王志遠，張 宏，張革化

白念珠菌對唑類藥物的耐藥與對策＊

王志遠1，張 宏2，張革化1

隨著廣譜抗生素、化療藥的廣泛使用，器官移植手術和患有基礎疾病的人群數量的激增，白念珠菌已成為人類真菌感染的最常見的病原菌。一線抗真菌藥氟康唑等唑類藥物的長期應用，白念珠菌的耐藥株已廣泛出現，引起臨床醫(yī)生的廣泛關注。本文主要介紹白念珠菌對唑類藥物的耐藥機制以及如何逆轉耐藥相關對策的研究工作的新進展。

1 白念珠菌感染現狀

白念珠菌（Candida albicans）為念珠菌屬中的主要致病菌，是一種常見的條件致病性的真菌，可寄居于正常人群中的胃腸道、陰道和口腔粘膜。當機體免疫功能低下時，可導致口腔念珠菌病、陰道炎、真菌性鼻竇炎、外耳道炎等，甚至可引發(fā)危及生命的系統(tǒng)性念珠菌感染。在美國，8%～10%的醫(yī)院血流感染（nosocomial bloodstream infection，BSI）的主要致病菌為念珠菌屬。國外多中心統(tǒng)計了1997－2007年的256 882例醫(yī)院真菌感染中，白念珠菌占65．3%［1］。土耳其某三級醫(yī)院回顧研究了1996－2007年12年間743例念珠菌菌血癥患者，發(fā)現白念珠菌感染者占45%［2］。最近2項流行病學調查顯示，白念珠菌血流感染患者病死率分別為44%和43．6%［3－4］。由此可見，白念珠菌感染率和病死率高，已成為人類的健康殺手。

2 白念珠菌對唑類藥物的耐藥現狀

氟康唑、伊曲康唑等三唑類藥物因其安全和有效性，成為臨床上治療念珠菌病最常用的一線抗真菌藥物。但是，此類藥物的長期使用導致耐藥株廣泛出現。41個國家多中心研究發(fā)現，白念珠菌對氟康唑的耐藥株已從2000年的0．9%上升到了2007年的1．4%［1］。Goldman等（2000）對免疫缺陷病人進行了一項前瞻性研究，發(fā)現伊曲康唑治療組與安慰劑組分離培養(yǎng)的白念珠菌對氟康唑的耐藥率分別為22%和4%。Wroblewska等［5］從臨床上分離了851株白念珠菌，其中37．2%對氟康唑耐藥、47．6%對伊曲康唑耐藥。Magaldi等（2001）從艾滋病患者身上分離培養(yǎng)出白念珠菌，發(fā)現其對氟康唑原發(fā)耐藥率為10%，而經抗真菌治療后耐藥率上升為45%。白念珠菌對唑類藥物的耐藥已經成為臨床棘手的問題。目前，有關白念珠菌的耐藥機制的研究主要包括藥物外排泵的改變、靶酶的變化、生物膜的形成、細胞壁成分的變化等方面。

2．1 藥物外排泵的改變

2．1．1 藥物外排泵 Sanglard（1995）和 Albertson（1996）的研究發(fā)現白念珠菌對氟康唑的耐藥性與能量依賴的外排泵相關。研究證實2個外排泵系統(tǒng)與白念珠菌氟康唑耐藥相關［6］：①ATP結合盒轉運子（ATP binding cassette transporters，ABC；CDR 編碼），依賴ATP主動運輸。研究推測ABC的數量為28個，主要包括CDR1p和CDR2p，其編碼基因分別為CDR1和CDR2。唑類耐藥白念珠菌中CDR1轉錄增加與CDR1 m RNA穩(wěn)定性增強，引起CDR1的過表達，而CDR1p通過介導脂質的移位、外排唑類藥物而發(fā)揮其耐藥作用［7］。目前已證實CDR1與或CDR2過表達與白念珠菌對唑類的耐藥相關［8］。White等（1997）研究同一親本的16株白念珠菌，發(fā)現耐藥白念珠菌的CDR mRNA水平明顯升高，認為白念珠菌的耐藥與CDR家族中成員有關。Sanglard等（1997）研究發(fā)現白念珠菌被敲除CDR1基因后，表現為對唑類藥物高度敏感，在前者菌株基礎上進一步敲除CDR2基因后，對唑類藥物的敏感度進一步提高。②主要易化子超家族（major facilitators superfamily，MFS；MDR 編碼），屬非能量依賴型載體，通過電化學勢能進行被動轉運。在白念珠菌中，它至少包括Ca MDR1p和FLU1p，編碼基因分別為Ca MDR1和FLU1。白念珠菌的MDR1的過量表達是白念珠菌對氟康唑耐藥的另一個主要機制［9］。白念珠菌和釀酒酵母菌中FLU1基因氨基酸序列與Ca MDR1類似，其基因缺失突變株對唑類藥物敏感性增強，但其在敏感株與耐藥株中表達無明顯差異［10］。White（2002）亦證實FLU1基因與白念珠菌對唑類藥物的耐藥性及ERG11高表達無關。說明了FLU1對菌株耐藥無明顯影響。

2．1．2 外排泵的調控 ①轉錄因子Ca Tac1（transcriptional activator of CDR genes）控制著外排泵CaCdr1p、CaCdr2p的表達。Ca Tac1獲得功能性突變可導致CDR1、CDR2的高表達，CDR1缺失突變株對氟康唑、伊曲康唑、酮康唑耐藥性分別降低6、4、8倍，而CDR2缺失突變株對氟康唑或酮康唑耐藥性降低1．5倍，對伊曲康唑沒有影響，因此認為CDR1在白念珠菌對唑類藥物的耐藥性上發(fā)揮主要作用，而CDR2作用輕微［11］；②白念珠菌鈣－鈣調蛋白（Ca2＋－Ca M）依賴性途徑參與耐藥的調節(jié)。Ca M抑制劑吩噻嗪類能抑制白念珠菌Ca M編碼基因Ca MDR1表達Ca MDR1p，使Ca MDR1p對靶蛋白鈣調神經磷酸酶作用減弱，鋅指轉錄蛋白CRZ1p的活化減弱，使白念珠菌對唑類藥物敏感性增加。實驗證明Ca M抑制劑能夠增強酮康唑抗白念珠菌活性［12］。③ 轉 錄 因 子 MRR1 （multidrug resistance regulator）能上調耐藥的白念珠菌的MDR1，MRR1是MDR1關鍵的轉錄因子，MRR1的失活將導致MDR1表達水平和耐藥性下降［13］；④外排泵調節(jié)因子1（regulator of efflux pump 1，REP1）的過表達使菌株對氟康唑敏感性增加，而REP1基因突變引起MDR1 mRNA過表達，導致白念珠菌對氟康唑的耐藥性增加。因此，Rep1p為白念珠菌MDR1的負性調控因子［9］。

2．2 靶酶的變化

2．2．1 靶酶及其編碼基因 麥角固醇是真菌細胞膜上最常見的固醇，唑類藥物與麥角固醇合成途徑中的關鍵酶細胞色素P450羊毛固醇脫甲基酶（ERG11編碼）結合，抑制麥角固醇的合成，從而抑制真菌的生長。當靶酶過度表達或突變時，真菌便表現出對唑類藥物的耐藥性。已經證實與耐藥相關的靶酶基因為ERG11（或稱為ERG16、CYP51A1）。Ribeiro等［14］通過比較氟康唑敏感株與耐藥株，發(fā)現ERG11的上調與氟康唑誘導耐藥有關。而Wang等［15］通過鎖式探針和滾環(huán)擴增（rolling cycle amplification，RCA）方法快速檢測白念珠菌ERG11基因的突變位點，篩選到G464 S、G448E、G307S、K143R、Y123H、S405F 、R467K 、G450V 氨基酸位點置換導致白念珠菌對氟康唑敏感度下降。Feng等［16］的研究認為F72S、F145I和G227D氨基酸位點置換與白念珠菌對唑類的耐藥高度相關。

2．2．2 靶酶編碼基因調控 在靶酶基因水平調控方面，鋅指轉錄因子Upc2p是固醇生物合成和唑類耐藥的重要調節(jié)因子。UPC2介導麥角固醇生物合成基因的上調，可導致白念珠菌對唑類藥物的耐藥性。白念珠菌UPC2基因缺失致其對唑類藥物酮康唑、氟康唑的敏感性增加［17］，而UPC 2基因的G648D或A643T功能獲得性突變則導致ERG11過度表達，使白念珠菌對唑類藥物的耐藥增加［18］。Upc2p直接結合ERG基因的啟動子從而調控ERG2、ERG11基因的表達［17］。

2．3 生物膜的形成

2．3．1 生物膜及其耐藥性 單個真菌粘附到底物表面，成為微菌落，依靠菌毛及富含多聚糖的細胞外基質（ECM）融合產生復雜的三維結構，形成生物膜。生物膜內包括酵母細胞、菌毛、假菌毛。白念珠菌生物膜早期為0～11 h，細胞開始粘附到底物上；中期為12～24 h，芽生孢子聚集增殖形成群落，產生富含碳水化合物的ECM；成熟期為31～72 h，細胞完全包被于ECM中，72 h后細胞開始死亡，生物膜結構開始分解。Uppuluri等［19］研究發(fā)現，白念珠菌生物膜相較懸浮相對氟康唑的耐藥性提高1 000多倍。

2．3．2 生物膜耐藥機制 生物膜的形成機制尚不清楚。Mukherjee等（2004）認為，在生物膜形成初期，白念珠菌外排泵的表達與其對唑類藥物的耐藥有關，外排泵基因的敲除不影響突變株生物膜的形成；在生物膜中后期，細胞膜固醇的改變與生物膜對唑類藥物耐藥有關。然而，LaFleur等［20］研究白念珠菌成熟期生物膜時，結果發(fā)現野生型與外排泵基因的缺失突變株對抗真菌藥的MIC值一致，因此否定了外排泵對耐藥性的影響，證實白念珠菌生物膜多藥耐藥性主要是由于新亞群的耐藥株的出現，并確定耐藥株為表型突變而不是基因突變。由此可見外排泵的改變不是生物膜形成的單一因素，其它的相關蛋白與信號通路亦參與了生物膜的形成。Seneviratne等［21］以蛋白質組學技術比較白念珠菌生物膜相與懸浮相全組蛋白，發(fā)現生物膜的形成與烷基過氧化氫還原酶、硫氧還蛋白及其過氧化物酶等氧化應激防御蛋白的上調有關。神經鈣蛋白抑制劑FK506聯合氟康唑可有效抑制生物膜形成，此結果間接說明了神經鈣蛋白信號通路與生物膜形成有關［19］。

2．4 ERG3基因的改變 ERG3基因的突變引起固醇△5，6去飽和酶（sterol delta 5，6 desaturation）缺失，導致14－甲基糞甾醇（14－methylfecosterol）積累，而其可以支持真菌細胞生長，因此，ERG3的突變可引起白念珠菌對唑類藥物的耐藥性。Yan等［22］研究發(fā)現ERG3基因D19E氨基酸位點變化，引起ERG3基因失活，導致白念珠菌對氟康唑產生耐藥性。Efg1負性調控ERG3基因的表達從而介導白念珠菌對唑類藥物的耐藥性［23］。Hsp90在一定程度上調節(jié)ERG3基因的變化。Hsp90是一種分子伴侶，在靶蛋白的折疊、轉運、成熟、降解的過程中起調節(jié)作用。Hsp90具有類似“電容器”的功能，能夠儲存和釋放基因的變異。Hsp90能夠儲存隱性的基因變化，當“電容器”的緩沖功能被抑制時，新的表型就會出現。Cowen和Lindquist［24］研究發(fā)現高水平的Hsp90通過快速選擇誘導和維持白念珠菌和釀酒酵母對氟康唑的耐藥性。Hsp90主要與底物鈣調磷酸酶（calcineurin）作用引起ERG3基因的突變，從而誘導真菌對氟康唑的耐藥性，并且證實Hsp90抑制劑格爾德霉素（geldanamycin）和鈣調磷酸酶的抑制劑環(huán)孢菌素（Cs A）能夠降低真菌對氟康唑的耐藥性。研究證實在依賴Hsp90的藥物抵抗機制中Hsp90和鈣調磷酸酶下游效應子Crz1、Hph1／Hph2參與了對唑類藥物的抵抗性［25］。

2．5 細胞膜成份的改變 細胞膜固醇、磷脂和脂肪酸等成份的改變影響其流動性和不對稱性，進而影響藥物進入細胞，導致白念珠菌對唑類藥物的產生耐藥性。Loffer等（2000）比較了氟康唑敏感菌與耐藥株的細胞膜成份，發(fā)現耐藥株的麥角固醇含量和磷酸卵磷酯：腦磷酯比率更低，這些變化影響了細胞膜對氟康唑的攝取，引起胞內氟康唑濃度降低，導致耐藥產生。同樣，Mishra等［26］認為氟康唑耐藥株麥角固醇低含量、而腦磷酯高含量與白念珠菌對氟康唑的耐藥相關。

2．6 白念珠菌細胞周期的改變 白念珠菌的細胞周期包括G1期、S期、G2期、M期和G0態(tài)。耐唑類藥物白念珠菌處于G0態(tài)時間較長，此時，SNZ1高表達靜止期同源蛋白（SNZlp）。白念珠菌細胞凋亡的比率不隨唑類藥物存在、培養(yǎng)時間或生長速率而變化，保持在一個相對穩(wěn)定的值，說明其凋亡受基因控制，外界因素的誘導對其影響甚微［27］。

2．7 白念珠菌染色體的改變 Selmecki等研究發(fā)現白念珠菌在氟康唑藥物的存在下迅速出現等臂染色體5L（isochromosome 5L），認為白念珠菌對氟康唑的耐藥性與染色體獲得性非整倍性有關。等臂染色體5L通過擴增ERG11和TAC1基因引起白念珠菌對唑類藥物的耐藥性［28］。

2．8 多重耐藥 白念珠菌對唑類藥物的耐藥可能涉及多重耐藥機制。約85%的氟康唑耐藥菌株出現CaCDR1、CaCDR2和Ca MDR1過表達的情況［29］。White（1997）等研究了一套具有同一親本的白念珠菌，發(fā)現CDR、MDR1、ERG16在每株菌中有不同程度的表達。Perea等（2001）發(fā)現55%的氟康唑耐藥白念珠菌株同時伴有ERG11點突變與外排泵（包括CDR／MDR1）上調，15%伴有ERG11與MDR1的上調，15%伴有ERG11與CDR的上調，10%伴有ERG11上調與ERG11點突變。因此，應從整體的水平理解白念珠菌對唑類抗真菌藥的耐藥。

3 耐藥對策

目前白念珠菌對唑類藥物的耐藥日趨嚴重。為了應對白念珠菌的耐藥現象，可行的策略有：①規(guī)范用藥：間歇性的、長期的、低劑量的用藥可導致耐藥的發(fā)生，為防止耐藥的產生，應杜絕抗真菌藥物的不合理應用。理論上持續(xù)性的、短期的、高劑量的用藥可降低耐藥的發(fā)生率，然而在高選擇壓力下可能會出現更高耐藥的菌株。②新藥的開發(fā)：新藥的開發(fā)是逆轉耐藥的重要的措施。新一代的三唑類抗真菌藥伏立康唑（voriconazole）抗菌譜較廣，已用于臨床?？ú捶覂簦╟aspofungin）和米卡芬凈（micafungin）分別是第一個和第二個棘球白素類抗真菌藥物，它們是1，3－b－葡聚糖合成酶的抑制劑，可作用于真菌細胞壁，致使細胞破裂而發(fā)揮作用，現已用于致命性的真菌感染［30］。③聯合用藥：聯合用藥包括兩種抗真菌藥或一種抗真菌藥與一種其它藥物制劑聯合使用。目前被證明可行的組合有兩性霉素B與5－氟胞嘧啶（5－FC）、兩性霉素B與唑類、唑類與5－FC、唑類與特比萘芬（terbinafine）、唑類與環(huán)孢菌素（Cs A）等。此外，近來有研究發(fā)現漢防己甲素可在轉錄水平抑制外排泵及靶酶基因的表達，漢防己甲素對唑類藥物抗白念珠菌有明顯的增效作用［6］。④免疫調節(jié)藥物的應用：治療的成敗不僅與藥物而且與宿主的免疫狀況有關。唑類藥物可聯合細胞因子治療伴有HIV等免疫缺陷的真菌感染患者。⑤清除病灶：通過外科手段去除真菌病灶以減輕真菌的負荷，從而使宿主和抗真菌藥能有效的控制真菌感染。

綜上所述，臨床上白念珠菌感染率較高，并且隨著唑類抗真菌藥的廣泛使用，白念珠菌對唑類藥物的耐藥性不斷提高，而新型的抗真菌藥的開發(fā)緩慢，這已經成為臨床上較為棘手的問題。如何逆轉白念珠菌對唑類抗真菌藥物的耐藥是擺在每一個醫(yī)務人員面前的迫切需要解決的問題。

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2011－06－19；

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