentiated terminal cells without multipotential and had been used as seed cells just for skin tissue.Recently DFs have been proved to express the markers of mesenchymal stem cells and differentiate into osseous tissue,fat,cartilage,tendon,nerve,pancreatic islet and so on under certain condition.DFs could be used as seed cells for tissue engineering.Here,the multipotential of DFs was reviewed.

Dermal Fibroblast;Multipotential;Stem Cell

Q813.1+1

B

1673－0364（2011）06－0347－03

2011年8月21日；

2011年9月28日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.06.015

200011 上海市 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院整復外科。

張艷（E－mail：zycg81@yahoo.com.cn）。