韓光宇 任思坡 拾 莉 譚 昆 耿躍春 楊欽湘 王 健

(徐州市醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所,江蘇 徐州 221006)

直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率僅次于胃癌和食道癌,是大腸癌的最常見部位。直腸癌的治療通常采用直腸系膜的整體切除結(jié)合放射治療,但是復(fù)發(fā)率高,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來隨著腫瘤免疫學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展,以樹突細(xì)胞(DC)為基礎(chǔ)的抗腫瘤免疫治療成為當(dāng)前直腸癌治療研究的熱點(diǎn)〔1〕。DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(APC),是啟動、調(diào)控、維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié),在誘導(dǎo)特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫中起著關(guān)鍵作用。本研究通過對直腸癌患者外周血單核細(xì)胞通過加入多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)為成熟DC,為直腸癌的生物免疫治療提供臨床基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 淋巴細(xì)胞分離液(天津川頁公司),RPMI1640培養(yǎng)基(美國 Gibco公司),胎牛血清(FBS,天津?yàn)蠊?,重組人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF,廈門特寶公司),重組人白細(xì)胞介素-4(rhIL-4),腫瘤壞死因子α(TNF-α,上海欣百諾公司),流式細(xì)胞儀(美國 Becton Dickinson公司),CS-3000血細(xì)胞分離機(jī)(美國百特公司),CO2培養(yǎng)箱(美國SHELLAB)。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣本 通過CS-3000血細(xì)胞分離機(jī)采集直腸癌患者3 000 ml循環(huán)量的外周血單核細(xì)胞懸液約 60ml左右。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 取收集的單核細(xì)胞懸液用含 15 U/ml肝素的生理鹽水稀釋,2 500r/min離心15 min,去上清,沉淀用生理鹽水1∶6稀釋,200目篩網(wǎng)過濾,將稀釋液小心平鋪到淋巴細(xì)胞分離液上層。2 000 r/min離心 20 min,吸取單核細(xì)胞層,生理鹽水洗滌 3次,去上清,以 RPMI1640培養(yǎng)基重懸,200目篩網(wǎng)過濾,平分至 6個(gè) 75 cm2的培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中貼壁 30 min,輕輕晃動培養(yǎng)瓶,吸除懸浮細(xì)胞,生理鹽水輕輕洗滌1次,加入含 GM-CSF 1 000 U/ml、IL-4 500 U/ml、10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基 25 ml,繼續(xù)培養(yǎng),并記為第 0天,第 4天 2/3量換液,補(bǔ)足 GM-CSF、IL-4,并加入 TNF-α500 U/ml,誘導(dǎo) DC成熟,以后每隔 3 d 2/3量換液,補(bǔ)足細(xì)胞因子。培養(yǎng)至第 11天,用細(xì)胞刮刀輕輕刮下貼壁細(xì)胞,生理鹽水 1 000 r/min離心10 min,洗滌 3次,取 1×105～2×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表型檢測。

2 結(jié) 果

2.1 倒置生物顯微鏡對DC生長情況進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察 剛加培養(yǎng)基時(shí)細(xì)胞圓形,顏色較暗,均貼壁,單個(gè)散在密布于瓶底。培養(yǎng) 2～3d后,細(xì)胞出現(xiàn)變形,有少量梭形細(xì)胞出現(xiàn),并有部分細(xì)胞懸浮,貼壁細(xì)胞有聚集成團(tuán)現(xiàn)象。加入TNF-α后,細(xì)胞變形速度加快,細(xì)胞體積明顯變大,顏色變亮。絕大多數(shù)細(xì)胞核增大,細(xì)胞膜膨隆,伸出偽足,具有典型樹突狀形態(tài),低倍鏡下觀察細(xì)胞相互交織成網(wǎng)狀。用細(xì)胞刮刀刮過后,可見一層灰白膜狀物質(zhì)被刮下,鏡下觀察細(xì)胞偽足消失,細(xì)胞體積大,呈圓形。

2.2 細(xì)胞表型檢測 培養(yǎng)第 11天,每個(gè)培養(yǎng)瓶可收集1×107～1.5×107個(gè) DC,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測表達(dá)(52.9±5.8)%,(79.2±8.1)%,人類白細(xì)胞抗原 DR位點(diǎn)(HLADR)(65.8±5.7)%,CD1a(51.3±6.4)%,的陽性表達(dá)率較低,其表達(dá)率為(4.72±2.16)%,表明外周血單核細(xì)胞可以誘導(dǎo)為成熟 DC細(xì)胞。

3 討 論

DC是美國學(xué)者Steiman于 1973年所發(fā)現(xiàn),因其成熟細(xì)胞具有許多樹突樣或偽足樣突起而得名〔2〕。研究發(fā)現(xiàn),DC是功能最強(qiáng)的 APC,作為機(jī)體免疫應(yīng)答的啟動者,在免疫系統(tǒng)中占有獨(dú)特的地位,對腫瘤免疫的產(chǎn)生及調(diào)控具有重要作用。DC主要有兩個(gè)生物學(xué)亞群〔3,4〕,即髓樣 DC和淋巴樣 DC,其前體細(xì)胞由骨髓產(chǎn)生,進(jìn)入外周血分布到全身各組織,可分為未成熟和成熟兩種分化形態(tài)。未成熟 DC在光鏡下呈星形,其表面表達(dá)高水平的與抗原攝取有關(guān)的分子,如 FcγR、FcεR和甘露醇受體等,具有強(qiáng)大的捕獲、加工、處理抗原的能力。隨著 DC在組織間遷移并分化成熟,逐漸向周圍淋巴器官歸巢,形態(tài)由星形轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則的樹突狀,高表達(dá)組織相溶性復(fù)合物(MHC)-Ⅰ 、Ⅱ類分子、共刺激分子、黏附分子等,同時(shí)攝取、處理、完整蛋白抗原的能力下調(diào),并獲得遞呈抗原及活化 T細(xì)胞的能力。

DC廣泛存在于全身各組織,但數(shù)量較少,僅占外周血單核細(xì)胞總數(shù)的 0.5%～1%,難以分離與純化,限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。近年來,隨著對DC研究的不斷深入,以外周血單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)為 DC的培養(yǎng)技術(shù)日益成熟,目前GM-CSF、IL-4及TNF-α的聯(lián)合應(yīng)用成為DC培養(yǎng)的基本方案。其中 GM-CSF可促進(jìn)髓系細(xì)胞發(fā)育,是生成和維持 DC發(fā)育和分化的最根本的細(xì)胞因子;IL-4可抑制粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,促進(jìn)單核細(xì)胞向 DC的轉(zhuǎn)化,并維持 DC成熟;TNF-α可阻止粒系的分化而刺激 DC的成熟并增強(qiáng)抗原遞呈能力〔4,5〕。體外通過單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的 DC與純化的體內(nèi)成熟 DC具有相同的抗原提呈功能,為腫瘤的免疫治療提供了臨床應(yīng)用基礎(chǔ)。

免疫反應(yīng)的產(chǎn)生首先由 APC捕獲抗原,加工處理后將抗原信息傳遞給 T、B細(xì)胞,從而引發(fā)一系列的免疫應(yīng)答。因此,APC是機(jī)體免疫反應(yīng)的首要環(huán)節(jié),能否進(jìn)行有效的抗原提呈關(guān)系到免疫激活和免疫耐受的誘導(dǎo)。DC的最大特點(diǎn)是能夠激活初始型 T細(xì)胞增殖并建立初級免疫應(yīng)答,在腫瘤免疫的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。近年來,隨著對 DC在腫瘤免疫研究中的不斷深入,以DC為基礎(chǔ)的腫瘤疫苗研究已在黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、腎癌等的研究中取得了令人鼓舞的結(jié)果,DC在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的應(yīng)用前景〔4〕。Timmerman等〔6〕應(yīng)用獨(dú)特型抗體刺激致敏的自體DC過繼回輸治療初發(fā)的非霍奇金 B淋巴瘤病人,病人均產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答,未見副作用。表明 DC疫苗已顯示良好的抗腫瘤效應(yīng)。

經(jīng)過研究者的不斷探索,以DC為疫苗治療直腸癌已經(jīng)取得了較為顯著的成果。Burgdorf等〔7〕用腫瘤細(xì)胞裂解物反復(fù)沖擊經(jīng)直腸癌患者的外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)的DC,制成 DC疫苗,在對 17例直腸癌患者的治療中病情穩(wěn)定率達(dá) 24%(4/17),且安全、無毒副反應(yīng)。本研究通過 CS-3000血細(xì)胞分離機(jī)分離外周血單核細(xì)胞,在 75 cm2培養(yǎng)瓶中每瓶可誘導(dǎo)出 1～1.5×107個(gè)樹突細(xì)胞可用于直腸癌的免疫治療。隨著研究的不斷深入,以DC為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療方法可能會成為直腸癌治療領(lǐng)域的一個(gè)新的發(fā)展方向。

1 李 響,劉朋飛,朱 磊,等.樹突細(xì)胞在直腸癌免疫治療中的研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志,2009;29(22):2988-90.

2 龔非力.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)〔M〕.北京:科學(xué)出版社,2003:117.

3 匡志鵬,梁安民.CIK細(xì)胞和 DC的免疫生物學(xué)特性及抗腫瘤研究進(jìn)展〔J〕.廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006;23(2):338-41.

4 俞志勇,陳 虎,馮 凱 .樹突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備及臨床應(yīng)用面臨的問題〔J〕.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2004;12(3):397-400.

5 陳寶安,李 曼,孫載陽 .樹突細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞對耐藥 K562細(xì)胞的體外殺傷作用〔J〕.中華血液學(xué)雜志,2005;26(6):355-8.

6 Timmerman JM,Czerwinski DK,Davis TA,et al.Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma:clinical and immuneresponses in 35 patients〔J〕.Blood,2002;99(5):1517-26.

7 Burgdorf SK,Fischer A,Myschetzky PS,et al.Clinical responses in patients with advanced colorectal cancer to a dendritic cell based vaccine〔J〕.Oncol Rep,2008;20(6):1305-11.