劉 敏 楊 俊 李 莉 李書國

(三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 宜昌市中心人民醫(yī)院心內(nèi)科,湖北 宜昌 443003)

RNA干擾(RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后、翻譯不同水平的基因沉默機(jī)制,其可能通過誘導(dǎo)靶基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變,使靶基因的轉(zhuǎn)錄受阻或者抑制靶 mRNA的翻譯,令靶蛋白表達(dá)受阻,從而達(dá)到高效特異地阻斷基因表達(dá)的目的。自從 1998年Fire〔1〕等發(fā)現(xiàn) RNAi現(xiàn)象以來,RNAi研究取得了突破性進(jìn)展,被《科學(xué)》雜志評為 2001年的十大科學(xué)進(jìn)展之一,并名列 2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首。目前 RNAi技術(shù)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,本文就該技術(shù)在缺血損傷中的運(yùn)用做簡要概述。

1 RNAi的發(fā)現(xiàn)

1990年美國和荷蘭的植物學(xué)家為了得到比紫色更深的矮牽?；?遂將產(chǎn)生紫色素的基因轉(zhuǎn)入其中,卻讓大多數(shù)花朵變成了雜色甚至白色,當(dāng)時(shí)認(rèn)為這是一種奇怪的“協(xié)同抑制”現(xiàn)象。 1995年,康奈爾大學(xué)的 Guo等〔2〕在研究線蟲 Par21基因時(shí)發(fā)現(xiàn)反義 RNA和正義 RNA都阻斷了基因的表達(dá)。1998年華盛頓卡耐基研究所的 Fire研究證明,雙鏈 RNA(double-stranded RNA,dsRNA)在線蟲體內(nèi)可以產(chǎn)生有效的基因沉默現(xiàn)象,并首次將這種現(xiàn)象稱為 RNAi。2001年,Elbashir等〔3〕第一次在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)證實(shí)了合成的小干擾 RNA(small interfering RNA,siRNA)可以產(chǎn)生 RNAi。 2002年 Brummelkamp等〔4〕發(fā)現(xiàn)了短發(fā)夾 RNA(small hairpin RNA,shRNAs),它可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)源性的 siRNA,從而提供穩(wěn)定的的基因沉默。

2 RNAi的機(jī)制

細(xì)胞內(nèi)較長的 dsRNA分子被 dsRNA特異性內(nèi)切酶 Dicer(RNaseⅢ)酶切為長度 19～24 nt大小不等的雙鏈 siRNA,在ATP協(xié)助下siRNA的一條鏈與沉默復(fù)合物(RNA-induced silencing complex,RISC)結(jié)合,通過完全配對的方式識(shí)別特異性的mRNA,并特異性切割與之互補(bǔ)的靶mRNA,從而阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)。同時(shí)靶基因的降解產(chǎn)物作為新生的 siRNA繼續(xù)結(jié)合RISC,由此沉默效應(yīng)被循環(huán)放大〔5〕。此外,siRNA還可以在RNA依賴RNA聚合酶的作用下大量擴(kuò)增,即以siRNA為引物、以靶mRNA為模板延伸生成 dsRNA,經(jīng) Dicer酶切割、降解生成大量的次級 siRNA,而次級siRNA又可進(jìn)入合成切割的循環(huán)過程,并進(jìn)一步放大 siRNA的作用,使RNAi擴(kuò)散到整個(gè)機(jī)體并可以傳代〔6〕。

3 RNAi與缺血損傷

3.1 RNAi在心臟缺血損傷中的應(yīng)用 在缺氧條件下,缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxiainducible factor-1alpha,HIF-1α)轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)可以激活幾種下游的血管生長因子。然而,HIF-1α能夠被脯氨酰羥化酶 2(prolyl hydroxylase enzyme-2,PHD-2)蛋白降解。 2008年 Huang等〔7〕通過 shRNA抑制PHD-2可以顯著提高抑制 HIF-1α水平,從而顯著提高心肌梗死后小鼠心功能,并改善心肌梗死區(qū)域毛細(xì)血管及小靜脈的生成率。宋慧文等人〔8〕建立了大鼠心肌缺血/再灌注的體外模型,并用蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(protein tyrosine phosphastase-1B,PTP-1B)-RNAi處理心肌細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可顯著減少與 FasR結(jié)合的PTP-1B的數(shù)量,增加了蛋白激酶 B(Akt)的磷酸化水平、并激活 Akt,同時(shí)減少了大鼠心肌細(xì)胞的凋亡,有效地抑制心肌細(xì)胞的損傷。近年來 Lisovyy等〔9〕在研究心肌缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,I/RI)機(jī)制時(shí),發(fā)現(xiàn)花生四烯酸5-脂氧合酶(arachidonate 5-lipoxygenase,ALOX 5)的增加在心肌梗死的病理生理過程中發(fā)揮了重要的致病作用,進(jìn)一步運(yùn)用 RNAi技術(shù)沉默ALOX5,發(fā)現(xiàn)可以減少大鼠心肌細(xì)胞凋亡、保護(hù)受損心肌。

3.2 RNAi在腎臟缺血損傷中的應(yīng)用 補(bǔ)體系統(tǒng)在調(diào)解人腎I/RI有著重要的作用。Zheng等〔10〕試驗(yàn)證明 siRNA沉默補(bǔ)體活化路徑的核心組成部分C3,可以減輕腎I/RI,從而降低補(bǔ)體介導(dǎo)的腎損傷和小鼠死亡率。Zheng等〔11〕通過夾緊腎靜脈和動(dòng)脈 25min誘導(dǎo)腎 I/RI損傷,觀察 I/RI損傷 2～48 h,發(fā)現(xiàn) C3和 caspase 3基因顯著上調(diào)。將 C3和 caspase 3 siRNA注入小鼠體內(nèi)可以有效抑制小鼠 C3和 caspase3基因的表達(dá),顯著降低小鼠死亡率及缺血損傷面積。血清糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶 1(serum and glucocorticoid-regulated kinase 1,SGK1)的下調(diào)可以促進(jìn)促紅細(xì)胞生成素(EPO)的抗凋亡作用。最近,Rusai等〔12〕在建立大鼠單側(cè)腎 I/RI體內(nèi)模型中,運(yùn)用 RNAi技術(shù)沉默SGK 1,發(fā)現(xiàn)可以對 I/RI的腎臟有保護(hù)作用。

3.3 RNAi在腦缺血損傷中的應(yīng)用 Fas基因表達(dá)在細(xì)胞凋亡中起重要作用。包曉群等〔13〕通過建立體外神經(jīng)細(xì)胞缺血再灌注模型,用 RNAi技術(shù)對 Fas基因表達(dá)進(jìn)行抑制,發(fā)現(xiàn) Fas siRNA組較對照組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著下降。Bax是B細(xì)胞淋巴瘤家族基因-2(Bcl-2)的異源二聚體,有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。葉西就等〔14〕通過 Bax-siRNA抑制了大鼠 Bax mRNA的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制了細(xì)胞凋亡,減輕了腦缺血再灌注損傷。而 Zheng等〔15〕則在研究大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型時(shí)發(fā)現(xiàn),運(yùn)用 RNA干擾技術(shù)沉默 Beclin 1基因的表達(dá),可以減少缺血再灌注導(dǎo)致的腦梗死面積及細(xì)胞凋亡。

3.4 RNAi在肝缺血損傷中的應(yīng)用 劉璐等〔16〕發(fā)現(xiàn),對小鼠注射 Fas分子的siRNA后,可以抑制肝臟缺血再灌注后肝細(xì)胞Fas分子的表達(dá),從而阻斷由 Fas介導(dǎo)的肝細(xì)胞的凋亡,達(dá)到對肝臟細(xì)胞的保護(hù)作用。白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶-4(Inteleukin 1 receptorassociated kinase-4,IRAK-4)是造成再灌注期移植肝臟內(nèi) kupffer細(xì)胞(kupffer cells,KCs)過度激活信號通路的最關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,而KCs細(xì)胞的激活又是誘發(fā) I/RI重要原因之一。因此,劉作金等〔17〕以 IRAK-4為靶點(diǎn)阻斷其胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),發(fā)現(xiàn)shRNAs轉(zhuǎn)染途徑能有效減輕大鼠肝移植時(shí) I/RI。同樣是研究肝移植 I/RI過程,Schneider等〔18〕發(fā)現(xiàn),運(yùn)用 RNA干擾技術(shù)沉默脯氨酰羥化酶1(prolyl hydroxylaseenzyme 1,PHD1)可以保護(hù)肝組織,減少小鼠肝組織 I/RI。

4 小結(jié)

RNAi是科學(xué)研究的大熱點(diǎn),近幾年來該技術(shù)在抗病毒、抗腫瘤及臨床相關(guān)疾病(如哮喘、濕性老年斑病變、慢性阻塞性肺疾病等)的治療領(lǐng)域中已經(jīng)取得了較大進(jìn)展,但是該技術(shù)目前在缺血損傷方面的應(yīng)用還停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段,相信隨著研究的不斷深入,RNAi啟動(dòng)的特異基因序列沉默將為人類各臟器缺血損傷治療提供基因治療的新方法。

1 Fire A,Xu S,Montgomery MK,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans〔J〕.Nature,1998;391(6669):806-11.

2 Guo S,Kemphues KJ.Par-1,a generequired for establishing polarity in C elegans embyos,encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed〔J〕.Cell,1995;81(4):611-20.

3 Elbashir SM,Harborth J,Lendeckel W,et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells〔J〕.Nature,2001;411(6836):494-8.

4 Brummelkamp TR,Bernards R,Agami R.A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells〔J〕.Science,2002;296(5567):550-3.

5 Gilmore IR,Fox SP,Hollina AJ,et al.Delivery strategies for siRNA-mediated gene silencing〔J〕.Curr Drug Deliv,2006;3(2):147-51.

6 Hannon GJ.RNA interference〔J〕.Nature,2002;418(6894):244-51.

7 Huang M,Chan DA,Jia F,et al.Short hairpin RNA interference therapy for ischemic heart disease〔J〕.Circulation,2008;118:226-33.

8 宋慧文.PTP-1B小干擾 RNA對缺氧/復(fù)氧誘發(fā)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響〔J〕.華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2008;37(6):753-6.

9 Lisovyy OO,Dosenko VE,Nagibin VS,et al.Cardioprotective effect of 5-lipoxygenase gene(ALOX5)silencing in ischemia-reperfusion〔J〕.Acta Biochim Pol,2009;56(4):687-94.

10 Zheng X,Feng B,Chen G.Preventing renal ischemia-reperfusion injury using small interfering RNA by targeting complement 3 gene〔J〕.Am J Transplant,2006;6(9):2099-108.

11 Zheng X,Zhang X,Sun H,et al.Protection of renal ischemia injury using combination gene silencing of complement 3 and caspase 3 genes〔J〕.Transplantation,2006;82(12):1781-6.

12 Rusai K,Prokai A,Szebeni B,et al.Role of serum and glucocorticoidregulated kinase-1 in theprotective effects of erythropoietin during renal ischemia/reperfusion injury〔J〕.Biochemical Pharmacology,2010;79(8):1173-81.

13 包曉群,宋冬晶,陳加俊,等 .針對 Fas RNA抑制對缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2006;26(11):1524-5.

14 葉西就 .BoiRNA預(yù)先給藥對大鼠腦缺血再灌注損傷的作用〔J〕.中華麻醉學(xué)雜志,2006;26(9):853-5.

15 Zheng YQ,Liu JX,Li XZ,et al.RNA interference-mediated downregulation of Beclin1 attenuates cerebral ischemic injury in rats〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2009;30(7):919-27.

16 劉 璐,王 掉,賴東明,等 .RNA干擾技術(shù)對小鼠肝臟缺血再灌注中肝細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制〔J〕.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2004;21(11):1398.

17 劉作金,李生偉,李旭宏,等 .阻斷內(nèi)毒素胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對大鼠移植肝臟再灌注損傷的影響〔J〕.四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2006;37(5):679-82.

18 Schneider M,Van Geyte K,Fraisl P,et al.Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury〔J〕.Gastroenterology,2010;138(3):1143-54.